肝素结合蛋白单克隆抗体制备及应用

[目的]制备抗肝素结合蛋白(HBP)单克隆抗体,并应用抗体构建HBP磁微粒化学发光(CLIA)检测方法.[方法]采用细胞融合技术制备抗体、间接ELISA法测定效价、SDS-PAGE测定抗体纯度、分子互作仪测定亲和力,通过分子互作仪筛选抗体配对,建立磁微粒化学发光检测方法,并对其灵敏度、特异性等分析性能进行评估.[结果]...     

抗hAFP单克隆抗体的制备

人甲种胎儿蛋白(hAFP)是一种重要的分化抗原和肿瘤相关抗原,是癌肿早期诊断和胎儿产前诊断中的一个重要标志物。本文应用 B 淋巴细胞杂交瘤技术,将为 hAFP免疫的 BALB/C 小鼠脾细胞与 SP2/O 骨髓瘤细胞通过化学方式融合,从而筛选出稳定分泌抗 hAFP 单克隆抗体的二株杂交瘤细胞株。     

Tropic1808基因重组蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

目的：制备Tropic1808基因重组蛋白的单克隆抗体,并对其生物学特性进行鉴定。方法：用Tropic1808基因重组蛋白作为抗原免疫BALB/C小鼠,取小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤（SP2/0）细胞融合,经ELISA筛选和有限稀释法获得分泌单克隆抗体的细胞株,Western Blot等方法对其生物学特性进行鉴定。结果：获得2株识别Tropic1808基因重组蛋白的单克隆抗体的细胞株Ⅱ4B、Ⅲ4C。WesternBlot法显示该抗体特异性地识别Tropic1808基因重组蛋白;ELISA法测定杂交瘤细胞培养上清及体内成瘤后产生的腹水的抗体效价分别为1：80、1：600;杂交瘤细胞染色体数平均为90-100;亚类鉴定单抗的重链为小鼠IgG1,轻链为κ型。结论：成功地制备了Tropic1808基因重组蛋白的单克隆抗体,为进一步研究Tropic1808基因重组蛋白的功能提供了良好的基础。     

1株猪δ冠状病毒N蛋白单克隆抗体制备与鉴定

【背景】猪δ冠状病毒(porcine deltacoronavirus,PDCoV)是一种新发现的猪肠道冠状病毒,主要引起以急性水样腹泻、呕吐和脱水等特征的胃肠道疾病。在PDCo V的4个结构蛋白中,核衣壳蛋白(nucleocapsid protein,N)为高度保守的结构蛋白,在病原诊断方面具有重要意义。【目的】以纯化的重组PDCo VN蛋白为抗原,制备抗N蛋白的单克隆抗体并进行特性鉴定。【方法】利用已构建的p ET-28a-N表达菌,经IPTG诱导表达获得具有免疫原性的重组N蛋白,并将纯化的重组N蛋白免疫BALB/c小鼠制备杂交瘤细胞,经3次亚克隆筛选,选取抗体效价最高的一株杂交瘤细胞注射小鼠腹腔并制备腹水单克隆抗体,利用Protein G亲和层析柱纯化。通过腹水单克隆抗体效价测定、抗体亚型鉴定、Western blot鉴定其特性;利用细胞间接免疫荧光试验、组织石蜡切片荧光试验、免疫组化、流式细胞荧光分选技术鉴定其诊断应用价值。【结果】经筛选后得到一株杂交瘤细胞命名为4E88,其腹水单克隆抗体效价为1:105,亚型为Ig G1型,轻链为κ链,Western blot试验表明该单克隆抗体与重组N蛋白和超速离心纯化的PDCo V全病毒反应形成特异性条带。此外,单克隆抗体4E88可以用于猪δ冠状病毒检测的间接免疫荧光试验、免疫组化染色和流式细胞荧光分选技术。【结论】研究获得的单克隆抗体4E88具有较好的反应性,为后续开展PDCo V鉴定、诊断和N蛋白功能研究等奠定基础。     

D-氨基酸氧化酶与麦芽糖结合蛋白和透明颤菌血红蛋白的融合表达

D-氨基酸氧化酶(DAAO)是一种重要的工业酶。为了进一步提高DAAO在大肠杆菌中的可溶性和活性表达, 分别构建了麦芽糖结合蛋白(MBP)和透明颤菌血红蛋白与三角酵母DAAO (TvDAAO) 的N-端融合蛋白。其中, MBP融合蛋白MBP-TvDAAO在组成型(JM105/pMKC-DAAO)和诱导型菌株(JM105/pMKL-DAAO)中表达时, 目标蛋白的可溶性表达量分别达到全细胞蛋白表达量的28%以上和17%左右, 比无MBP融合的对照菌株BL21(DE3)/pET-DAAO分别提高3.7和1.8倍; 但其酶活水平显著下降。VHb融合蛋白VHb-TvDAAO在重组菌BL21(DE3)/pET-VDAAO中摇瓶诱导表达时, DAAO酶活达到了3.24 u/mL, 比对照菌株BL21(DE3)/pET-DAAO提高了约90%。     

D-氨基酸氧化酶与麦芽糖结合蛋白和透明颤菌血红蛋白的融合表达

D-氨基酸氧化酶(DAAO)是一种重要的工业酶。为了进一步提高DAAO在大肠杆菌中的可溶性和活性表达, 分别构建了麦芽糖结合蛋白(MBP)和透明颤菌血红蛋白与三角酵母DAAO (TvDAAO) 的N-端融合蛋白。其中, MBP融合蛋白MBP-TvDAAO在组成型(JM105/pMKC-DAAO)和诱导型菌株(JM105/pMKL-DAAO)中表达时, 目标蛋白的可溶性表达量分别达到全细胞蛋白表达量的28%以上和17%左右, 比无MBP融合的对照菌株BL21(DE3)/pET-DAAO分别提高3.7和1.8倍; 但其酶活水平显著下降。VHb融合蛋白VHb-TvDAAO在重组菌BL21(DE3)/pET-VDAAO中摇瓶诱导表达时, DAAO酶活达到了3.24 u/mL, 比对照菌株BL21(DE3)/pET-DAAO提高了约90%。     

抗人血栓调节蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

为了制备特异性抗人血栓调节蛋白(human thrombomodulin,hTM)的单克隆抗体(monoclonal antibody,McAb),利用脂质体Lipofectamine 2000将包含hTM全长cDNA序列的重组表达质粒pThr402转染CHO细胞,经G418筛选及相关鉴定后获得高效稳定表达hTM的CHO-TM5细胞株。将CHO-TM5细胞直接免疫Balb/c小鼠,应用杂交瘤技术,通过细胞ELISA (cellular enzyme-linked immunoabsorbent assay,CELISA)筛选出阳性克隆后,将杂交瘤细胞株腹腔注射Balb/c小鼠诱生腹水。用CELISA、流式细胞术、免疫组织化学染色法及免疫印迹法对所获McAb的特异性进行鉴定。我们获得了1株可稳定分泌抗hTM的McAb的杂交瘤细胞株NH-1,其亚型为IgGl,McAb腹水效价为1×10~(-6),腹水抗体含量为20 mg/ml。NH-1对相应抗原具有较高的组织特异性,在体内与正常组织的交叉反应少,对人脐静脉内皮细胞、CHO-TM5有特异性结合反应,说明NH-1可特异性识别天然的hTM分子,为进一步应用此McAb进行hTM生物学功能及临床意义研究提供了基础。     

人心肌型脂肪酸结合蛋白单克隆抗体的制备及定量检测试剂盒的研制

目的：利用抗心肌型脂肪酸结合蛋白单抗,研制定量检测心肌型脂肪酸结合蛋白（ H-FABP ）的ELISA试剂盒。方法使用基因重组H-FABP免疫小鼠,以杂交瘤技术制备特异性抗H-FABP单抗,用这些单抗研制定量检测H-FABP的ELISA 试剂盒。结果筛选获得2株稳定分泌抗H-FABP单抗的杂交瘤细胞株,研制了定量检测H-FABP的ELISA试剂盒,灵敏度达到0．2 ng/mL,线性范围0．4～25 ng/mL,r2＝0．9967,回收率在97．2％～104．5％,精密度的变异系数（CV）≤6．72％;应用此试剂盒检测健康人血浆H-FABP,含量为1．87～8．50 ng/mL。结论所研制的ELISA试剂盒有较好的灵敏度及特异性,可用于人血浆中H-FABP含量的检测。     

青霉素结合蛋白2a单克隆抗体的研制和初步应用

目的研制青霉素结合蛋白2a(PBP2a)单克隆抗体(Mc Ab),为建立耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)免疫层析检测方法提供检测用抗体。方法以基因工程抗原r PBP2a免疫BALb/c小鼠,通过常规小鼠B淋巴细胞杂交瘤技术制备单克隆抗体,采用免疫印迹技术(Western blotting)分析单克隆抗体特异性。选取敏感、特异的单克隆抗体进行金标记和硝酸纤维膜包被,建立胶体金免疫层析检测方法。结果共获得11株分泌抗r PBP2a的杂交瘤细胞,其中6株分泌的单克隆抗体能够与天然PBP2a呈阳性反应。用其中2株单克隆抗体建立的PBP2a胶体金免疫层析方法,可在5~20 min内完成检测。结论获得了特异性针对PBP2a蛋白的单克隆抗体,并初步建立了检测PBP2a蛋白的胶体金免疫层析检测方法,为临床快速、简便检测产生PBP2a的细菌提供了检测方法。     

黑鲷转铁蛋白基因的分子特征研究

目的:克隆黑鲷转铁蛋白全基因并分析其分子特征。方法:采用同源克隆的方法,对黑鲷转铁蛋白全基因编码序列进行克隆,在cDNA获得了部分转铁蛋白基因的同源片段。经RACE PCR方法,分别对该基因的3’和5’末端进行扩增,获得的扩增片段经拼接后得到全基因片段。结果:黑鲷转铁蛋白全长2431bp,可编码691个氨基酸,分子量(MW)约为74.3kDa,等电点(PI)为5.63。它与鱼类转铁蛋白的同源性最高,约为65%-89%;与其它动物(哺乳类、两栖类等)也有一定的相识性。进化分析表明黑鲷转铁蛋白与其它鱼类和哺乳类的转铁蛋白是由早期转铁蛋白共同的祖先进化来的。结论:黑鲷转铁蛋白主要在肝脏中成组成型表达,在大脑等器官中也有少量表达。该基因的表达受病原刺激的影响,表现为经病原刺激后转铁蛋白基因的组织分布显著增多。     

文昌鱼分类学研究及展望

文昌鱼是最接近脊椎动物直接祖先的现生动物,在脊椎动物起源与演化研究中占有极其重要的位置。近年来,对文昌鱼的研究已引起越来越多的科学家的兴趣,然而作为生命科学研究的重要基础,这类动物的分类学研究相对滞后。依据已有的中国文昌鱼资源调查资料,中国沿海文昌鱼的分布应当十分广泛,即只要有适合文昌鱼栖息的沙滩,均有文昌鱼分布的可能。根据目前的分类学研究成果和动物命名法中的优先权原则,建议将产于青岛等地的文昌鱼种名Brnachiostoma belcheri tsingtauense订正为B.japonicus,南方的文昌鱼保留其原种名B.belcheri。由此,目前分布在中国沿海的鳃口文昌鱼属(Branchiostoma)至少有2种,侧殖文昌鱼属(Epigonichthys)有1～3种,漂浮文昌鱼(Amphioxides pelagicus)1种。DNA分子标记技术在文昌鱼分类学研究中将会发挥更大的作用。     

Molecular Cloning and Characterization of Transferrin from Wax Moth, Galleria mellonella

Complete mRNA sequence of transferrin from Galleria mellonella was obtained, and compared with those of other species. Until now, two types of insect transferrin were reported. Transferrins in cockroach and termite have two iron binding sites while those in most other insect groups, studied for the protein, have only one. It was suggested that the presence of two types of transferrin was related with transferrin evolution, because vertebrate transferrins have two iron binding sites, called N and C terminal lobe. It was shown that G. mellonella transferrin also has only one iron binding site (N terminal lobe), and the deduced amino acid sequence was most similar to those of Manduca sexta and Bombyx mori.     

Molecular Evolution of the Transferrin Receptor/Glutamate Carboxypeptidase II Family

The transferrin receptor family is represented by at least seven different homologous proteins in primates. Transferrin receptor (TfR1) is a type II membrane glycoprotein that, as a cell surface homodimer, binds iron-loaded transferrin as part of the process of iron transfer and uptake. Other family members include transferrin receptor 2 (TfR2), glutamate carboxypeptidase II (GCP2 or PSMA), N-acetylated α-linked acidic dipeptidase-like protein (NLDL), N-acetylated α-linked acidic dipeptidase 2 (NAALAD2), and prostate-specific membrane antigen-like protein (PMSAL/GCPIII). We compared 86 different sequences from 24 different species, from mammals to fungi. Through this comparison, we have identified several highly conserved residues specific to each family not previously associated with clinical mutations. The evolutionary history of the TfR/GCP2 family shows repeated episodes of duplications consistent with recent theories that nondispensable, slowly evolving genes are more likely to form multiple gene families. [Reviewing Editor: Dr. Gail Simmons]     

登革病毒的分子进化和流行趋势

登革热是一种最流行的蚊媒传播传染病 ,近二十年来其流行呈上升趋势 ,本文从现代分子生物学和分子进化角度 ,对登革热的流行趋势进行综述。     

The Molecular Evolution of the Vertebrate Trypsinogens

We expand the already large number of known trypsinogen nucleotide and amino acid sequences by presenting additional trypsinogen sequences from the tunicate (Boltenia villosa), the lamprey (Petromyzon marinus), the pufferfish (Fugu rubripes), and the frog (Xenopus laevis). The current array of known trypsinogen sequences now spans the entire vertebrate phylogeny. Phylogenetic analysis is made difficult by the presence of multiple isozymes within species and rates of evolution that vary highly between both species and isozymes. We nevertheless present a Fitch-Margoliash phylogeny constructed from pairwise distances. We employ this phylogeny as a vehicle for speculation on the evolution of the trypsinogen gene family as well as the general modes of evolution of multigene families. Unique attributes of the lamprey and tunicate trypsinogens are noted. Received: 12 July 1997     

Myostatin三维结构模建及分子进化分析

Myostatin(MST)为肌肉生长负调节因子,其功能受抑制可导致肌肉量增加.对MST核酸序列进行序列比对,构建进化树;采用同源模建方法首次模建MST成熟肽生物活性二聚体的四级结构,并预测MST与其受体ActRIIB的相互作用模式.进化树将肌肉生长抑制素基因(MSTN)分成4个亚家族:哺乳动物MSTN,鸟类MSTN以及鱼类MSTN 1和2.MST受纯化选择作用,在不同物种的直系同源基因具有较高的刚源性,其中哺乳动物、鸟类MST C端活性肽氨基酸序列高度保守.表明哺乳动物、鸟类MST的结构、功能类似,且信号传导路径可能一致;而鱼类MST的调控机制可能存在较大差异.MST结构及其表面静电势和疏水氨基酸分布表明静电力和疏水相互作用在MST与其受体结合过程中可能起到十分重要的作用.     

miR-34基因家族的分子进化

根据miRNA基因在进化中高度保守的特点,利用生物信息学方法在目前已测序的动物物种中搜寻参与哺乳动物早期发育调控的mir-34基因的同源序列,在33个不同的动物物种中获得了miR-34基因的54条同源序列,其中18条为新发现的序列。表明miR-34是高度保守的,广泛存在于后生动物中。目前发现的mir-34基因80%位于基因间隔区,少数位于蛋白编码基因的内含子区和3′UTR上。不同动物中,mir-34基因成熟序列的同源性为68%,前体序列为38.89%。在无脊椎动物中只有一个mir-34,而在几乎所有的脊椎动物中都有mir-34a,mir-34b,mir-34c,形成miR-34基因家族。系统进化分析表明,脊椎动物中miR-34基因家族是通过基因的串联和局部重复形成的,这个过程中伴随着个别碱基的变异。