乳糖诱导的重组人血管内皮抑素(rhEndostatin)蛋白的表达

研究用乳糖替代IPTG作为诱导剂进行重组蛋白的表达,观察乳糖对乳糖操纵子调控的基因工程菌发酵及重组血管内皮抑素表达的影响,从而选取最佳诱导表达条件。以重组人血管内皮抑素表达工程菌pETrhEN/BL21(DE3)作为研究对象,分别用IPTG和乳糖作为诱导剂,在摇瓶中进行表达实验。并对重组蛋白质表达量进行分析。然后在5 L发酵罐中进行验证。在摇瓶培养条件下,乳糖浓度大于0.5 g/L即可以诱导目的蛋白的表达。乳糖浓度1 g/L时诱导目的蛋白表达量与1 mmol/L的IPTG相当,当乳糖浓度为10 g/L,目的蛋白表达量达到最大。在发酵罐培养条件下,补料4 h后葡萄糖浓度基本耗尽,此时开始加入乳糖。诱导后1 h,即有重组蛋白表达,在诱导后4 h达到高峰(占菌体可溶性蛋白的56%),与此同时,诱导后5 h菌体浓度也达到最高值。在以乳糖操纵子为调控手段的工程菌表达系统中,可以使用乳糖作为诱导剂,诱导应在葡萄糖消耗完后进行。     

乳糖诱导重组多价人精子表位肽在大肠杆菌中的表达

旨在研究用乳糖替代IPTG作为诱导剂进行重组多价人精子抗原表位肽的表达及诱导表达的优化条件.在摇瓶发酵条件下,通过改变培养基组成、诱导时机、诱导温度、诱导剂浓度、诱导时间和诱导方式等条件,利用SDS-PAGE电泳和AlphaEase凝胶电泳图像分析系统,研究以上条件改变对GST-重组多价人精子抗原表位肽融合蛋白表达量的影响,并与IPTG诱导结果相比较.结果显示,在摇瓶试验中,最优表达条件为选用TB培养基,在菌体对数生长的中期进行诱导,诱导温度37℃、乳糖诱导终浓度3 mmol/L、诱导时间6 h.GST-重组多价人精子抗原表位肽融合蛋白的表达量占菌体总蛋白的30.5％,且主要以可溶形式表达,与IPTG的诱导结果相同.分批流加乳糖和一次性加入乳糖诱导,效果一样.乳糖可以替代IPTG作为诱导剂诱导GST-重组多价人精子抗原表位肽融合蛋白的表达,优化条件下可获得与IPTG相同的诱导表达效果.     

基因重组大肠杆菌表达HrpNEcc蛋白的发酵条件及诱导条件优化

对已构建好的表达HrpNEcc蛋白的工程菌BL21(DE3)/pET30a(+)hrpN Ecc的摇瓶发酵条件及乳糖诱导进行优化, 通过在7L发酵罐中放大发酵实验,以期提高蛋白产量并降低生产成本。在摇瓶中优化的发酵及诱导条件是：5% 的接种量,TB培养基,菌体培养至对数生长前期,添加3g/L外源诱导剂乳糖时,HrpNEcc蛋白产量可达417.60mg/L,比不添加乳糖时提高了36.73%,比用IPTG诱导时提高了16.85%。7L发酵罐中发酵,获得菌体湿重达到57.24g/L（WCW）,可溶性HrpNEcc蛋白产量占细胞总蛋白的50.2%,为3.29 g/L。     

乳糖替代IPTG诱导脱色酶TpmD基因在大肠杆菌中的高效表达

本文考察了乳糖代替IPTG诱导三苯基甲烷类染料脱色酶TpmD在大肠杆菌BL21(DE3)中表达的可行性, 分别对用乳糖作为诱导剂时的诱导时机、乳糖浓度、诱导持续时间和添加方式进行优化并与IPTG诱导的差异等方面进行了比较分析, 确定了乳糖诱导的最佳条件。结果表明, 在工程菌对数生长中期(OD600约为0.8)添加终浓度为0.4 mmol/L的乳糖诱导6 h的条件下能获得最大量的目的蛋白和菌体量。由于乳糖可以作为碳源被菌体利用, 分批添加乳糖效果优于一次性添加。乳糖诱导条件下目的蛋白表达量占总蛋白的35.62%, 与IPTG诱导条件下的35.03%无明显差异。乳糖诱导后外源蛋白的表达时间有所滞后, 但收获的菌体量高于IPTG诱导, 显示出了乳糖同样是一种T7启动子的廉价高效诱导剂, 可以代替昂贵的IPTG用于脱色酶TpmD的规模化发酵, 同时也为其他重组蛋白的生产提供了有益的参考和借鉴。     

毕赤酵母高密度表达重组猪胰岛素前体的研究

对摇瓶和50L罐上的重组菌毕赤酵母(Pichia pastoris)表达猪胰岛素前体(PIP)的发酵过程进行了研究。摇瓶发酵中,最佳诱导周期为60 h左右,诱导期甲醇的最佳加入量为每日2．0%～2．5%。50L发酵过程分为批发酵、补料和诱导表达3个阶段。生长期(批发酵和补料阶段)细胞干重与培养时间的关系可用模型y= 0．6525e~(0．1909t)来描述。在批发酵阶段和补料阶段,流加的氨水和甘油几乎全部用来合成菌体和维持,没有其他副产物产生。诱导表达阶段流加的氨水和甲醇分别约有80%和70%被菌体利用。将摇瓶与发酵罐的实验结果进行了比较,发现摇瓶发酵的限制因子很可能是溶氧,而罐发酵的限制因子为碳源,因此,将摇瓶实验的结果放大到发酵罐时调整了控制策略,加大了甲醇的补料速率,最终PIP浓度达到1．72g/L。     

重组尿酸氧化酶发酵工艺优化

目的:优化并获得重组尿酸氧化酶(rUOX)基因工程大肠杆菌BL21(DE3)/pET-32a-uox高密度发酵的工艺参数。方法:在三角摇瓶中进行培养条件的优化实验,分别考察了pH值、接种量、无机盐、碳源、诱导强度等对工程菌生长和重组蛋白表达的影响,得到了优化的发酵条件;在此基础上放大至NBS BIOFLO 110 14 L发酵罐,通过对诱导时机的优化,利用分批补料发酵的方式,使rUOX在高密度培养的条件下得到高表达。结果:在优化的发酵条件下,菌体密度(D600nm)最终达到50以上,相当于20 g/L干重;可溶性rUOX占菌体总蛋白量的45%,其含量达到3.45 g/L。结论:为规模化制备重组黄曲霉尿酸氧化酶奠定了基础。     

重组大肠杆菌产尿素酶B高密度发酵条件的优化

探究重组大肠杆菌产尿素酶B（urease B subunit, UreB）的高密度发酵条件。通过实验室摇瓶和30 L发酵罐对UreB基因工程菌的发酵条件进行优化。结果表明：30 L发酵罐中以TB培养基为发酵培养基,接种量为5%,发酵温度为37 ℃,pH为6.8,溶氧量为30%左右,培养至2 h开始恒速流加50%甘油,4 h流加50%酵母提取物和50%胰蛋白胨,并加入终浓度为0.5 mmol/L的异丙基β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl β-D-thiogalactoside,IPTG),诱导表达4 h,结束发酵,所得菌体干物质约为25.7 g/L,UreB表达量为31.4%。此工艺可以提高UreB的产量。     

黄杆菌肝素酶Ⅱ重组菌培养条件的优化及高密度发酵

黄杆菌肝素酶Ⅱ(HepⅡ)是一类可特异性切割肝素、硫酸乙酰肝素类分子内连接键的酶。文中对黄杆菌肝素酶Ⅱ重组菌的诱导时机、诱导剂添加量、诱导温度、诱导时间等诱导产酶条件进行优化。经过优化最佳摇瓶发酵产酶条件为:37℃培养重组菌至对数生长前期,添加诱导剂IPTG至终浓度为0.3 g/L,20℃下诱导10 h,酶活达到最高,为570 U/L。在此基础上通过发酵罐高密度培养手段将菌体浓度OD600进一步提高到98,酶活大幅度提高到9 436 U/L,该研究结果为HepⅡ的工业化生产与应用奠定了良好的基础。     

表达重组咖啡豆α-半乳糖苷酶的酵母工程菌的高密度发酵

用5 L发酵罐优化了重组咖啡豆α-半乳糖苷酶酵母工程菌pPIC9K-Gal/GS115(本室构建)的高密度发酵工艺.通过对发酵条件的优化,包括甘油补充量及补充时机、甲醇诱导量及诱导时机、溶氧控制、诱导时间等,重组咖啡豆α-半乳糖苷酶在毕赤酵母中得到了高效表达.利用所确定的最适条件进行发酵,菌体密度最终达到368 g/L以上,每批发酵液离心后可获得3.5 L的发酵上清,上清中的蛋白含量达到3 g/L以上,目的蛋白占上清总蛋白的50%以上,含量约为1.5 g/L,上清中α-半乳糖苷酶的活性维持在80 U/ml左右.确立工艺后又进行了3次发酵试验,证明了工艺的可行性和稳定性.为重组咖啡豆α-半乳糖苷酶在B→O血型改造和酶解大豆低聚糖方面的应用奠定了基础.     

弧菌外膜蛋白ompk工程菌规模化培养表达初探

目的:为Ompk亚单位疫苗生产提供参数。方法:利用振荡和发酵培养,测定不同培养时间的菌液浊度和蛋白诱导表达效果。结果:工程菌30℃摇瓶培养10h,种子罐培养8～10h,较为合适;摇瓶和5L发酵罐诱导表达培养,升温42℃诱导表达,7h效果较佳;经5批次50L、500L发酵罐诱导表达培养,均可得到重组蛋白表达的工程菌体,50L和500L发酵罐最高生物量分别为5.32g/L和6.38g/L,平均可达到3.75 g/L和4.74 g/L;适当延迟升温诱导前的培养时间,可提高工程菌的得率。结论:初步确定了重组蛋白工程菌规模化诱导表达培养方法,利用500L发酵罐培养可得到诱导表达的工程菌体。     

乳糖作为诱导剂对重组目的蛋白表达的影响

将重组粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子/白细胞介素3(GM-CSF/IL-3)融合蛋白表达菌BL21(DE3)(pFu)作为研究对象,对于以乳糖作为诱导剂时重组目的产物的诱导表达规律进行了深入的研究。分析比较了不同培养基中,不同生长阶段进行诱导对于产物表达的影响。对诱导所需的乳糖浓度、诱导持续时间长短等因素亦进行了研究。实验结果表明,在对诱导条件进行优化控制的前提下,利用乳糖作为诱导剂可以达到与IPTG类似的诱导效果。随后的研究中,将乳糖作为诱导剂应用于高密度发酵过程。这些研究结果为乳糖作为诱导剂最终应用于重组基因工程药物的工业化生产提供了有益的参考和借鉴。     

Lactose Induction Increases Production of Recombinant Keratinocyte Growth Factor-2 in <Emphasis Type="Italic">Escherichia coli</Emphasis>

Recombinant human keratinocyte growth factor-2 (rhKGF-2) has previously been expressed in Escherichia coli using isopropyl-β-d-thiogalactopyranoside (IPTG), a non-metabolizable and expensive compound, as the inducer. In order to determine whether IPTG could be replaced with the cheap and natural lactose to induce rhKGF-2 expression, we examined the expression of rhKGF-2 in flask culture and 30-l fermentation using lactose as the inducer. The optimized fermentation induced with lactose resulted in 1,382 g of cell mass, corresponding to a 84% enhancement in cell mass compared with IPTG induction. While the expression level of rhKGF-2 induced with lactose was comparable to that induced with IPTG, the solubility of target protein was increased by lactose induction than by IPTG induction. The recombinant protein was further purified by cation exchange and heparin-affinity chromatography. 255 milligrams of pure rhKGF-2 was achieved per liter culture by lactose induction, 52% higher than that obtained by IPTG induction. A preliminary biochemical characterization of purified rhKGF-2 was performed by Western blotting and mitogenic activity analysis, and the results demonstrated that the purified lactose-induced rhKGF-2 could react with anti-human KGF-2 antibody and stimulate the proliferation of FGFR2-IIIb-transfected mouse BaF3 cells as IPTG-induced rhKGF-2 could do.     

乳糖诱导剂促进P450 BM-3在大肠杆菌中可溶性表达的研究

P450 BM-3是一种具有工业化应用潜力的单加氧酶,可催化饱和脂肪酸羟基化。为提高其在大肠杆菌宿主中的可溶性表达水平,采用乳糖作为诱导剂对P450 BM-3的诱导表达条件进行研究。结果发现：在大肠杆菌的OD600达到0.7~1.5时,添加2.0 g/L的乳糖、30℃诱导10 h可获得最佳诱导效果。与IP TG的诱导效果对比发现：采用乳糖作诱导剂时,菌体生物量提高1.09倍,目标蛋白量提升2.13倍,蛋白包涵体的比例则降低至10%。研究结果表明：乳糖可显著提升P450 BM-3在大肠杆菌中的重组表达水平,并且能够促进p450 BM-3的可溶性表达。     

毕赤氏酵母工程菌高密度发酵表达恶性疟原虫融合抗原的研究

疟疾目前仍是危害人类健康的主要传染病,现全球每年新增疟疾病例3～5亿人,其中约300万人死于该病.特别是病原虫抗药性的产生和扩散已给疟疾防治工作带来极大困难,因此研制新的预防措施已成为当务之急.研制有效的疟疾疫苗被认为是人类控制乃至消灭疟疾的重要途径,已越来越受到重视,并已构建和鉴定多个疫苗候选抗原[1,2].本研究进行高密度优化表达的融合抗原就是一个疫苗候选抗原.     

多表位恶性疟疾疫苗M.RCAg-1在大肠杆菌表达的条件优化和大规模培养

通过以培养基配方、IPTG浓度、金属离子复合液浓度、镁离子浓度、表达时间、接种量、诱导时间点等发酵的重要条件对重组蛋白表达量影响的研究,确定多表位恶性疟疾疫苗M.RCAg-1蛋白最佳表达条件为以改良TB培养基培养、最优Mg2+,诱导剂IPTG和金属离子复合液浓度分别为10mmol/L,0.5mmol/L,6μl/ml,接种量为10%,表达时间为4.5h,将优化后的参数用于50L发酵罐进行连续3批中试规模的发酵,最终收获菌体湿重平均为31.8±1.78g/L,目的蛋白表达量可占菌体总蛋白的50%左右,试验确定了恶性疟疾多表位随机组合蛋白M.RCAg-1在大肠杆菌中的最优表达条件,该条件能够适合大规模培养需要。     

argE基因在大肠杆菌中的表达优化

N-乙酰鸟氨酸脱酰基酶可在重组菌BL21（DE3）-pET22b-argE中表达。首先确定了该酶的细胞表达定位,再研究了诱导温度、诱导剂种类及浓度、诱导起始菌体密度、诱导时间等因素对重组菌生长及目的蛋白表达活性的影响。结果表明,IPTG和乳糖皆可诱导目的蛋白表达,乳糖的诱导效果优于IPTG。在诱导起始0D600为0．46时加入15g／L乳糖,20℃诱导18h最适于目的蛋白的活性表达。表达条件优化后,酶活从1．68U／mL提高至282．99U／mL,约为原来的168倍。     

鲨肝刺激物质类似物在大肠杆菌中的高密度发酵

为建立重组鲨肝刺激物类似物(r-sHSA)的高密度发酵方法,本研究在利用单因素实验和均匀设计实验优化摇瓶发酵培养基的组成和浓度以及诱导剂(IPTG)浓度的基础上,利用5L发酵罐进行了放大试验,探讨了补料方式、补料培养基的组成和浓度、诱导剂加入时间和诱导后菌体的收获时间对工程菌生物量和r-sHSA产量的影响。结果表明:在改良LB培养基(0.97%甘油,0.91%酵母粉,0.72%胰蛋白胨,0.782%KH2PO4,0.267%K2HPO4·3H2O,0.062%MgSO4·7H2O,0.5%NaCl,pH7.0)中,当pH控制在7.0、溶氧浓度为25%～30%的前提下,采用指数补料方式加入优化后的补料培养基(620g/L甘油,94.8g/L胰蛋白胨,3.3mL/L微量元素,7.5g/LMgSO4·7H2O)进行培养,在工程菌的OD600达到23时,加入终浓度为0.5mmol/L的IPTG诱导6h后收获菌体,菌体的生物量可达(123.27±1.184)g/L,r-sHSA产量为(2.662±0.041)g/L,比优化前提高了13.7倍。     

人三叶因子3在毕赤酵母中表达条件的研究

为提高人三叶因子 3 (HumanTrefoilfactor 3 ,hTFF3 )在毕赤酵母中的表达量 ,研究了转化子生长的培养条件 ,包括不同碳源对转化子生长的影响和接种量、甲醇浓度、pH值、摇瓶转速及不同诱导时间对人三叶因子 3表达的影响。结果表明转化子在生长阶段加入葡萄糖生长旺盛 ,培养 14h后OD₆₀₀ 就可达到 50。在 100mL生长培养基上的菌液以 1∶1接入诱导培养基时蛋白表达量最高 ;转化子在 1%的甲醇、pH60、摇瓶转速240r/min的条件下诱导4 8h ,菌体密度OD₆₀₀为 15 ,目的蛋白表达量达到 20mg L。用 5L发酵罐进行了高密度发酵 ,经2%甲醇32h诱导 ,最终菌体密度OD₆₀₀ 达到 120 ,每升发酵液中含目的蛋白100mg。