大肠杆菌精氨酰—tRNA合成酶的Lys306为酶活力所必需

将大肠杆菌精氨酰ｔＲＮＡ合成酶（ＡｒｇＲＳ）上Ｌｙｓ３０６用基因点突变的方法分别变为Ａｌａ和Ａｒｇ的密码子,得到变种基因ａｒｇｓ３０６ＫＡ和ａｒｇｓ３０６ＫＲ。变种基因重组在ｐＵＣ１８上,转化到大肠杆菌ＴＧ１中,转化子中ＡｒｇＲＳ及其变种ＡｒｇＲＳ３０６ＫＡ和ＡｒｇＲＳ３０６ＫＲ所表达的蛋白量生活为ＴＧ１表达ＡｒｇＲＳ蛋白量的１００倍。细胞粗抽提液中ＡｒｇＲＳ的比活ＴＧ１,转化子ｐＵＣ１８－ａｒｇ     

大肠杆菌精氨酰－tRNA合成酶的Lys378和381的点突变研究

用点突变的方法将大肠杆菌精氨酰—ｔＲＮＡ合成酶（ＡｒｇＲＳ）的基因ａｒｇｓ上相应于Ｌｙｓ３７８和Ｌｙｓ３８１的密码ＡＡＡ分别变为两氨酸的密码ＧＣＡ和精氨酸的密码子ＣＧＴ,得到了４个ａｒｇｓ的突变体ａｒｇｓ３７８ＫＡ,ａｒｇｓ３７８ＫＲ,ａｒｇｓ３８１ＫＡ和ａｒｇｓ３８１ＫＲ,将它们分别连接到ｐＵＣ１８上,转入大肠杆菌ＴＧ１,在ＴＧ１转化子中,ＡｒｇＲＳ及其变种的表达量约为ＴＧ１中的１２０倍以上。结果表明Ｌｙｓ３７８为Ａｒｇ和Ａｌａ取代分别使活力下降０％和１０％;Ｌｙｓ３８１变为Ａｌａ和Ａｒｇ后,活力分别下降３３％和１０％左右。Ｌｙｓ３７８不为酶活力必需。Ｌｙｓ３８１部位的正电荷对酶活力是重要的。     

大肠杆菌精氨酰—tRNA合成酶的变种ArgRS306KR的纯化…

本文从含ＡｒｇＲＳ３０６ＫＲ基因ａｒｇｓ３０６ＫＲ的ｐＵＣ１８重组质粒的大肠杆菌ＴＧ１转化子中经ＤＥＡＥ－Ｓｅｐｈａｃｅｌ和Ｂｌｕｅ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ两步柱层析,得到电泳一条带的ＡｒｇＲＳ３０６ＫＲ。纯酶的比活为２７９０单位／毫克。该酶氨酰化和ＡＴＰ－ＰＰｉ交换活力的最适ＰＨ分别为ＰＨ８．３和ＰＨ７．５。氨酰化活力对ＡＴＰ、Ａｒｇ和ｔＲＮＡ的Ｋｍ分别２．６ｍｍｏｌ／Ｌ、１４．０μｍｏｌ／Ｌ和５．     

大肠杆菌精氨酰－tRNA合成酶的变种ArgRS306KR的纯化和基本性质

本文从含ＡｒｇＲＳ３０６ＫＲ基因ａｒｇｓ３０６ＫＲ的ｐＵＣ１８重组质粒的大肠杆菌ＴＧ１转化子中经ＤＥＡＥ－Ｓｅｐｈａｃｅｌ和Ｂｌｕｅ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ两步柱层析,得到电泳一条带的ＡｒｇＲＳ３０６ＫＲ。纯酶的比活为２７９０单位／毫克。该酶氨酰化和ＡＴＰ～ＰＰｉ交换活力的最适ｐＨ分别为ｐＨ８．３和ｐＨ７．５。氨酰化活力对ＡＴＰ、Ａｒｇ和ｔＲＮＡ的Ｋｍ分别为２．６ｍｍｏｌ／Ｌ、１４．０μｍｏｌ／Ｌ和５．０μｍｏｌ／Ｌ：Ｖｍａｘ为７６３０单位／毫克;ｋｏａｔ为９Ｓ－１。ＡＴＰ～ＰＰｉ交换活力对ＡＴＰ和Ａｒｇ的Ｋｍ分别为８．３ｍｍｏｌ／Ｌ和９９μｍｏｌ／Ｌ;Ｖｍａｘ为１６３２０单位／毫克;ｋｃａｔ为１８Ｓ－１。     

编码大肠杆菌精氨酰—tRNA合成酶的基因（argS）拥？…

编码大肠杆菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）精氨酰－ｔＲＮＡ合成酶（ＡｒｇＲＳ）的基因（ａｒｇＳ）和编码亮氨酰－ｔＲＮＡ合成酶（ＬｅｕＲＳ）的基因（ＬｅｕＳ）分别插入ｐＵＣ１８后,各自在Ｅ．ｃｏｌｉ ＴＧ１转化子中的表达有很大的差异（高表达倍数分别为１０００和３５倍）。为了调查造成其表达差异的原因,用ａｒｇＳ的５＇上游非编码区取代ｌｅｕＳ的５＇上游非编码区,构建了融合基因ｐａｒｇ－ｌｅｕＳ;将它插入质粒ｐＵＣ１８     

大肠杆菌精氨酰tRNA合成酶基因的诱导高表达

在高表达大肠杆菌精氨酰ｔＲＮＡ合成酶基因５５０倍的基础上,将ａｒｇ２的编码起始位点经基因突点突变导入ＮｃｏＩ限制性内切酶的位点后,重组到受异丙基硫代－β－Ｄ半乳糖苷诱导的ｐＴｒ９９Ｂ质粒上,使ａｒｇＳ比受体菌表达高近２０００倍。通过一步ＤＥＡＥ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ柱层析则可得到ＳＤＳ－ＰＡＧＥ一条带的ＡｒｇＲＳ,比活为１５０００ｕ／ｍｇ,与文献相同。     

一个高效表达,快速纯化大肠杆菌精氨酰—tRNA合成酶的 …

编码大肠杆菌精氨酸－ｔＲＮＡ合成酶的基因ａｒｇＳ被克隆到ｐＭＦＴ７－５载体上。将此质粒转化的大肠 力ＪＭ１０９（ＤＥ３）中,该转化子粗抽液的比活是宿主菌的２５００倍。通过ＤＥＡＥ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ－６Ｂ ＦａｓｔＦｌｏｗ和ＢｌｕｅＳｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ－６Ｂ两步柱层析在一天内即可将精氨酰－ｔＲＮＡ合成酶纯化至电泳一条带,比活为３６０００ｕ／ｍｇ,总收率可达６９％。     

大肠杆菌精氨酰—tRNA合成酶高表达条件的优化及酶…

控制培养基中氨苄青霉素的用量、ＰＨ和培养时间,从含Ｅ．ｃｏｌｉ ａｒｇｓ变种ＡＲＧＳ３８１ＫＡ的Ｅ．ｃｏｌｉ ＴＧ１转化子中,得到了Ｅ．ｃｏｌｉ ＡｒｇＲＳ变种ＡｒｇＲＳ３８１ＫＡ的高表达。从２升培养液中得到１５克湿菌体,粗抽液中ＡｒｇＲＳ３８１ＫＡ的比活为５０３单位／毫克。经过两次ＤＥＡＥ－Ｓｅｐｈａｃｅｌ柱层析,在４天时间内,可得到７８毫克电泳一条的纯酶,活力回收达８０％。该方法可以作为从含ａ     

大肠杆菌精氨酰－tRNA合成酶（ArgRS）及其变种的光谱学研究

本文用吸收光谱、溶剂微扰差光谱荧光光谱和ＣＤ光谱对天然酶ＡｒｇＲＳ及其变种酶ＡｒｇＲＳ３０６ＫＲ和ＡｒｇＲＳ３８１ＫＡ的构象进行了研究,结果表明Ｌｙｓ３０６的突变引起变种酶分子表面的生色氨基酸残基所处微环境与天然酶梢有不同,ＡｒｇＲＳ３０６ＫＡ比ＡｒｇＲＳ３０６ＫＲ有更大的构象变化。变种酶ＡｒｇＲＳ３８１ＫＡ与天然酶的构象差别不大。ＣＤ光谱的分析显示转角在变种酶分子中依活力的下降二级结构中所占百分比下降。可以得出结论ＡｒｇＲＳ的Ｌｙｓ３０６所带的正电荷对维系ＡｒｇＲＳ的构象绝对重要,这种酶的构象变化引起变种酶的活力丧失;而ＡｒｇＲＳ的Ｌｙｓ３８１的改变则似乎不能引起酶构象的可觉察的变化。     

大肠杆菌JM83精氨酰－tRNA合成酶基因的克隆、测序及表达

用聚合酶链反应（ＰＣＲ）以大肠杆菌ＪＭ８３基因组ＤＮＡ为模板,扩增了精氨酰－ｔＲＮＡ合成酶（ＡｒｇＲＳ）基因。将该基因重组到载体ｐＵＣ１８上转化到大肠杆菌ＴＧ１中,得到在转化子中ＡｒｇＲＳ的高表达。粗抽液中ＡｒｇＲＳ的氨酰化活力,ＴＧ１和ＴＧ１转化子分别为１．６５Ｕ／ｍｇ和２１０Ｕ／ｍｇ,后者为前者的１２７倍。ＤＮＡ顺序测定表明,与从大肠杆菌ＪＡ２００中克隆到的ＡｒｇＲＳ基因相比９１３位碱基为Ａ而不为Ｃ,这种变化使ＡｒｇＲＳ的３０５位氨基酸残基由Ｇｌｎ变为Ｌｙｓ,但这种改变不影响酶的活力。     

大肠杆菌精氨酰－tRNA合成酶高表达条件的优化及酶的纯化

控制培养基中氨苄青霉素的用量、ｐＨ和培养时间,从含Ｅ．ｃｏｌｉａｒｇｙ变种ａｒｇｒ３８１ＫＡ的Ｅ．ｃｏｌｉＴＧ１转化子中,得到了Ｅ．ｃｏｌｉＡｒｇＲＳ变种ＡｒｇＲＳ３８１ＫＡ的高表达。从２升培养液中得到１５克湿菌体,粗抽液中ＡｒｇＲＳ３８１ＫＡ的比活为５０３单位／毫克。经过两次ＤＥＡＥＳｅｐｈａｃｅｌ层析,在４天时间内,可得到７８毫克电泳一条带的纯酶活力回收达８０％。该方法可以作为从含ａｒｇｓ的Ｅ．ｃｏｌｉＴＧ１转化子中提纯Ｅ．ｃｏｌｉＡｒｓＲＳ的通用方法。     

大肠杆菌精氨酰－tRNA合成酶变种ArgRS381KA的基本性质

本文研究了Ｌｙｓ３８１变为Ａｌａ的精氨酰－ｔＲＮＡ合成酶（ＡｒｇＲＳ）变种ＡｒｇＲＳ３８１ＫＡ的最适ｐＨ和稳态动力学性质;比较了此酶与天然酶ＡｒｇＲＳ的荧光光谱性质和热稳定性。实验结果表明ＡｒｇＲＳ３８１ＫＡ的氨酰化活力和ＡＴＰ￣ＰＰｉ交换活力的最适ｐＨ分别为８．０和７．０,与天然酶相同;ＡｒｇＲＳ３８１ＫＡ的氨酰化活力对精氨酸、ＡＴＰ和ｔＲＮＡＡｒｇ的Ｋｍ分别为１２μｍｏｌ／Ｌ、０．３ｍｍｏｌ／Ｌ和１．１μｍｏｌ／Ｌ,Ｖｍａｘ为１６０００Ｕ／ｍｇ,ｋｃａｔ为１６ｓ－１;ＡＴＰ￣ＰＰｉ交换活力对精氨酸、ＡＴＰ和ＰＰｉ的Ｋｍ分别为９２．９μｍｏｌ／Ｌ、０．８５ｍｍｏｌ／Ｌ和８０．１μｍｏｌ／Ｌ,Ｖｍａｘ为２８０００～３００００Ｕ／ｍｇ,ｋｃａｔ为３２ｓ－１．ＡｒｇＲＳ３８１ＫＡ的荧光激发光谱和发射光谱与ＡｒｇＲＳ基本相同。热失活速度比天然酶慢。     

Biosynthesis and Characterization of 4-Fluorotryptophan-Labeled Escherichia coli Arginyl-tRNA Synthetase

Escherichia coli 4-fluorotryptophan-substituted arginyl-tRNA synthetase was biosynthetically prepared and purified from a tryptophan auxotroph which could overproduce this enzyme. A method was developed to separate 4-fluorotryptophan from tryptophan and to determine accurately their contents in the 4-fluorotryptophan-containing proteins. It was confirmed that more than 95% of the tryptophan residues in the purified 4-fluorotryptophan-substituted arginyl-tRNA synthetase were replaced by 4-fluorotryptophan. Studies on the effect of the 4-fluorotryptophan replacement on properties of the enzyme showed that, when compared with the native enzyme, both the specific activity and the first-order rate constant of the fluorinated enzyme decreased by approximately 20% with just slightly higher K _m values. CD studies, however, did not reveal any difference between the secondary structure of the native and fluorinated enzymes. In addition, thermal unfolding studies showed that the 4-fluorotryptophan replacement did not significantly affect the thermal stability of the enzyme. We may conclude that the substitution of 4-fluorotryptophan in arginyl-tRNA synthetase had no substantial effect on the structure and function of the enzyme. Finally, a preliminary study of ¹⁹F nuclear magnetic resonance spectroscopy of the fluorinated enzyme has shown promising prospect for further investigation of its structure and function with NMR.     

N端的改变对大肠杆菌精氨酰—tRNA合成酶的影响

得到了缺失Asn2 的大肠杆菌 (E .coli)精氨酰 tRNA合成酶 (ArgRS)的变种和在其N端添加酵母ArgRS的N端 2 3个氨基酸残基的嵌合变种。它们的基因在大肠杆菌中表达时 ,可能由于蛋白质误折叠 ,大部分产生了包涵体。与天然酶相比 ,缺失变种保留了全部的氨基酸活化活力 ,但氨基酰化活力下降了 2 6 % ;嵌合变种的以上两种活力下降了 90 %以上 ,不能氨基酰化酵母tRNAArg。缺失Asn2 和Ile3 的变种在E .coli中虽被表达 ,但不稳定。与天然酶相比 ,嵌合变种的荧光光谱的最大发射波长向长波移动 ,强度减小。表明变种酶的构象和天然酶不同 ,色氨酸更暴露。用远紫外CD光谱预测变种酶的二级结构表明 ,嵌合酶的α螺旋更少 ,β折叠更多 ,无规卷曲稍多。E .coliArgRS的N端结构域对活力和正确折叠是重要的     

大肠杆菌亮氨酰－tRNA合成酶基因的克隆和鉴定

本文根据遗传互补原理,利用大肠杆菌亮氨酰－ｔＲＮＡ合成酶基因（ｌｅｎＳ）的温度敏感突变株ＫＬ２３１,从大肠杆菌基因文库一克隆（λ１５Ｄ７）中筛选出带完整ｌｅｕＳ基因的ＤＮＡ片段。该片段长度为３．２ｋｂ。对此片段做了１４种限制性内切酶图谱分析和部分ＤＮＡ序列鉴定,并与文献报道的ｌｅｎＳ基因序列进行了比较。发现在编码区和３’端非编码区各有一对碱基发生了转换。另外在３’端非编码区有一对碱基缺失。编码区的碱基对转换导致编码的氨基酸由组氨酸变成了精氨酸。带有ｌｅｎＳ基因的质粒（ｐＬｅｕＳ９１）转入大肠杆菌ＴＧＩ菌株中,测得转化子的亮氨酰－ｔＲＮＡ合成酶比活力是ＴＧ１菌株的１０倍以上。     

大肠杆菌精氨酰tRNA合成酶基因（argS）的上游非编码区存在一个负调控区

含大肠杆菌精氨酰tRNA合成酶（ArgRS）基因(argS）的pUC18重组质粒,在大肠杆菌TG1转化子中能够高表达ArgRS近1000倍。为了研究大肠杆菌argS的表达调控,构建了一系列的缺失突变。分别缺失全部上游序列（argS△1）、Shine-Dalgarno（SD）区（argS△2）和缺失启动子－10区下游（相当于翻译起始位点－65nt,argS△3）前的上游序列后的变种argS都不能表达ArgRS。而缺失－122nt（距翻译起始位点－180nt,argS△8）、－70nt（距翻译起始位点－128nt,argS△7）、－52nt（距翻译起始位点－110nt,argS△6）、－35区9距翻译起始位点－94nt,argS△5）、启动子－10区（距翻译起始位点－71nt,argS△4）前的上游序列后,这些缺失突变基因的表达水平与野生型argS接近。但argS△4、argS△5、argS△6都会形成部分包涵体。通过RNA斑点杂交测定发现,argS△4、argS△5和argS△6的mRNA转录量为argS及argS△7的2到3倍。即－52nt和－70nt之间的19个碱基（AATAGTGAAAACGGCAATA)可能是大肠杆菌argS舞场康负调控区。该元件的缺失将使得ArgRS过快表达并导致部分蛋白质形成包涵体。凝胶阻滞分析也发现在细胞粗抽液中有一个因子可以专一地与这个负调控元件结合,它可能参与该基因的表达调控。精氨酸专一性地诱导argS的转录,其作用与上述转录负调控区相关。