过量表达烟酸转磷酸核糖激酶对大肠杆菌NZN111产丁二酸的影响

大肠杆菌NZN111厌氧发酵的主要产物为丁二酸,是发酵生产丁二酸的潜力菌株。但是由于敲除了乳酸脱氢酶的编码基因 (ldhA) 和丙酮酸甲酸裂解酶的编码基因 (pflB),导致辅酶NADH/NAD+不平衡,厌氧条件下不能利用葡萄糖生长代谢。构建烟酸转磷酸核糖激酶的重组菌Escherichia coli NZN111/pTrc99a-pncB,在厌氧摇瓶发酵过程中通过添加0.5 mmol/L的烟酸、0.3 mmol/L的IPTG诱导后重组菌的烟酸转磷酸核糖激酶 (Nicotinic acid phosphor     

过量表达苹果酸脱氢酶对大肠杆菌NZN111产丁二酸的影响

大肠杆菌NZN111是敲除了乳酸脱氢酶的编码基因 (ldhA) 和丙酮酸-甲酸裂解酶的编码基因 (pflB) 的工程菌,厌氧条件下由于辅酶NAD(H) 的不平衡导致其丧失了代谢葡萄糖的能力。构建了苹果酸脱氢酶的重组菌大肠杆菌NZN111/pTrc99a-mdh,在厌氧摇瓶发酵过程中通过0.3 mmol/L的IPTG诱导后重组菌的苹果酸脱氢酶 (Malate dehydrogenase,MDH) 酶活较出发菌株提高了14.8倍,NADH/NAD+的比例从0.64下降到0.26,同时NAD+和NADH浓度分别     

共表达烟酸转磷酸核糖激酶和丙酮酸羧化酶对大肠杆菌NZN111产丁二酸的影响

构建了共表达烟酸转磷酸核糖激酶(NAPRTase)和丙酮酸羧化酶(PYC)的重组质粒pTrc99a-pncB-pyc,并考察了重组菌E.coli NZN111/pTrc99a-pncB-pyc生产丁二酸的能力。结果表明:重组菌NZN111/pTrc99a-pncB-pyc的NAPRTase和PYC的比酶活达到最高,分别为20.75和1.04 U/mg,同时,辅酶NADH、NAD+及NAD(H)总量达到最高。厌氧摇瓶发酵结果:48 h能够消耗17.5 g/L的葡萄糖生成14.08 g/L的丁二酸,而丙酮酸的产量大幅度降低,仅为0.11 g/L。本研究为基因工程菌大肠杆菌厌氧条件下发酵生产丁二酸提供了一定的基础。     

烟酸转磷酸核糖激酶和丙酮酸羧化酶共表达对大肠杆菌BA002产丁二酸的影响

大肠杆菌BA002是敲除了乳酸脱氢酶的编码基因 (ldhA) 和丙酮酸-甲酸裂解酶的编码基因 (pflB) 的工程菌。厌氧条件下NADH不能及时再生为NAD+,引起胞内辅酶NAD(H)的不平衡,最终导致厌氧条件下菌株不能利用葡萄糖生长代谢。pncB是烟酸转磷酸核糖激酶 (NAPRTase) 的编码基因,通过过量表达pncB基因能够提高NAD(H)总量与维持合适的NADH/NAD+,从而恢复了厌氧条件下重组菌E. coli BA014 (BA002/pTrc99a-pncB) 的生长和产丁二酸的性能。然而,BA014在厌氧发酵过程中有大量丙酮酸积累,为进一步提高菌株的丁二酸生产能力,减少副产物丙酮酸的生成,共表达NAPRTase和来自于乳酸乳球菌 NZ9000中丙酮酸羧化酶 (PYC) 的编码基因pyc,构建了重组菌E. coli BA016 (BA002/pTrc99a-pncB-pyc)。3 L发酵罐结果表明,BA016发酵112 h后,共消耗了35.00 g/L的葡萄糖。发酵结束时,菌体OD600为4.64,产生了25.09 g/L丁二酸。通过共表达pncB和pyc基因,使BA016的丙酮酸积累进一步降低,丁二酸产量进一步提高。     

基于辅因子调控对大肠杆菌两阶段发酵产丁二酸的影响

考察了E.coli NZN111及其重组菌株E.coli NZN111/pTrc99a-pncB发酵生产丁二酸的性能。E.coli NZN111两阶段发酵丁二酸的同时,会造成丙酮酸的大量积累。研究发现:通过过量表达烟酸转磷酸核糖激酶,两阶段发酵重组菌株E.coli NZN111/pTrc99a-pncB,减少丙酮酸的积累且无副产物乙酸生成,提高丁二酸的产量,丁二酸得率和耗糖速率分别提高了139%和20%。     

果糖和麦芽糖作为有氧碳源对大肠杆菌NZN111两阶段发酵中厌氧发酵的影响

为了了解磷酸转移酶转运系统 (PTS) 依赖和非PTS依赖代谢的糖类对大肠杆菌生产琥珀酸的影响,进行了两阶段培养,有氧阶段采用PTS依赖型的果糖或非PTS依赖型的麦芽糖作为丙酮酸甲酸裂解酶 (PFL) 和乳酸脱氢酶 (LDH) 双突变株NZN111的碳源,研究其对NZN111厌氧阶段代谢葡萄糖的影响。5 L罐发酵结果表明,以果糖和麦芽糖为碳源有氧培养的细胞恢复了在厌氧条件下快速代谢葡萄糖的能力,琥珀酸和丙酮酸成为主要代谢产物,最终琥珀酸得率分别为0.84和0.75 mol/mol,丙酮酸得率分别达到了0.65和0.83 mol/mol,琥珀酸和丙酮酸终浓度比分别为1.73∶1和1.21∶1。果糖和麦芽糖培养的NZN111与葡萄糖培养的菌体代谢的明显差异推测是cyclic AMP (cAMP) 依赖型和非cAMP依赖型的分解代谢物阻遏调控这两种机制共同作用的结果。     

碳源对重组大肠杆菌两阶段发酵产丁二酸的影响

研究了在好氧培养基中分别添加不同碳源对两阶段发酵菌体生长、酶活及代谢产物分布的影响,结果表明添加4mmol/L葡萄糖和12,54,80mmol/L乙酸钠均可以提高好氧阶段的菌体密度和相关酶活。将不同条件下培养的菌体转接厌氧发酵后,厌氧阶段的酶活和代谢产物分布也发生改变。进一步对酶活及代谢产物分析表明：Escherichia coli NZN111(sfcA)厌氧发酵过程中,磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶(PCK)是产丁二酸的关键酶,丙酮酸激酶(PYK)主要和副产物丙酮酸的积累有关,异柠檬酸裂解酶(ICL)对丁二酸产量也有一定影响。好氧培养基中添加80mmol/L乙酸钠,厌氧发酵结束时丁二酸的质量收率可达89.0%,相比对照提高了16.6%。     

乳糖诱导丙酮酸羧化酶基因在大肠杆菌中的表达及对丁二酸产量的影响

大肠杆菌DC1515是敲除葡萄糖磷酸转移酶(ptsG)、乳酸脱氢酶(ldhA)、丙酮酸甲酸裂解酶(pflA)基因的菌株,具有发酵生产丁二酸的潜力。为进一步提高菌株DC1515的丁二酸生产能力,将枯草芽孢杆菌丙酮酸羧化酶(pyc)基因转入其中。用乳糖代替IPTG诱导pyc表达,确定了最佳乳糖加入时间、乳糖浓度及诱导温度。在此基础上,考察了补加乳糖对丁二酸产量的影响。结果表明:由于ptsG基因缺失,当培养基中葡萄糖浓度达到15g/L时,乳糖诱导作用并不受葡萄糖抑制。优化诱导条件后,pyc过表达菌株的丁二酸产量达15.17g/L,为对照菌株的1.78倍。间歇补加乳糖2次至浓度为1g/L,丁二酸产量可进一步增至17.54g/L。研究结果为以葡萄糖为底物生产丁二酸的过程中乳糖诱导外源基因在大肠杆菌中的表达奠定了基础。乳糖诱导降低了成本,有利于实现丁二酸发酵生产的工业化。     

共表达磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶和烟酸转磷酸核糖激酶提高重组大肠杆菌发酵木糖产丁二酸

野生型E.coli K12能够在厌氧条件下代谢木糖生长,但是丁二酸不是其主要的代谢终产物。而在E.coli BA203(Δldh A,Δpfl B,Δppc)中,通过过量表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶(PCK),即E.coli BA204,使其能够在厌氧条件下利用木糖发酵生产丁二酸。为了进一步提高生物量及丁二酸的产量,通过过量表达烟酸转磷酸核糖激酶(NAPRTase)提高NAD(H)的生成,从而提高木糖代谢速率。因此采用2种方法构建了共表达烟酸转磷酸核糖激酶和磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶的基因工程菌,即E.coli BA208(BA203/p Trc99a-pnc B-pck)和E.coli BA209(BA203/p Trc99a-pck-trc-pnc B)。通过实验发现:厌氧发酵72 h,BA209消耗16.7 g/L木糖,生成15.8 g/L丁二酸,乙酸含量有所降低,而丙酮酸的量几乎不变。BA209中NAD(H)总量和ATP含量较BA208和BA204都有明显的提高。这为考察NAD(H)和ATP 2种辅因子对重组大肠杆菌利用木糖合成丁二酸的影响提供了研究平台。     

Crystal structure of nicotinic acid mononucleotide adenylyltransferase from Staphyloccocus aureus: structural basis for NaAD interaction in functional dimer

Bacterial nicotinic acid mononucleotide adenylyltransferase (NaMNAT; EC 2.7.7.18) encoded by the nadD gene, is essential for cell survival and is thus an attractive target for developing new antibacterial agents. The NaMNAT catalyzes the transfer of an adenylyl group of ATP to nicotinic acid mononucleotide (NaMN) to form nicotinic acid dinucleotide (NaAD). Two independently derived, high-resolution structures of Staphylococcus aureus NaMNAT-NaAD complexes establish the conserved features of the core dinucleotide-binding fold with other adenylyltransferases from bacteria to human despite a limited sequence conservation. The crystal structures reveal that the nicotinate carboxylates of NaAD are recognized by interaction with the main-chain amides of Thr85 and Tyr117, a positive helix dipole and two bridged-water molecules. Unlike other bacterial adenylyltransferases, where a partially conserved histidine residue interacts with the nicotinate ring, the Leu44 side-chain interacts with the nicotinate ring by van der Waals contact. Importantly, the S. aureus NaMNAT represents a distinct adenylyltransferase subfamily identifiable in part by common features of dimerization and substrate recognition in the loop connecting beta5 to beta6 (residues 132-146) and the additional beta6 strand. The unique beta6 strand helps orient the residues in the loop connecting beta5 to beta6 for substrate/product recognition and allows the beta7 strand structural flexibility to make key dimer interface interactions. Taken together, these structural results provide a molecular basis for understanding the coupled activity and recognition specificity for S. aureus NaMNAT and for rational design of selective inhibitors.     

Crystal structure of nicotinic acid mononucleotide adenylyltransferase from Pseudomonas aeruginosa in its Apo and substrate-complexed forms reveals a fully open conformation

The enzyme nicotinic acid mononucleotide adenylyltransferase (NaMN AT; EC 2.7.7.18) is essential for the synthesis of nicotinamide adenine dinucleotide and is a potential target for antibiotics. It catalyzes the transfer of an AMP moiety from ATP to nicotinic acid mononucleotide to form nicotinic acid adenine dinucleotide. In order to provide missing structural information on the substrate complexes of NaMN AT and to assist structure-based design of specific inhibitors for antibacterial discovery, we have determined the crystal structure of NaMN AT from Pseudomonas aeruginosa in three distinct states, i.e. the NaMN-bound form at 1.7A resolution and ATP-bound form at 2.0A as well as its apo-form at 2.0A. They represent crucial structural information necessary for better understanding of the substrate recognition and the catalytic mechanism. The substrate-unbound and substrate-complexed structures are all in the fully open conformation and there is little conformational change upon binding each of the substrates. Our structures indicate that a conformational change is necessary to bring the two substrates closer together for initiating the catalysis. We suggest that such a conformational change likely occurs only after both substrates are simultaneously bound in the active site.     

大肠杆菌AFP111菌体回收连续转化生产丁二酸

在利用大肠杆菌AFP111厌氧发酵生产丁二酸过程中,随着产物丁二酸的不断积累,菌体活力和产酸能力逐渐降低,而通过回收菌体在新鲜培养基中重复发酵,可延长厌氧发酵时间,但是丁二酸生产效率较低。为了提高菌体回收丁二酸的转化效率,通过在回收菌体时有氧诱导 3 h,以纯水为培养基,进行丁二酸转化发酵。在连续进行 3 批次的发酵后,丁二酸的总产量和最终收率分别为 56.50 g/L和90%,生产速率达到了 0.81 g/(L·h),比未诱导情况下的生产速率提高了13%。     

循环利用重组大肠杆菌细胞转化合成丁二酸

研究了回收丁二酸发酵液中的大肠杆菌进行细胞转化的可行性,以转化率和生产效率为指标,考察了不同菌体浓度、底物浓度、pH调节剂对细胞转化的影响。发酵结果表明大肠杆菌可以在仅含有葡萄糖和pH调节剂的水环境中转化生产丁二酸,并确定了最佳的转化条件为:细胞浓度(OD600)50,底物浓度40g/L,缓冲盐为MgCO3。基于优化好的条件,在7L发酵罐中进行重复批次转化,第1次转化的转化率和生产效率分别达到91%和3.22g/(L·h),第2次转化的生产效率和转化率达到了86%和2.04g/(L·h),第3次转化的转化率和生产效率分别达到了83%和1.82g/(L·h)。     

进化代谢选育高渗透压耐受型产琥珀酸大肠杆菌

在以碳酸钠为酸中和剂的大肠杆菌两阶段发酵产琥珀酸的过程中,由于Na+的积累造成发酵体系中渗透压的提高,严重抑制了琥珀酸的产物浓度。为了增强大肠杆菌对渗透压的耐受性,考察了利用进化代谢方法筛选高渗透压耐受型高产琥珀酸大肠杆菌菌株的可行性。进化代谢系统作为一种菌株突变装置,可以使菌体在连续培养条件下以最大的生长速率生长。以NaCl为渗透压调节剂,通过在连续培养装置中逐步提高NaCl浓度使菌体在高渗透压条件下快速生长,最终得到了一株高渗透压耐受型琥珀酸生产菌株Escherichia coli XB4。以碳酸钠为酸中和剂,在7 L发酵罐中利用Escherichia coli XB4进行两阶段发酵,厌氧培养60 h后,琥珀酸产量达到了69.5 g/L,琥珀酸生产速率达到了1.81 g/(L.h),分别比出发菌株提高了18.6%和20%。