DNA拓扑异构酶Ⅱ与ⅠA的进化分析

DNA拓扑异构酶与断开DNA链和改变其拓扑结构有关。先前的研究认为,拓扑异构酶TypeⅡB是由TypeⅡA通过基因的复制、重组和缺失所造成。然而,本研究结果则显示,TypeⅠA与TypeⅡB的进化关系较近,而TypeⅡA与TypeⅡB的关系较远。因此,TypeⅡB可能是由TypeⅠA演化而来,或者说,TypeⅡB是TypeⅠA在古细菌中的特化形式;TypeⅡB可能是由TypeⅡA通过形成TypeⅠA后演化而成的,而不是由TypeⅡA直接通过基因的复制、重组和缺失所造成。在由TypeⅡA演化成为TypeⅠA,最后演化为TypeⅡB的过程中,DNA拓扑异构酶的催化机制也发生了变化从需要金属离子的协助,演化到了不需要镁离子的存在协助其催化。     

拓扑异构酶Ⅱ的结构、功能及作用机制研究进展北大核心CSCD

拓扑异构酶是存在于细胞核内的一类酶,它们能够催化DNA链的断裂和结合,从而调控DNA的拓扑状态,在基因复制、转录、重组、修复和染色体重塑过程中参与了DNA超螺旋结构模板的调节。拓扑异构酶通过催化切断DNA链的磷酸二酯键,产生DNA缺口而发挥作用,这种缺口可以改变DNA分子的拓扑结构,从而解决DNA缠结状态这一问题。在哺乳动物中,主要存在I型和II型两种拓扑异构酶。拓扑异构酶I(type I topoisomerase,Top1)催化产生DNA分子上的单链缺口,而拓扑异构酶II(type II topoisomerase,Top2)则催化产生DNA分子上的双链缺口。Top2在哺乳动物中又分为α亚型和β亚型。其中,Top2α的功能主要与细胞的增殖和多潜能性相关,而Top2β在神经发育中具有重要作用。本文就Top2的结构、功能和作用机制的相关研究进展作一综述。     

拓扑异构酶Ⅱ的结构、功能及作用机制研究进展

拓扑异构酶是存在于细胞核内的一类酶,它们能够催化DNA链的断裂和结合,从而调控DNA的拓扑状态,在基因复制、转录、重组、修复和染色体重塑过程中参与了DNA超螺旋结构模板的调节。拓扑异构酶通过催化切断DNA链的磷酸二酯键,产生DNA缺口而发挥作用,这种缺口可以改变DNA分子的拓扑结构,从而解决DNA缠结状态这一问题。在哺乳动物中,主要存在I型和II型两种拓扑异构酶。拓扑异构酶I(type I topoisomerase,Top1)催化产生DNA分子上的单链缺口,而拓扑异构酶II(type II topoisomerase,Top2)则催化产生DNA分子上的双链缺口。Top2在哺乳动物中又分为α亚型和β亚型。其中,Top2α的功能主要与细胞的增殖和多潜能性相关,而Top2β在神经发育中具有重要作用。本文就Top2的结构、功能和作用机制的相关研究进展作一综述。     

蛋白质与核酸的相互作用

(一)复制、转录和翻译水平上蛋白质与核酸的相互作用蛋白质和核酸是组成生物体的两大重要物质。蛋白质是基因表达的产物,基因的表达离不开蛋白质。它们相互依存,彼此制约。蛋白质与核酸的相互作用存在于生物体内基因表达的各个水平之中。在DNA复制过程中,链的引发、延伸、终止所涉及的反应都由相应的酶催化,还需要许多具有调节功能的蛋白质对DNA复制进行调节。在大肠杆菌中,复制过程就需要三十多种蛋白质的协同作用。研究DNA聚合酶、拓扑异构酶、解链酶、解旋酶、连结酶等与复制有关的     

嗜热四膜虫SPO11基因缺陷型细胞株的基因表达变化分析

有性生殖的关键过程是通过减数分裂产生生殖细胞,而减数分裂的一个重要环节是进行基于DNA双链断裂的同源染色体重组。在同源染色体重组过程中,SPO11蛋白催化产生DNA双链断裂,从而起始同源染色体的重组。因此,研究SPO11基因缺失在减数分裂过程中所引起的基因表达变化有助于在转录组水平上了解该基因的作用。本研究通过对嗜热四膜虫(Tetrahymena thermophila)野生型和SPO11敲除细胞株在接合生殖时期2 h、3 h、4 h、5 h四个时间点的转录组进行高通量测序。通过差异表达基因分析和功能富集分析,发现SPO11基因敲除之后嗜热四膜虫在接合生殖时期2 h时,与DNA代谢过程和DNA复制相关基因的表达发生变化,推测SPO11基因敲除导致的减数分裂过程异常可能与DNA代谢过程和DNA复制相关。     

新生霉素抑制拓扑异构酶Ⅱ对多瘤病毒DNA合成的影响

本文报告了Ⅱ型拓扑异构酶抑制剂——新生霉素对多瘤病毒DNA合成的抑制作用,发现新生霉素对细胞和病毒DNA的体外合成具有不同的抑制曲线。新生霉素在复制过程中抑制复制中间物转变成成熟的病毒DNA分子的过程,同时影响病毒DNA分子的负超螺旋密度。本文结果提示Ⅱ型拓扑异构酶是病毒DNA复制末期所必须的酶。     

细菌对喹诺酮类抗菌药的分子耐药机制

喹诺酮类是目前临床上应用较多的抗菌药。然而,喹诺酮类耐药菌时有出现。就细菌对喹诺酮类抗菌药主要耐药机制从分子水平作一综述。(1)一般认为,喹诺酮类抗菌药通过结合细菌Ⅱ类拓扑异构酶,干扰细菌复制,而发挥抑菌作用。Ⅱ类拓扑异构酶变异时,细菌可逃脱喹诺酮类的抑菌作用。高水平的耐药由DNA回旋酶和拓扑异构酶Ⅳ同时发生变异造成。(2)细菌细胞壁是抗菌药进入的屏障。细胞壁组分脂多糖和孔蛋白的改变,可减少喹诺酮类的通透。(3)有些细菌可利用“外排泵”主动将喹诺酮类排出,降低喹诺酮类在菌体内的积累浓度。(4)细菌的其他一些代谢因素也可影响喹诺酮类的抑菌作用。     

乙型肝炎病毒变异与肝细胞癌发生关系

乙型肝炎病毒（hepatitisBvirus,HBV）基因组复制时,以病毒前基因组RNA作为模板合成子代病毒DNA,催化该过程的逆转录酶缺乏校对功能,所以HBV易出现变异。近年来,各国学者通过比较肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）患者和非HCC患者的HBV基因序列,发现HBV基本核心启动子区的A1762T／G1764A变异或T1753V变异、增强子Ⅰ区的G1053A或G1229A变异、前S蛋白的F141L变异、前s2区基因缺失变异和x基因的截短变异,分别是HCC的易患因素,而前c区常见的G1896A变异,与HCC的发生无关。增强子Ⅱ区的C1653T变异在c基因HBV感染中可能与发生HCC有关,而在A基因型可能无关。     

DNA拓扑异构酶Ⅱ的多态转换模型

DNA拓扑异构酶Ⅱ是一种分子马达,它利用ATP水解产生的化学能,切断一条双链DNA片段(G segment),并让另一条双链DNA片段(T segment)从缺口处通过.对DNA拓扑异构酶Ⅱ的工作循环研究将有助于阐明其工作机理.本文根据已有实验资料,利用主方程方法构建了DNA拓扑异构酶n状态转变的随机跃迁模型,求得系统...     

线粒体DNA聚合酶的起源研究

随着新的DNA聚合酶A家族成员的加入,家族内部的系统发育关系需要重新检查。分析显示：在真核生物演化的不同阶段,线粒体DNA聚合酶基因可能通过水平基因转移方式起源于不同类群的生物。原始真核生物线粒体DNA聚合酶基因可能来源于细菌,植物线粒体DNA聚合酶基因可能从质粒获得,而真菌和动物线粒体DNA聚合酶基因可能起源于T3/T7相关噬菌体。     

专访DNA损伤修复领域青年学者——吴薇研究员

<正>基因组DNA是生物遗传信息的重要载体，维持其稳定性和准确性是一切生命活动的基础。除UV射线等外源性刺激之外，基因组DNA同时也持续受到多种内源性毒素攻击，导致大量DNA损伤的产生。根据DNA损伤是否为正常生命代谢活动所需的，内源性DNA损伤可分为：(1)程序性损伤，例如起始减数分裂同源重组所需的DNA双链断裂，适应性免疫中起始基因重排、高频突变、DNA重组等过程以产生抗体多样性的DNA损伤，拓扑异构酶(TOP1/TOP2)在缓解RNA转录和DNA复制引起的扭转应力时产生的损伤等；(2)非程序性损伤，例如DNA复制过程中产生的碱基错配，核苷酸的氧化、烷化、脱氨基化这些异常修饰等。若这些损伤没有被及时、准确地修复，则可能造成致病突变的累积乃至癌症等疾病的发生。本期我们有幸采访到DNA损伤修复领域青年专家吴薇研究员，为我们分享她的科研经历以及对DNA损伤修复研究领域的分析。     

蓖麻蚕rDNA核骨架结合元件SAR的检测和特征分析

采用二碘水杨酸锂盐 (LIS)制备细胞核骨架 ,Southern杂交法检测与细胞核骨架结合的rDNA片段 ,发现蓖麻蚕rRNA基因 5′非转录间隔区 (NTS)内存在一个很强的核骨架结合元件 .外切核酸酶Ⅲ消化限定表明 ,该SAR位于SacⅡ -EcoRⅠ限制酶片段内 ,长度约 1kb .经DNA顺序分析表明 ,该片段AT碱基富集 ,A +T >70 % ,含有拓扑异构酶Ⅱ保守序列和ATATTT结构花式 ,以及酵母自主复制序列(ARS)的同源序列 ,该SAR内含有 (AT) ₁₈序列已证明是核酸酶S1的超敏感位点 ,这种核酸酶S1的超敏感性可能是SAR元件的信号特征之一 .     

核多角体病毒感染昆虫细胞的DNA拓扑异构酶性质的研究

核多角体病毒(Nuclear polyhedrosis virus)的核酸是双股环状DNA,在病毒颗粒中呈超螺旋状态。超螺旋DNA复制时,一般皆有超螺旋解旋过程。为了解这一机制,本文报道了从NPV感染的家蚕中肠组织中分离细胞核,经过羟基磷灰石、磷酸纤维素柱层析,ssDNA-纤维素亲和层析,纯化了DNA拓扑异构酶I,SDS-PAGE测定分子量为47kd,最适Mg~(++)浓度约为5mM。AcNPV感染的TN368细胞DNA拓扑异构酶I总活力较正常细胞酶活力高1～3倍,且活力的提高与病毒增殖平行。讨论了昆虫细胞DNA拓扑异构酶I的性质及其与NPV复制的关系。     

大肠杆菌topA－菌株中质粒pBR322的超凝集结构

超凝集DNA是质粒DNA的一种特殊拓扑结构形式，最初在大肠杆菌SD108 (topA⁺ gyrB225)细胞中被发现. 现在大肠杆菌DM800(topA^－ gyrB225)细胞中也发现了这种结构，这说明超凝集DNA的形成与细胞内旋转酶活性降低有直接关系，而与拓扑异构酶Ⅰ的存在与否无关. 体外实验的结果显示，具有很强的正超螺旋松弛活性的拓扑异构酶Ⅳ可以将超凝集DNA完全松弛，这也证明质粒DNA的超凝集结构与超螺旋结构在细胞内是可以互变的. 使用原子力显微镜对分离到的pBR322 DNA超凝集结构进行分析，并与普通超螺旋进行比较，结果表明，超凝集DNA分子的结构发生了巨大的变化，其分子长度比正常超螺旋分子缩短了约30%，宽度和高度则增加了60%，结构更接近于A型DNA. 另外，原子力显微镜研究结果表明，氯喹的嵌入并非改变了超凝集DNA的超螺旋状态，而是使其打结并最终压缩成一团.     

线粒体DNA聚合酶的起源与演化

随着新的DNA聚合酶A家族成员的加入,家族内部的系统发育关系需要重新检查,来自大肠杆菌DNA聚合酶I(DNA Pol I)和它的细菌、噬菌体和真核细胞同源物被用来重建这个家族的系统发育史.分析显示:在真核生物演化的不同阶段,线粒体DNA聚合酶基因可能通过水平基因转移方式起源于不同类群的生物.原始真核生物线粒体DNA聚合酶基因可能来源于细菌,植物线粒体DNA聚合酶基因可能从质粒获得,而真菌和动物线粒体DNA聚合酶基因可能起源于T3/T7相关噬菌体.     

人DNA 拓扑异构酶Ⅰ在毕赤酵母中的表达及发酵条件优化

为了在体外以人DNA拓扑异构酶Ⅰ(hTopoⅠ)为靶位进行抗肿瘤化合物的快速筛选,用RT-PCR法从Hela细胞中克隆了hTopoⅠ基因ORF并在毕赤酵母中首次成功表达,表达产物可分泌到发酵上清,易于制备。蛋白酶A缺陷的重组酵母(SMD-hTopoⅠ)分泌重组酶的能力比具有蛋白酶A活性的重组酵母(X33-hTopoⅠ和KM-hTopoⅠ)更高。通过发酵条件的优化,使用BMMY(pH7．25),于20℃,每隔24h补加0．5％(V/V)的甲醇和3％(V/V)的营养液,SMD-hTopoⅠ诱导72h后可表达最高的酶活力(43000u/mL),发酵上清中hTopoⅠ可达11mg/L,约占总蛋白的10％。SDS-PAGE和Westem blot分析显示,表达的hTopoⅠ为91kD蛋白,无糖基化修饰。     

一种钒配合物LMC 抑制DNA 拓扑异构酶?的抗肿瘤作用

目的：探讨钒配合物LMc对拓扑异构酶Ⅰ、Ⅱ（Topo-Ⅰ、Topo-Ⅱ）的影响及其抗肿瘤活性。方法：采用DNA松弛实验观察LMC对Topo-Ⅰ、活性的影响并探讨其相关分子作用机制;采用MTT法、流式细胞术在细胞水平观察了IMC的抗肿瘤作用。结果：LMC可明显抑制Topo-Ⅰ活性,对Topo-Ⅱ无明显抑制作用,对多种肿瘤细胞株A549、Hela、BEL-7402具有明显抑制生长的作用,且可将细胞阻断在G2／M期,而对正常细胞株L-02生长无明显影响。结论：钒配合物LMC具有抑制Topo-Ⅰ活性而发挥抗肿瘤的作用。     

被子植物DNA去甲基化酶基因的进化分析

DNA甲基化模式和水平取决于DNA甲基转移酶和去甲基化酶的作用,而DNA去甲基化酶在DNA主动去甲基化过程中起到关键作用。文章以已知的10个DNA去甲基化酶基因为参照,鉴定出两种单子叶植物(水稻和高粱)、两种双子叶植物(拟南芥和毛果杨)中所有的DNA去甲基化酶同源基因,其中新鉴定出两类DNA去甲基化酶类似基因DML4和DML5。基于保守的糖苷酶结构域序列的系统进化分析以及基因在染色体上的位置分析表明,植物中DNA去甲基化酶基因存在串联复制、染色体区段复制和全基因组复制而导致基因的新功能化和亚功能化。文章还进一步分析了DNA去甲基化酶基因在不同组织中的表达情况,旨在理解DNA去甲基化酶基因的功能与进化的关系,以期为DNA去甲基化酶基因在植物中的利用提供参考。     

丙型肝炎病毒NS5A基因在昆虫细胞中的表达及其分布研究

应用PCR方法从含有丙肝病毒全部非结构蛋白基因的质粒pBAC25中扩增出全长的NS5A基因DNA片段(约1.34kb),PCR扩增NS5A基因片段克隆到转移载体pBlueBacHisA中.重组转移质粒pBlueBacHis5A DNA与野生型杆状病毒(AcNPV)DNA共转染SF-9昆虫细胞,通过空斑纯化获得带有NS5A基因的重组病AcNS5A.对重组病毒基因组DNA进行酶切和PCR鉴定,证实HCV NS5A基因已插入重组病毒基因组中.AcNS5A感染SF-9细胞后,在细胞中表达出一条64kD的蛋白,用Western-blot分析,结果表明这种蛋白与抗HCV HS5A特异性抗体发生强烈反应,说明NS5A基因已在细胞中得到表达,应用免疫荧光技术与免疫组化技术进一步研究NS5A蛋白在昆虫细胞中不同时间的表达情况及其分布,结果表明,NS5A蛋白在AcNS5A重组病毒感染细胞24h后主要分布在细胞质膜上,而在48h后则同时分布于细胞质膜和细胞核内,在72h则完全布满整个细胞,我们认为NS5A蛋白定位于质膜和细胞核中,暗示着在病毒复制过程中NS5A蛋白可能参与病毒RNA在质膜上复制和细胞基因表达的调控.     

人DNA 拓扑异构酶Ⅰ在毕赤酵母中的表达及发酵条件优化

为了在体外以人DNA拓扑异构酶Ⅰ（hTopo Ⅰ）为靶位进行抗肿瘤化合物的快速筛选,用RT-PCR法从Hela细胞中克隆了hTopo Ⅰ基因ORF并在毕赤酵母中首次成功表达,表达产物可分泌到发酵上清,易于制备。蛋白酶A缺陷的重组酵母（SMD-hTopoI）分泌重组酶的能力比具有蛋白酶A活性的重组酵母（X33-hTopoI和KMhTopoI）更高。通过发酵条件的优化,使用BMMY（pH 7.25）,于20℃,每隔24h补加0.5% (V/V)的甲醇和3% (V/V)的营养液,SMD-hTopo Ⅰ诱导72h后可表达最高的酶活力（43000u/mL）,发酵上清中hTopo Ⅰ可达11 mg/L,约占总蛋白的10%。SDS-PAGE和Western blot分析显示,表达的hTopo Ⅰ为91kD蛋白,无糖基化修饰。