靶向性DNA甲基化酶在pET32a原核表达载体中的表达和鉴定

目的:在pET32a原核表达载体中表达融合myc-6his标签的靶向性甲基化酶B1-3a并进行鉴定。方法:以含有B1-3a基因的pcDNA4.0-B1-3a-myc-6his质粒为模板,通过PCR的方法扩增获得融合有myc-6his标签序列的目的区段B1-3a,然后克隆入表达载体pET32a;以SDS-PAGE和Western blot方法对表达产物进行鉴定。结果:表达产物中在分子量43kD左右可见与目的蛋白分子量相符的条带,该条带可被6his标签单克隆抗体特异识别。结论:正确构建了靶向性甲基化酶B1-3a的原核表达载体,靶向性甲基化酶能够在pET32a中成功表达。     

靶向性DNA甲基化酶在毕赤酵母中的表达和鉴定

目的：在毕赤酵母中表达融合Myc—His标签的靶向性甲基化酶B1—3a并进行鉴定。方法：以含有B1—3a基因的pcDNA4．0-myc／his质粒为模板,通过PCR扩增获得融合有myc／his标签序列的目的区段B1—3a基因,然后克隆入表达载体pPIC3-5k;电穿孔转化毕赤酵母菌株GS115,经G418筛选后进行甲醇诱导表达,并以SDS—PAGE和Western印迹对表达产物进行鉴定。结果：表达产物中可见与目的蛋白相对分子质量（50000）相符的条带,该条带可被Myc标签单克隆抗体特异识别。结论：正确构建了靶向性甲基化酶Bl-3a的酵母表达载体,靶向性甲基化酶能够在毕赤酵母中成功表达。     

带myc标签的人造血相关PBX相互作用蛋白真核表达载体的构建及其功能研究

目的:构建带myc标签的造血相关PBX相互作用蛋白(HPIP)的真核表达载体,获得myc-HPIP融合蛋白,并对其生物学功能进行初步检测。方法:以本实验室保存的pcDNA3.0-HPIP质粒为模板,采用PCR技术扩增HPIP编码序列,将其插入pXJ-40-myc载体,通过Western印迹检测表达情况;将重组质粒与空载体分别转染人肝癌HepG2细胞,通过Western印迹检测其对AKT、ERK信号通路中AKT、ERK磷酸化水平的影响。结果:双酶切和测序结果表明myc-HPIP真核表达质粒构建成功,转染HepG2细胞后表达了myc-HPIP融合蛋白;Western印迹证明myc-HPIP可升高AKT、ERK的磷酸化水平。结论:构建了带myc标签的人HPIP真核表达载体,为进一步研究HPIP在肿瘤发生发展中的功能奠定了基础。     

Flag标签MORC2-677丝氨酸位点突变载体构建及表达

构建Flag标签pcDNA3.1-MORC2的677丝氨酸位点突变重组质粒并完成在SGC-7901细胞中表达,更好地研究677丝氨酸位点所发生的功能.首先,构建含有KpnⅠ和XhoⅠ酶切位点Flag标签的pcDNA3.1空载体;再以含有KpnⅠ和XhoⅠ酶切位点的pcDNA3.1A-MORC2-WT野生型质粒为模板,在S677突变位点两侧设计重叠突变引物,进行三轮重叠延伸PCR完成定点突变,获得MORC2全长编码序列的S677位点的定点突变体载体(pcDNA3.1A-MORC2-S677A/S677E);再通过KpnⅠ和XhoⅠ酶切把pcDNA3.1A-MORC2-WT/S677A/S677E各载体定向克隆到已构建好的pcDNA3.1-Flag空载体中,酶切鉴定及测序正确后,转染到SGC-7901细胞中,利用Flag–标签抗体,Western blot检测其各突变载体的表达.成功构建了人Flag标签MORC2全长编码序列S677位点突变体真核表达载体并在SGC-7901细胞中获得带Flag标签融合蛋白表达产物,为进一步研究MORC2的功能奠定了基础.     

pcDNA3.1(-)-Bcr-Abl及pcDNA 3.1(-)-Bcr-Abl T3151突变质粒真核表达载体的构建

目的:将Bcr-Abl及Bcr-Abl T3151突变克隆入pcDNA3.1(-)真核表达载体,为研究靶向降解受体型酪氨酸激酶BCR-Abl,抑制肿瘤细胞生长提供研究基础.方法:pcDNA3.1 (-)-Bcr-Abl质粒构建:分别设计引物,通过分段PCR将BCR-ABL克隆入pcDNA3.1(-).首先通过PCR扩增出Bcr-a片段,将其克隆入pcDNA3.1(-)的NheⅠ/XhoⅠ之间;接着将PCR扩增出的Abl-c片段克隆入KpnⅠ/ HindⅢ之间,最后XhoⅠ/KpnⅠ双酶切pGD210,将酶切下片段插入pcDNA3.1(-)的相应位点即可.酶切鉴定及测序正确后,转染293T细胞,Western blot验证质粒的表达.pcDNA 3.1(-)-Bcr-Abl T3151的突变质粒:首先设计引物,第一步以pcDNA3.1(-)-BCR/ABL为模板,以Abl-c-u和ba-M1为引物扩增出A-1:560 bp.第二步,相同模板,以ba-M2和ba-M-down为引物扩增出A-2:870 bp.第三步,以扩增出的A-1和A-2为模板,以Abl-c-u和ba-M-down为引物,扩增出1434 bp的片段A-l+2,以Bcl和Kpn Ⅰ分别酶切pcDNA3.1 (-)-BCR/ABL以及A-1+2,将突变后的A-l+2置换入pcDNA3.1 (-)-BCR/ABL.结果:PCR结果显示3.1(-)-Bcr-Abl及3.1 (-)-Bcr-Abl T3151突变质粒条带大小符合,重组质粒经酶切鉴定和测序结果正确,转染后可见融合蛋白的表达.结论:成功构建pcDNA3.1 (-)-Bcr-Abl及pcDNA 3.1(-)-Bcr-Abl T3151的真核表达载体,并且转染293T细胞后证实其能够正确表达,为后续研究奠定了基础.     

人自噬相关基因12真核表达载体的构建及表达

目的:构建带myc标签的自噬相关基因12(ATG12)的真核表达载体,获得myc-ATG12融合蛋白。方法:以人乳腺文库为模板,采用PCR技术扩增人ATG12编码序列,将其插入p XJ-40-myc载体构建重组质粒,转染人胚肾293T细胞,Western印迹检测表达情况;将重组质粒与ATG3表达质粒共转染293T细胞,免疫共沉淀法检测二者的相互作用。结果:myc-ATG12真核表达质粒构建成功,转染293T细胞后融合蛋白获得表达,其相对分子质量约17×103,可与Flag-ATG3结合。结论:构建并表达了带myc标签的人ATG12真核表达载体,为进一步研究ATG12在自噬中的功能奠定了基础。     

人FOXO3a基因真核表达载体的构建及其功能验证

目的:构建带myc标签的人FOXO3a基因真核表达载体,并对其功能进行初步检测。方法:采用PCR技术,从乳腺文库中扩增人FOXO3a基因,并将其正确插入pXJ-40-myc载体;将重组质粒与空载体分别转染人乳腺癌细胞系ZR75-1、MCF-7后,通过Western印迹检测其表达情况,并用CCK8法测定细胞生长曲线。结果:双酶切和测序鉴定表明myc-FOXO3a真核表达质粒构建成功,转染乳腺癌ZR75-1、MCF-7细胞后目的基因成功表达;细胞生长曲线结果显示,转染myc-FOXO3a的乳腺癌细胞较空载体细胞生长较慢。结论:构建了带myc标签的人FOXO3a基因真核表达载体,为进一步研究FOXO3a在乳腺癌中的功能奠定了基础。     

人类3-磷酸甘油醛脱氢酶的原核表达、纯化和鉴定

为了研究3-磷酸甘油醛脱氧酶(GAPDH)化生物学功能,以pcDNA3.1-GAPDH质粒为模板,PCR方法扩增GAPDH基因,经BamHI和SalI双酶切后插入相同酶切的pET32a(+)载体,构建His-GAPDH融合蛋白表达质粒pET32a(+)-GAPDH;转化JM109感受态细胞,并进行阳性克隆筛选,扩增目的质粒;转化大肠杆菌BL21菌株,经IPTG诱导产生融合蛋白,亲和层析柱纯化后,用SDS-PAGE和Western blotting检测GAPDH蛋白表达情况.结果表明,构建的人GAPDH基因表达载体经序列测定证实,与GenBank数据完全一致;双酶切鉴定证实,克隆基因正确插入pET32a(+)载体;表达质粒pET32a(+)-GAPDH在大肠杆菌BL21中成功地诱导表达了可溶性His-GAPDH融合蛋白,纯化后SDS-PAGE和Western blotting检测证实融合蛋白表达成功.人GAPDH原核表达载体的成功构建,及6His-GAPDH融合蛋白的正确表达,为进一步深入研究GAPDH的生物学功能奠定了基础.     

人sTNFR1基因的克隆以及在NIH3T3细胞中的稳定表达

以He1a细胞的总RNA为模板,用RT—PCR方法扩增sTNFR1全编码区基因片段,构建含有目的片段的T载体克隆及真核表达载体pcDNA3．1（-）重组质粒亚克隆,将重组质粒和脂质体共同转染NIH3T3细胞系,G418筛选稳定转染细胞株．经核苷酸序列测序和酶切鉴定,成功构建了pcDNA3．1（-）-sTNFR1真核表达质粒,脂质体法建立了高效表达sTNFRI的稳定转染细胞系,并经RT—PCR和Western Blotting鉴定．人sTNFR1基因能在NIH3T3细胞系中稳定表达,为今后的研究打下了基础．     

人激活转录因子5基因真核表达载体的构建及其生物学功能研究

目的:构建带myc标签的人激活转录因子5(ATF5)的真核表达载体,获得myc-ATF5融合蛋白,并对其生物学功能进行初步检测。方法:以本实验室保存的带有XL5标签的ATF5质粒为模板,采用PCR技术扩增ATF5编码序列,将其插入pXJ-40-myc载体中,Western印迹检测其表达;将重组质粒与空载体分别转染人胚肾293T细胞,通过Western印迹和qRT-PCR检测其下游基因哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)在蛋白和mRNA水平的变化。结果:双酶切和测序结果表明myc-ATF5真核表达质粒构建成功,转染293T细胞后获得表达;Western印迹和qRT-PCR证明myc-ATF5可升高mTOR的转录和蛋白水平。结论:构建了带myc标签的人ATF5真核表达载体,为进一步研究ATF5在自噬中的功能奠定了基础。     

重组肾上腺髓质素表达载体的构建及在哺乳动物细胞中的表达

为探索通过体内表达肾上腺髓质素（adrenomedullin,AM）治疗高血压和慢性心衰的可能性,本实验构建了重组AM真核表达载体,并在无内源笥AM表达的K562细胞株上进行了体外表达实验。实验中采用RT－PCR技术扩增AM cDNA片段,并将扩增的cDNA片段插入pcDNA3.1真核表达质粒,构建成含AM cDNA的重组质料pcDNA3.1AM。用脂质体介导将该质粒转染培养的人白血病细腻K562株,在转染的细胞中,用RT－PCR检测证实有AM mRNA存在;用班点免疫分析方法检测转染细胞的培养液上清,证实有AM多肽存在,表明本实验中构建的重组pcDNA3.1AM载体能够在哺乳类细胞中表达AM。     

真核表达载体pcDNA3.1(-)+KG的构建及在HeLa细胞中的表达

为了将绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)引入细胞核内,采用两轮PCR方法从原先克隆在pcD-NA3.1(-)+GFP载体中将GFP编码序列扩增出来并引入Kozak序列和核定位信号,使用常规酶切和连接方法将其重组至pUCm-T克隆载体中,再将目的片段重组至pcDNA3.1(-)中,对阳性克隆进行酶切、PCR和测序鉴定后,构建了带有Kozak序列和核定位信号的绿色荧光蛋白(GFP)真核表达载体pcDNA3.1(-)+KG。真核表达载体pcDNA3.1(-)+KG被转染试剂Su-perfect转染至HeLa细胞中,绿色荧光蛋白基因在HeLa细胞中得到表达而且在细胞核中观察到绿色荧光。该研究以绿色荧光蛋白为标记初步建立了活体观察真核细胞核动态变化的研究体系。     

小鼠胰岛素样生长因子结合蛋白-7真核表达载体的构建及序列分析

利用PCR技术,从质粒pRSET／mIGFBP-7中获得目的基因小鼠胰岛素样生长因子结合蛋白-7（mIGFBP-7）,将其插入质粒pcDNA3．1／HisB中,构建了含mIGFBP-7的真核表达重组质粒pcDNA3．1／mIGFBP-7。经测序鉴定,重组质粒构建正确,为下一步对其功能研究奠定了基础。     

Construction of a full-length iASPP expression plasmid pcDNA3.1(+)/iASPP and its biological activity

In order to obtain a full-length expression plasmid for the p53 inhibitor protein, iASPP, fractional amplification was used to clone its full-length coding sequence (CDS) region. The amplified PCR product was then digested and inserted into the pMD19-T simple vector and subcloned into the pCDNA3.1(+) vector. A recombinant eukaryotic expression vector containing the complete CDS region of iASPP was successfully constructed. pcDNA3.1(+)/iASPP was able to express iASPP protein in an in vitro translation system and in cells. Its biological activity was verified using Western blotting, immunoprecipitation and cell apoptosis analysis. This successful preparation of a full-length iASPP expression plasmid lays the foundations for further studies on the function of iASPP.     

pcDNA3.1(+)-VEGF165载体的构建及表达蛋白特性分析

构建含人VEGF165基因的重组真核表达质粒,并对其表达蛋白特性进行初步分析。将合成的VEGF165基因序列克隆至pCR2.1-TOPO载体,测序鉴定证实基因碱基序列无误后,再克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+),构建成pcD-NA3.1(+)-VEGF165重组质粒。利用DNAstar软件分析基因序列并翻译成氨基酸序列,再用ExPASy protscale和Protean软件分析其疏水特性、蛋白二级结构。经基因测序、酶切鉴定和PCR鉴定证实pcDNA3.1(+)-VEGF165重组质粒构建成功。Ex-PASy protscale和Protean软件分析表明VEGF165蛋白具有较好的水溶性。本研究为VEGF165的基因治疗应用和VEGF165蛋白直接治疗勃起功能障碍奠定了基础。     

真核表达载体pcDNA3.1-myc-his(-)B的改构与应用

目的:对真核表达载体pcDNA3.1-myc-his(-)B进行改构,以简化目的基因克隆的步骤。方法:用事先设计好的2条寡核苷酸链互相退火,替换pcDNA3.1-myc-his(-)B的多克隆位点中NotⅠ与HindⅢ间的部分;利用改构的真核表达载体,分别构建亲环蛋白A、胆绿素还原酶B和过氧化氢酶基因的重组真核表达载体,瞬时转染293T细胞后,用His标签抗体验证其表达。结果:测序结果证实已将预想的序列替换至pcDNA3.1-myc-his(-)B的多克隆位点中相应位置,改构为质粒pcDNA3.1(-)reconstruct;利用改构的真核表达载体表达了相应的目的基因。结论:改构的真核表达载体pcDNA3.1(-)reconstruct可以简化融合myc和His标签的目的基因克隆的过程,并且增加了限制性位点的可选择性。     

pcDNA3.1（＋）-LYVE-1真核表达质粒的构建及其在COS-7细胞中的表达

目的 构建人淋巴管内皮细胞特异标志物LYVE-1融合基因表达质粒,观察其在COS-7细胞中的表达,为进一步探讨该标志物在肿瘤淋巴转移中的作用提供工具.方法 从本院结肠癌根治术患者术所取组织中的淋巴结抽提总RNA,RT-PCR扩增LYVE-1基因片段,并将其插入pMD19-T Simple Vector进行测序,鉴定正确后构建pcDNA3.1（＋）-LYVE-1并转染COS-7细胞,RT-PCR、Western印迹检测目的 蛋白表达,间接免疫荧光检测该基因表达在COS-7细胞上.结果 成功获取了人淋巴管内皮细胞特异标志物LYVE-1全长cDNA,构建了其真核表达载体pcDNA3.1（＋）-LYVE-1,转染COS-7细胞后检测出目的 蛋白的表达,并且证明该基因表达在细胞上.结论 成功构建了pcDNA3.1（＋）-LYVE-1重组质粒,为进一步研究LYVE-1在肿瘤淋巴管转移中的功能提供了重要的实验材料.     

pcDNA3．1表达载体转染对细胞生长的影响

为了探讨真核表达载体转染对细胞生长的影响,通过脂质体介导将pcDNA3.1( )表达载体DNA转染鼻咽癌细胞系HNE1,G418筛选后,Southern杂交鉴定稳定表达细胞株,以HNE1细胞为对照,观察pcDNA3.1( ）／HNE1克隆细胞的生物学特性;结果显示,在pcDNA3.1( )/HNE1阳性克隆中,一株细胞克隆培养过程中发生自溶性死亡,一株细胞生长明显受到抑制,另一株细胞生长无明显影响,揭示在宿主细胞中pcDNA3.1( )DNA与宿主基因组DNA发生了随机整合,从而表现不同的细胞生物学改变。     

pcDNA3.1(+)-CTGF真核表达质粒构建及其在人成骨样细胞SaOS-2细胞中的表达*

目的:构建结缔组织生长因子(CTGF)的pcDNA3.1(+)真核表达质粒(pcDNA3.1(+)-CTGF),并检测其在人成骨样细胞SaOS-2中的表达,为进一步研究CTGF基因在骨发育和骨修复中的机制提供技术支撑。方法:采用PCR方法体外克隆CTGF基因全序列,将其用同源重组技术连接到线性pcDNA3.1(+)载体上,构建pcDNA3.1(+)-CTGF真核表达质粒,并对该质粒进行测序鉴定;鉴定无误后转染至SaOS-2细胞中,观察其48 h的表达情况。结果:基因测序证实pcDNA3.1(+)-CTGF真核表达重组质粒构建成功,与对照组相比,转染SaOS-2细胞48 h后的CTGF表达水平显著上调,达到对照组的4.8×10⁵倍(P＜0.01)。结论:成功构建了pcDNA3.1(+)-CTGF真核表达质粒,并能在人成骨样细胞SaOS-2中稳定表达,为深入研究CTGF基因对骨生成的调控机制奠定了基础。