小鼠cAMP应答元件结合蛋白基因在大肠杆菌中的表达

采用PCR技术,删除了小鼠CREBcDNA5′端和3′端非编码序列,并引入便于基因操作的酶切位点。经30次循环的扩增,得到改造后的CREBcDNA,全长1071bp。亚克隆后,对此扩增片段进行了限制性内切酶物理图谱分析,测定了DNA序列,并以其为插入物,构建了pBV220-PCR-CREB重组表达载体。经Western印迹法分析证明,在大肠杆菌中的表达获得成功 。     

L—山梨酮脱氢酶基因在大肠杆菌中的克隆和表达

参照已知的Ｌ－山梨酮脱氢酶基因序列,合成了两个引物序列,以ＡｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｌｉｑｕｅｆｉｃｉｅｎｓＩＦ０１２２５８的染色体ＤＮＡ为模板进行ＰＣＲ反应,克隆得到了Ｌ－山梨酮脱氢酶基因,经酶切验证与预期结果相同,序列测定结果也与已知序列一致,采用ＰＣＲ方法在此基因的两端加上了Ｅ．ｃｏＲＩ和ＨｉｎｄＩＩ两个酶切位点,经Ｅ．ｃｏＲＩ和ＨｉｎｄＩＩ酶切后去掉了两端的多余序列后,将此片段连接到ｐＫＫＨｈ     

猪繁殖和呼吸综合征病毒膜蛋白和核衣壳蛋白基因在大肠杆菌中的表达

以 Ｐ Ｒ Ｒ Ｓ Ｖ 弱毒株膜蛋白（ Ｍ） 和核衣壳（ Ｎ） 蛋白基因为模板,设计的一对含有 Ｅｃｏ Ｒ Ｉ 和 Ｂａｍ Ｈ Ｉ酶切位点的引物,通过 Ｒ Ｔ Ｐ Ｃ Ｒ 扩增出一约９００ ｂｐ 的 Ｍ Ｎ 基因片段,将此基因片段成功克隆于高效表达载体ｐ Ｂ Ｖ２２０ ,构建成重组质粒ｐ Ｂ Ｖ Ｍ Ｎ,导入大肠杆菌 Ｄ Ｈ５α,经温敏诱导,成功地表达了 Ｍ Ｎ 基因。表达产物经 Ｓ Ｄ Ｓ Ｐ Ａ Ｇ Ｅ 电泳和 Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ 印迹分析,其分子量约３４ ｋ Ｄ,与兔抗 Ｐ Ｒ Ｒ Ｓ Ｖ 高免血清发生反应,经光密度扫描分析,表达产物量占菌体总蛋白的１２ ％ 。该研究为 Ｐ Ｒ Ｒ Ｓ 基因诊断抗原的研制奠定了基础     

小鼠IL-18基因的克隆及真核表达载体的构建

研究ＩＬ－１８是否具有对造血功能调控的作用。采用常规分子生物学技术,从小鼠骨髓细胞中克隆了含信号肽序列的ＩＬ－１８,构建了表达载体。经序列测定表明所克隆的ＩＬ－１８序列与文献报道的一致,构建的真核表达载体正确。     

L─山梨酮脱氢酶基因在大肠杆菌中的克隆和表达

参照已知的L－山梨酮脱氢酶基因序列,合成了两个引物序列,以AcetobacterliqueficiensIF012258的染色体DNA为模板进行PCR反应,克隆得到了L－山梨酮脱氢酶基因,经酶切验证与预期结果相同,序列测定结果也与已知序列一致。采用PCR方法在此基因的两端加上了E．coRI和HindⅢ两个酶切位点,经E．coRI和HindⅢ酶切后去掉了两端的多余序列后,将此片段连接到pKKH上,经诱导无蛋白表达,采用RcaI酶切启动子端,对载体pKKH则采用Mcol酶切,使表达载体的SD序列     

pBV220载体中外源基因二级结构与表达水平关系

运用极小化自由能RNA二级结构预测方法分析了pBV220载体中以表达水平20％作为分类标准的人白细胞介素2、人白细胞介素4等32个外源基因表达水平,结果表明5′端32～41区域和3′端25～46区域的二级结构自由能与表达水平具有显著的统计学意义,并运用Bays判别分析方法构建了判别函数,判别符合率为87.5％。     

甜蛋白Monellin基因在大肠杆菌中的高效表达

据已报道的单链monellin甜蛋白的氨基酸序列,采用细菌偏爱密码子,人工合成了全长 294bp的 monellin基因。插入到大肠杆菌表达载体Pet_22b中,构建重组分泌型表达载体Petmo。经IPTG诱导Petmo所含有的甜蛋白基因可在大肠杆菌BL21（DE3）中高效表达,表达量占菌体可溶性蛋白的44.8％。且经纯化后测定其甜度是蔗糖的3000倍。得到的甜蛋白热稳性及耐酸性均比天然产物有所提高。     

pBV220载体中外源基因高效表达的自动化设计

pBV220载体是国内科学家构建的原核系统表达载体,目前仍在广泛应用.但是,实现 外源基因的高效表达需要综合考虑诸如RNA二级结构等多种因素,极其耗时费力．为此,基于我们提出的pBV220载体中外源基因高效表达数学模型,编写了外源基因高效表达的自动化设计软件,并可定性用于原核系统其它载体中外源基因表达水平分析,最终为加快实验进程提供帮助     

人可溶性白介素4受体(sIL4R)在大肠杆菌中的表达和纯化

白细胞介素 4 (IL 4 )作为一种多功能的细胞因子在哮喘等变态性炎症反应中具有关键作用 .IL 4通过结合细胞表面的白介素 4受体 (IL 4R)发挥其生物学效应 .sIL 4R缺少跨膜和胞内结构域 ,结合IL 4后不能产生信号传递介导IL 4的生物学活性 ,但sIL 4R与IL 4结合的高度特异性和极高的亲和力使它非常适合作为理想的IL 4拮抗剂 ,应用于哮喘等疾病治疗 .采用RT PCR方法 ,以人单核细胞总RNA为模板扩增得到编码sIL 4R的基因片段 ,经测序确证后插入大肠杆菌高效表达质粒pBV2 2 0 ,得到重组质粒pBV2 2 0 sIL 4R ,重组质粒转化E .coliDH5α .重组菌经温度诱导后超声破碎得到包涵体 ,经SuperdexHR75分子筛柱和DEAE SepharoseFastFlow离子交换柱进行纯化 ,HPLC检测表明纯度达到 90 % .N端测序证明 ,重组sIL 4R与天然sIL 4RN端序列完全一致 .Western印迹、配基结合印迹对重组sIL 4R进行鉴定 .结果表明 ,重组sIL 4R具有结合IL 4的生物学活性     

2,5—KDG还原菌Ⅱ基因的克隆和在大肠杆菌中的表达

参照文献上的２,５－二基－Ｄ－葡萄糖酸还原酶Ⅱ基因序列,合成两个引物序列并在两端加上ＥｃｏＲＩ和ＢａｍＨＩ两个酶切位点,抽提棒状杆菌ＳＣＢ３０５８菌株的染色体灯反进行ＰＣＲ反应,克 得到２,５－ＤＫＧ还原酶Ⅱ基因,酶切验民预期的结果相符合。将此片段克隆到ＰＧＥＭ－Ｔ载体上保存将２,５－ＤＫＧ还原酶Ⅱ基因用ＥｃｏＲⅠ和ＢａｍＨＩｍ内切酶切下,连接到ＰＢＶ２２０载体上,构建成表达载体,４２℃诱导不能得     

HER2胞外区基因的克隆及其在大肠杆菌中的可溶性表达

采用反转录PCR和PCR方法分别克隆P185^HER2/neu胞外区基因和噬菌体M13K07g3p—N1结构域基因,然后将二偶联入pET-22b( )载体中,在大肠杆菌中进行融合表达。可溶性目的蛋白表达量占细菌可溶性表达产物总量的30％72右．并通过镍亲和层析纯化出目的蛋白。以上结果为从噬菌体抗体库中筛选抗P185^HER2/neu的抗体奠定了基础。     

中国仓鼠卵细胞二氢叶酸还原酶基因在大肠杆菌中的高效表达

本工作采用PCR法将哺乳动物表达载体pSVA75上的中国仓鼠卵细胞(CHO)二氢叶酸还原酶基因扩增后插入到原核生物高效表达质料pBV221中,构建成胞内表达载体pDHFR-1,经转化大肠杆菌(E.coli DH5α)后获高效表达,表达量占总蛋白量的12.2%。利用这种方法不仅为深入研究该酶的结构和功能的关系及其新生肽链的折叠提供丰富的实验材料,而且也有希望成为较好的外源DNA原核扩增表达系统。 Abstract:The technique of PCR was used to amplify the Chinese Hamster Ovary DHFR gene in the mammal expression vector pSVA75,and the amplified fragments were inserted into the vector pBV221,to construct the vector pDHFR-1.The CHO dhfr was fransformaed into E.coli DH5α and high-level expressed.The scanning results(scanned by LKB Enhanced Laser Densitometer)showed that the expression level had reached 12.2% of the total cellular proteins.Therefore,this provides an abundant experimental material for studying the relationship between the protein construct and function,and for studying the biology of the nascent peptide chain during biosynthesis.This pathway may be a good expression system of prokaryocyte for amphifing eukaryotic gene.     

cAMP应答元件结合蛋白与痛觉调制

cAMP应答元件结合蛋白（cAMP response element binding protein,CREB）是刺激诱导的一种转录因子,通过磷酸化实现调节转录功能。疼痛和痛觉过敏是组织损伤或炎症时常伴有的生理病理过程,谷氨酸、P物质等神经递质或神经肽以及细胞内的信号转导途径参与此过程。近年来研究发现CREB通过自身磷酸化,在炎症、神经损伤等诱发的自发性疼痛、痛觉过敏及痛觉超敏中具有重要作用。本文从CREB的一般特性及其在脊髓水平的痛觉调制中的作用等方面予以综述。     

粒细胞集落刺激因子(G-CSF)在大肠杆菌中的高效表达及快速纯化工艺的建立

基因工程重组人粒细胞集落刺激因子（ｒｈＧ－ＣＳＦ）主要用于癌症患者化疗后的粒细胞减少症．在正确克隆人Ｇ－ＣＳＦｃＤＮＡ的基础上,重点对Ｇ－ＣＳＦｃＤＮＡ的５′端进行了较为彻底的修饰,修饰后的基因插入ｐＢＶ２２０载体组建成功ｐＢＶ２２０／Ｇ－ＣＳＦ／２－１７４高效表达载体．表达后ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析其表达最高达５０％以上．根据Ｇ－ＣＳＦ表达形成包涵体这一特性,建立了一条简便、稳定,适用于大规模生产的分离纯化工艺流程．首先分离纯化包涵体,８ｍｏｌ／Ｌ尿素裂解包涵体,稀释复性蛋白,之后一步ＳＰ－ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦ柱层析至均质．纯化的Ｇ－ＣＳＦ比活性达３．４×１０８Ｕ／ｍｇ蛋白,每升表达菌液回收的Ｇ－ＣＳＦ总活性达１．０６×１０１１Ｕ．纯化产物的Ｎ－端氨基酸序列分析表明,对甲硫氨酸的去除彻底,用于人体时可能具有较小的免疫原性和毒性     

2,5-DKG还原酶Ⅱ基因的克隆和在大肠杆菌中的表达

参照文献上的2,5-二酮基-D-葡萄糖酸（简称2,5-DKG）还原酶II基因序列,合成两个引物序列并在两端加上EcoRI和BamHI两个酶切位点,抽提棒状杆菌SCB3058菌株的染色体为模板进行PCR反应,克隆得到2,5-DKG还原酶II基因,酶切验证与预期的结果相符合。将此片段克隆到pGEM-T载体上保存．将2,5-DKG还原酶II基因用EcoRI和BamHI内切酶切下,连接到pBV220载体上,构建成表达载体。42℃诱导不能得到稳定的蛋白表达条带和酶活力,测序发现基因的3’末端的原PCR引物外少合了一个碱基,终止密码子发生移码突变而消失。此外在5’端的启始密码子ATG前有三个碱基与pBV220载体上的SD序列发生配对。据此,重新设计和合成了PCR引物,并用pBV220和pBL4载体构建了两个表达载体。42℃诱导表达均得到了稳定的表达条带和较高的酶活力．     

小鼠胰岛素样生长因子结合蛋白-7真核表达载体的构建及序列分析

利用PCR技术,从质粒pRSET／mIGFBP-7中获得目的基因小鼠胰岛素样生长因子结合蛋白-7（mIGFBP-7）,将其插入质粒pcDNA3．1／HisB中,构建了含mIGFBP-7的真核表达重组质粒pcDNA3．1／mIGFBP-7。经测序鉴定,重组质粒构建正确,为下一步对其功能研究奠定了基础。     

猪生长激素基因在杆状病毒载体系统中的表达

通过对猪生长激素(pGH)基因的cDNA进行测序,得到pGH cDNA的全序列,并与Seeburg等报道的序列进行了比较和讨论.然后利用具人工合成启动子和多角体蛋白XIV启动子的转移载体质粒pSXIVVI+X3/4构建出含pGH基因的重组质粒pX3/4-pGH.将pX3/4-pGH与致死缺失型线性化AcMNPV-OCC- DNA共转染Sf9细胞,构建出既能形成多角体又能表达pGH基因的苜蓿丫纹夜蛾核多角体重组病毒AcMNPV-pX3/4-pGH-OCC+.感染重组毒株的Hi 5细胞可溶蛋白及其培养上清的SDS-PAGE和Western blot的分析结果表明,感染细胞的蛋白电泳带的20.7 kDa处有一条猪生长激素特异带,但培养上清中没有.凝胶黑度扫描估测结果显示pGH蛋白占细胞可溶蛋白的4.48%.     

肥胖基因的分离及其在大肠杆菌中的表达

利用PCR技术自外周血白细胞染色体DNA中扩增获取了肥胖基因(ob基因)的外显子2和3序列.经过拼接,获得了全长的ob基因编码序列. 测序结果表明,获得的序列与文献报道完全一致.利用PCR技术扩增出成熟蛋白的编码序列,克隆至表达载体pBV220中获得了表达菌株,并对表达产物进行了初步纯化,为进一步研究ob基因产物的功能与应用奠定了基础.     

耐热DNA聚合酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

用PCR法从水生栖热菌菌株YT－1中扩增耐热DNA聚合酶基因,得到2．5kb的DNA片段t扩增片段重组到pUCl8中测序证实为Taq DNA聚合酶基因,将该片段重组到pBV221温控表达质粒中,在大肠杆菌中表达出94kDa的重组蛋白,100ml培养物的细胞产酶为1．5×10⁵u,表达的蛋白能催化PCR反应的进行。