国内cDNA文库及cDNA克隆的研究概况

本文就笔者所收集到的资料,对国内已报道的5个cDNA文库及9个cDNA克隆的建立进行简要概述,以期对国內cDNA文库及cDNA克隆的研究现状有个大致的了解。     

cDNA文库固相构建法

本文介绍一种ｃＤＮＡ文库的固相构建法。文库构建过程ｃＤＮＡ的合成和修饰全部在固相介质－磁珠上完成,简便、迅速、文库质量高,能满足不同目的的ｃＤＮＡ文库构建,是一种植得借鉴和应用的好办法。     

cDNA文库构建策略

随着ｃＤＮＡ文库应用的日益广泛,其构建方法也有了很大改进和提高。获得完整和均一的ｍＲＮＡ是构建成功的基础,合成ｃＤＮＡ时可根据不同目的选择相应的反转录酶和方法,用于构建的载体也由质粒发展到噬菌粒并各有其利弊,双链ｃＤＮＡ克隆前应视连接方案进行末端修饰和分级分离,克隆时则需把握ｃＤＮＡ和载体的比例。     

cDNA末端快速扩增技术新进展

全长cDNA的获得是基因克隆的重要内容,也是目前人类基因组研究中后 个重要方面,cDNA末端快速扩增（RACE）技术是以PCR为基础,从部分已知的cDNA序列扩增出其他未知部分的5′端和3′端的cDNA序列的一种方法,本文从RACE技术的基本原理方法出发,详细阐述了其存在的缺陷,并对RACE最新研究进展,如Marathon-PCR,Smart-PACE以及“电子”cDNA克隆等作一综述。     

cDNA芯片的重复性研究

cDNA芯片正在成为基因表达研究的常用方法,用此法通过一次杂交即可获得大量基因的表达信息[1,2]。目前,一些专业的生物芯片公司已推出部分cDNA芯片产品供研究者应用,然而,由于价格昂贵及受到其他一些条件的限制,国内众多研究者很难对芯片结果进行多次杂交验证,因此cDNA芯片的重复性就成为他们关心的问题,本实验对cDNA芯片用于基因表达研究的重复性进行了研究。１材料与方法１．１探针和cDNA芯片的制作按文献[3]中的方法合成R15Hp35T细胞的探针10μl,以荧光素Cy5-dCTP进行标记。同时制作含有61个基因的cDNA芯片,共10片。…     

基于cDNA测序与杂交的大规模基因组分析方法

随着人类及其他多种模式生物基因组计划所取得的重大进展 ,目前 ,基因组研究正处于一个从“序列基因组”研究向“功能基因组”研究的重大转折时期。诚然 ,通过“序列基因组”研究可以了解到大量的有关组成基因组所有核苷酸排列顺序的信息 ,但是 ,我们对由这些核苷酸所组成的基因的功能及这些基因的时空表达顺序却知之甚少。比如 ,通过人类基因组计划可以知道组成人类基因组的大约 3 0亿个核苷酸在染色体上是如何排列的 ,而由这些核苷酸可构成哪些基因 ?这些基因具有何种功能 ?这些基因在不同的组织、不同的发育阶段又是如何表达的 ?这正是“…     

眼镜蛇毒腺cDNA文库构建

目的 蛇毒含有多种生物活性成分,从天然蛇毒中提取分离蛇毒有效成分受到蛇毒资源和质量的限制。为开发蛇毒有效成分的基因工程产品,本研究构建了蛇毒腺的ｃＤＮＡ文库,为进一步筛选,克隆和表达螺毒有关基因做准备。方法 从眼镜蛇毒腺中提取ｍＲＮＡ,经反转录合成ｃＤＮＡ后,以λｇｔ１０噬菌体为载体,构建非表达的ｃＤＮＡ文加。     

cDNA末端快速扩增技术的研究进展

cDNA末端快速扩增技术是一种基于多聚酶链式反应的技术 ,它的发展大大便利了应用其它方法获得的部分cDNA序列后克隆全长cDNA 5’和 3’末端的工作。不仅RACE方法能在短时间内得到完整的cDNA末端序列 ,而且一些截短的cDNA末端常常也能在RACE的过程中被扩增 ,而这些截短的产物破坏了全长cDNA克隆的获取。许多研究者对RACE的流程提出了改进方案 ,从而提高了该技术的效力。本文介绍了许多已发表的RACE技术关键步骤的改良 ,包括一些具体有效的操作流程 ,如RNA连接酶介导的RACE/连接锚定PCR等 ,还有其有效性的例证。     

枸杞果实cDNA文库的构建

目的 :通过构建枸杞果实cDNA文库 ,分离类胡萝卜素合成酶基因。方法 :枸杞果实RNA的提取采用改进的异硫氰酸胍 -酚 -氯仿法 ,利用PolyATractmRNAIsolationSystem(Promega公司 )分离mRNA ,然后利用UniversalRibocloneRcDNASynthesisSys tem(Promega公司 )合成双链cDNA ,在cDNA末端连接上EcoRⅠ接头 ,并与λExCell载体连接 ,利用PackageneLambdaDNAPackagingSystem进行包装。结果 :首次构建出滴度为 8 4× 10 4 pfu ml,重组效率为 86 9%的枸杞果实cDNA文库。结论 :构建出枸杞果实cDNA文库 ,为类胡萝卜素合成酶基因的分离奠定了基础     

大鼠肾脏组织cDNA文库的制备和葡萄糖转运蛋白cDNA克隆的筛选

 大鼠的肾脏组织经匀浆后,提取纯化总RNA和mRNA合成cDNA,进行甲基化,加人工接头,最后连入载体(λgt11)和外壳蛋白包装步骤制成肾脏组织的cDNA文库。插入载体的cDNA长度为0.5kb到8kb之间。经反复稀释,测定出该文库的效价为1.5×10~7pfu/mL。     

甜菜碱醛脱氢酶基因的cDNA克隆

甜菜碱醛脱氢酶基因的ｃＤＮＡ克隆马德钦,汤岚,吕文,骆爱玲,梁峰（中国科学院微生物研究所,北京１０００８０）（中国科学院植物研究所,北京１０００４４）ｃＤＮＡＣＬＯＮＥＯＦＴＨＥＧＥＮＥＯＦＢＥＴＡＩＮＥＡＬＤＥＨＹＤＥＤＥＨＹＤＲＯＧＥＮＡＳＥ￥￣...     

cDNA末端快速扩增试剂盒研发进展

DNA扩增的方法有许多种,其中cDNA末端快速扩增（rapid amplification of cDNA ends,RACE）因其操作简单、成功率相对较高、重复性好,被广泛应用于真核生物基因全长的克隆与分析。本文比较了市售的RACE试剂盒所采用的模板制备策略及改进的扩增方法。     

cDNA微阵列制作的优化

为了优化筛检cDNA微阵列中靶基因的最适长度、浓度及点样溶液的种类,设计持家基因beta actin和GAPDH RT-PCR 3对引物,产物长度在189～1 078 bp之间,以乙肝病毒DNA片段为阴性对照,扩增纯化后分别溶于3×SSC、50%DMSO及0.5mol/L碳酸盐缓冲液（pH=9.0）中,调整浓度分别为0.5μg/μL、1.0μg/μL和1.5μg/μL,比较上述不同条件的杂交结果。结果表明,杂交具有较好的特异性,阴性对照（乙肝病毒）和空白对照（点样溶液）均未见杂交信号;3种长度的同一靶基因杂交信号强度无明显差别（beta actin P=0.378;GAPDH P=0.866）;3种点样溶液中以50%DMSO杂交信号最好,较强且均匀一致(P=0.0001),其余2种差异不显著(P=0.142);3种浓度靶基因杂交信号差异不显著(P=0.648),浓度高者信号略强。短片段靶基因（200 bp左右）可获得与长片段靶基因（1 000 bp以上）一样较好的杂交信号,点样溶液以50%DMSO效果最好,靶基因浓度为0.5μg/μL时即可得到较好的杂交结果。 Abstract:To optimize and screen the most suitable target gene length,concentration and printing solution in cDNA microarray,housekeeping genes,such as beta actin and GAPDH,were selected as targets and hepatitis B virus gene as negative control.The RT-PCR primers that spanned at least one intron and whose products were at between 189 bp and 1 078 bp were designed with primer premier 5.0,so did the hepatitis B virus gene PCR primer.After polymerase chain reaction,the products were purified with ethanol and dissolved in 3×SSC,50% DMSO and 0.5mol/L carbonate buffer（pH=9.0）respectively.The concentrations of target genes were adjusted at 0.5μg/μL,1.0μg/μL and 1.5μg/μL.The hybridization signals had a good specificity.No signal showed in either negative control (HBV) or blank control (printing solution only).There was no significant difference in target gene lengths.The P value of beta actin (189 bp,491 bp,974 bp) and GAPDH (227 bp,552 bp,1 078 bp) was 0.378 and 0.866 respectively.There was no significant difference among concentrations（P=0.648）,too.However,the higher the concentration was,the stronger the signals would be.Among the three kinds of printing solution,50% DMSO was the best（P=0.0001）,while the other two had no difference by multi-comparison(P=0.142).The target gene at length between 200 bp and 1 000 bp has got the same hybridization signals.50%DMSO printing solution and the target gene concentration of 0.5μg/μl are suitable for good hybridization.     

一种快速、简便、高效cDNA合成及克隆策略

以鱼呼肠孤病毒双链ＲＮＡ为模板,建立一种快速、简便、高效的ｃＤＮＡ合成及克隆策略。在一定量模板条件下,采用随机六聚体为引物合成ｃＤＮＡ第一链。以退火方式形成双链ｃＤＮＡ,直接通过琼脂糖凝胶电泳检测其ｃＤＮＡ合成产量。双链ｃＤＮＡ经两端补齐后,平头连接于具有阳性选择标记的载体中,以高效电转化的方式进行快速克隆。