壳聚糖固定化脲酶研究Ⅱ

从废弃的蟹虾壳中提取壳聚糖,探讨了壳聚糖(载体),戌二醛(交联剂)、脲(保护剂)及给酶量四者之间的最适固定化脲酶条件,并对固定化脲酶的理化性质进行了初步探讨。同时还探讨了引入铜离子保护部分氨基制备的固定化脲酶制成柱式反应器,让底物逆流通过反应柱,考察了相同浓度底物溶液在不同温度下过柱后的转化率。     

壳聚糖载体的制备及脲酶的固定化研究

以甲壳素为原料,制备出壳聚糖载体,并对脲酶进行固定化。通过测量悬挂醛基探讨了交联条件对载体性能的影响,优化了脲酶的固定化条件,研究了固定化酶的酶学性质,并与游离酶进行了比较。结果表明。制备载体的最优条件是将微球用6％的戊二醛活化2h,最佳联酶条件是载体与脲酶共反应1h。该固定化酶的最适温度为65℃,最适pH值为6．6,米氏常数为0．009mol／L,较游离酶均有较大改善。热稳定性较游离酶有很大的提高,且具有良好的操作稳定性。     

壳聚糖固定化木聚糖酶的研究

从青霉菌m8提取出木聚糖酶,将其固定在用戊二醛交联的壳聚糖载体上。1．0g壳聚糖与4％的二醛结合固定3．5mg蛋白,酶活回收率为46．6％。在酶的最适pH为4．6,固定化酶为pH3．8。原酶的最适温度为55℃,固定化酶在60－75℃都具有较高活性。固定化酶的耐热性优于原酶,固定化酶的表现Km值略低于原酶,前者为5．0×10－2g／L,后者为3．58×10－2g／L。     

壳聚糖固定化木瓜蛋白酶的研究

以自制的壳聚糖作为载体,用戊二醛作交联剂,优化了固定化条件,研制成壳聚糖固定化木瓜蛋白酶。其活性回收率达到42—53％,操作半衰期达到一个月以上,对热、乙醇以及尿素的稳定性有很大的提高,Km值为0.67×10~2mg/mL,最适温度65—70℃,最适pH8.0,能使啤酒中的蛋白质浓度从56.5mg/L减少到2.7mg/L,可以消除啤酒的低温混浊现象。     

以伴刀豆球蛋白为介质定向固定化脲酶的研究

将戊二醛将伴刀豆球蛋白(ConA)和壳聚糖载体交联, 然后利用ConA与脲酶糖链的特异性结合作用, 实现脲酶的定向固定化。定向固定化的最适条件为戊二醛浓度3.5%、ConA浓度1 mg/mL、ConA溶液pH值7.0、脲酶浓度 0.4 mg/mL。定向固定化脲酶的最适pH 5.0~6.0、最适温度77°C、米氏常数Km11.76 mmol/L, 与游离酶及非定向固定化脲酶比较, 定向固定化脲酶的最适pH向酸性范围发生了偏移并有更宽的pH适用范围, 最适温度提高, 与底物的亲和力较大, 且有较好的操作稳定性。     

壳聚糖固定化木瓜蛋白酶的研究

以壳聚糖为载体,成二醛为交联剂将木瓜蛋白酶固定化。5％戊二醛在4-6℃下处理载体5h,加酶液(3.5mg/mL蛋白,pH7.2)固定12h,活力回收达32％,作用于酪蛋白的半衰期为36天,其表观K_m(酪蛋白)值为0.075％(W/V),溶液酶的K_m值为0.086％;最适pH7.0～7.5,溶液酶为7.0～8.5。固定化酶在pH8.5以下,溶液酶在9.0以下活力稳定。固定化酶在45℃以下,溶液酶在75℃以下稳定。用6mol/L脲洗脱固定化酶4次(5.5h)活力仍有54.5％。用固定化酶处理啤酒浊度比对照下降了1.5-3.7倍,蛋白质含量下降了44％,冷藏(4℃)120天无冷混浊现象发生并保持了啤酒原有风味和理化性状。     

壳聚糖固定化纤维素酶的研究

以蟹壳为原料提取壳聚糖,用戊二醛作交联剂,将纤维素酶固定于壳聚糖上．同时探讨了一定量干壳聚糖载体与交联剂浓度、给酶量等关系的最适固定化酶条件,并对固定化酶的热稳定性、操作稳定性、米氏常数、最适温度、离子强度的影响及使用半衰期等理化性质进行了探讨．     

壳聚糖固定化琼脂酶的研究

采用壳聚糖微球对琼脂酶进行固定化,在单因素实验的基础上用正交试验法确定最佳固定化工艺。结果表明:在戊二醛体积分数为2.5%,交联时间为6 h,加酶量为15 mL,固定时间为3 h时固定酶的活力最高;固定化酶的最适反应温度及最适pH分别为50℃和8.5,高于游离酶;同时其热稳定性及操作稳定性均高于游离酶。     

壳聚糖固定化半纤维素酶的研究

从青霉菌m8提取出半纤维素酶,将其固定在用戊二醛交联的壳聚糖载体上.0.5 g壳聚糖与4%的戊二醛结合固定2.5 mg蛋白质,酶活回收率为45.6%. 原酶的最适pH为4.6,固定化酶为pH 3.6.原酶的最适温度为55℃,固定化酶在60～75℃都具有较高活性.固定化酶的耐热性优于原酶. 以半纤维素为底物,固定化酶的表观K_m值略低于原酶,前者为5.0×10^－2 g/L,后者为3.58×10^－2 g/L.     

壳聚糖固定化酶一步纯化抑肽酶研究

采用化学改性与修饰微珠壳聚糖为载体,共价法偶联牛胰蛋白酶,制成抑肽酶亲和吸附剂,单位活力５１９０ＫＩＵ／ｇ（湿）,蛋白偶联率６０．５％,酶活性回收率５５％;将其直接亲和层析牛肺提取液,分离纯化高比活抑肽酶。方法过程简单,样品比活力５７００ＫＩＵ／ｍｇ,质量稳定,成本较低;该吸附剂机械强度高,抗污染能力较强,非特异性吸附较小,可以反复使用,价格低廉,适合工业化生产。     

改性壳聚糖固定化脂肪酶的研究

以化学改性后的壳聚糖为载体固定假丝酵母99-125脂肪酶,研究了不同的活化剂对壳聚糖表面羟基基团的活化程度,及以活化后壳聚糖为载体采用不同固定化方法对假丝酵母脂肪酶固定效果的影响。结果表明1-乙基-3-(3-甲基氨基)丙基碳二亚胺可有效的活化壳聚糖表面羟基,活化后的壳聚糖表面氨基与戊二醛偶联后形成的壳聚糖为良好的脂肪酶固定化载体,其固定脂肪酶的水解活力可高达86.8U/g。此外,还对影响固定化进程中的各种因素进行了研究,确定最优条件,比较了固定化前后酶的热稳定性、有机溶剂稳定性及最适反应温度。并考察了该固定化脂肪酶催化合成棕榈酸十六酯的操作稳定性,结果表明,连续反应16批之后棕榈酸十六酯的转化率仍能达到85%以上。     

交联脲酶聚集体的制备和初步应用

为提高游离脲酶的稳定性,将游离脲酶用硫酸铵沉淀下来后,以戊二醛作为交联剂对其进行化学交联,制备新型的固定化脲酶交联脲酶聚集体,并对其酶学性质进行研究。交联脲酶聚集体的最适pH、最适温度和K_m值分别为：pH 8.0、70℃和0.021 mol/L。在对交联脲酶聚集体的热稳定性,储存稳定性,和对抗蛋白水解酶的能力的研究中,交联脲酶聚集体均显示了比游离脲酶更高的稳定性。为考察其使用效果和稳定性,将其与包醛氧淀粉联合,用于慢性肾衰动物模型的口服治疗。以腺嘌呤灌胃法(每天300mg/kg, 共30d)制备慢性肾衰动物模型,将23只大鼠随机分为模型对照组(每天以10mL/kg蒸馏水灌胃)、单纯包醛氧淀粉组(给予含包醛氧淀粉饲料,10mL/kg蒸馏水灌胃)和包醛氧淀粉+交联脲酶聚集体组(给予含包醛氧淀粉饲料,交联脲酶聚集体悬浮液10mL/kg灌胃),经2周治疗后, 模型对照组、治疗对照组和治疗组实验前后的肌酐含量均有小幅下降,但差异不显著(P值分别为0.922、0.972和0.225＞0.05)。模型对照组的尿素氮含量变化不明显(P=0.211＞0.05)。治疗对照组和治疗组实验前后的尿素氮含量均明显下降(P值分别为0.004和小于0.001,均小于0.01)。治疗对照组和治疗组实验前后的尿素氮含量下降量比较,有显著性差异(P=0.016＜0.05)。治疗组尿素氮含量下降更明显。说明交联脲酶聚集体和包醛氧淀粉联合使用时,对尿素的清除效率比单纯使用包醛氧淀粉更高。     

壳聚糖球固定化酵母细胞的研究

以戊二醛为交联剂,将壳聚糖球交联引入醛基,然后将交联的壳聚糖球浸泡在酵母细胞悬浮液中,制备了固定化酵母细胞壳聚糖球。以苯乙酮酸为底物,催化合成了D-扁桃酸。最优固定化条件是戊二醛的质量分数w(GA)=1%,酵母细胞与交联壳聚糖球的质量比m(Y):m(CB)0=0.5,交联时间为6h,固定化时间为18h,底物浓度为10mmol/L,在此条件下反应最大转化率和产物光学纯度分别高达67.86%和98.05?。固定化酵母壳聚糖球具有良好的重复使用性和贮存稳定性。     

改性与修饰壳聚糖固定化酶纯化抑肽酶研究

采用化学改性与修饰微珠壳聚糖为载体,共价法偶联牛胰蛋白酶,制成抑肽酶亲和吸附剂,单位活力5 190 KIU/g（湿）,蛋白质偶联率60.5％,酶活性回收率55％;将其直接亲和层析牛肺提取液,分离纯化高比活抑肽酶.方法过程简单,样品比活力5 700 KIU/mg,质量稳定,成本较低;该吸附剂机械强度高,抗污染能力较强,非特异性吸附较小,可以反复使用,价格低廉,适合工业化生产.     

壳聚糖固定化德氏根霉脂肪酶的研究

研究了壳聚糖吸附和戊二醛交联对脂肪酶固定化条件,在室温条件下将0．4g酶粉溶于pH6．0缓冲液中,加入10g壳聚糖,摇匀,再加入浓度为0．6％戊二醛交联6h,得到固定化酶,酶活力回收率约为54．2％。固定化酶的半失活温度比游离酶的高,半失活温度由游离酶的47℃提高到100℃,最适反应温度由40℃上升至80℃,最适pH由6下降到5．5,固定化酶K’m值由游离酶的Km 50mg／mL增加到56mg／mL。该固定化脂肪酶用于酯的合成;在80℃条件下经过10批次连续水解植物油反应,固定化酶的活力仍保持在82．6％以上。     

碱性磷酸酶在壳聚糖上的固定化作用

本文报道以蟹、虾废壳为原料提取壳聚糖,用戊二醛作交联剂,将碱性磷酸酶固定于壳聚糖上。同时探讨了一定量湿壳聚糖载体与交联剂浓度,给酶量及产率等关系的最适固定化酶条件,并对固定化酶的热稳定性、操作稳定性、米氏常数、最适pH、最适温度等理化性质进行了探讨。     

壳聚糖载体的改性及其用于固定化漆酶的研究

利用有机酸改性壳聚糖,并用交联法制备酸化的壳聚糖载体,然后用改性壳聚糖载体固定漆酶。甲酸、乙酸改性壳聚糖的最适条件:壳聚糖与甲酸、乙酸的质量摩尔比(g/mol)分别为100∶1、100∶1.5,戊二醛的质量分数为1%,缓冲溶液的pH分别是4.4、5.0,反应时间为3h;壳聚糖与酒石酸、草酸的质量摩尔比(g/mol)分别为100∶0.5、100∶2,戊二醛的质量分数为2%,缓冲溶液的pH分别是3.6、4.2,反应时间为4.5h。不同有机酸改性的壳聚糖用于漆酶的固定,其酶活都有不同程度的提高,尤其用酒石酸改性的壳聚糖载体效果最好,其酶活提高了57%。