人禽流感H7N9、H5N1、H10N8临床特征

人禽流感(human-avian influenza)是一种由禽流感病毒中某些亚型感染人所引起的急性呼吸道传染病,目前能够感染人的禽流感病毒主要有H5、H7、H9和H10亚型。人感染禽流感病毒A(H5N1)、A(H7N9)、A(H10N8)与重症季节性流感临床表现相似,主要表现为重症肺炎,病死率高。人禽流感与重症季节性流感和重症新甲型H1N1流感患者有相同的危险因素,如高龄、合并基础疾病等,但人禽流感临床表现更重。     

H7亚型禽流感病毒与禽类和人类的关系

2013年在中国首次发生了H7N9亚型流感病毒感染人事件,已经证实H7N9型禽流感是一种新型禽流感,是全球首次发现感染人类的新亚型流感病毒,以往这种病毒只在野生鸟类存在和传播。H7N9型禽流感病毒属于H7亚型中的一种,全球感染人的H7亚型病毒主要分为两大支系,即北美支系和欧亚支系,感染人的流感亚型也主要集中在H7N7,H7N3,H7N2等亚型上。为了清晰的了解H7亚型病毒的来龙去脉,本文重点讨论了A亚型流感病毒的宿主分布、H7亚型病毒感染禽类和人类的历史、H7亚型病毒的生物学特性以及未来研究展望。     

禽流感病毒基因的密码子偏好性及聚类分析

目的:研究禽流感病毒基因的密码子偏好性及进化关系,为禽流感的防控和疫苗开发提供理论基础。方法:运用多种生物信息学分析软件,对17种流感亚型病毒基因进行密码子偏好性及聚类分析。结果:H7N9亚型禽流感病毒基因偏好使用UUC、CUU、CUC、AUA、UCU、ACU、CAA和UGC等8个密码子。聚类分析表明,H7N9病毒与H7N3、H5N1、H9N2、H11N9病毒的亲缘关系最近;不同年份的H7N9亚型禽流感病毒中,H7N9(2013)病毒与H7N9(2009)病毒的亲缘关系最近,而与其他年份发生的H7N9病毒的亲缘关系均较远。结论:H7N9亚型禽流感病毒在碱基组成上偏爱使用以A或U结尾的密码子,具有独特的密码子使用特性;H7N9(2013)病毒并不是起源于以往发生过的H7N9病毒的突变,而是随病毒进化出现的新重配病毒。     

利用焦磷酸测序技术检测H7N9禽流感病毒NA基因分子标签

本研究旨在建立H7N9亚型禽流感病毒NA基因分子标签的焦磷酸测序检测方法,用于H7N9型禽流感病毒的快速检测和鉴定。通过对公开发表的H7N9亚型禽流感病毒NA基因序列进行比对,发现分离株在NA基因特定区域缺失的15个核苷酸可作为H7N9亚型禽流感病毒NA基因特异性的分子标签。通过设计覆盖此区域的特异性扩增引物和测序引物,建立了H7N9型禽流感病毒NA基因焦磷酸测序检测方法。基于NA基因特定缺失区域建立的焦磷酸测序技术能用于H7N9亚型禽流感病毒国内分离株NA基因的快速检测和鉴定,且具有较好的特异性和重复性。通过对3株H7N9亚型禽流感病毒分离株的检测,表明3株H7N9亚型禽流感病毒的NA基因均存在15个核苷酸缺失的分子标签。本研究建立的H7N9亚型禽流感病毒NA焦磷酸测序检测方法,可用于H7N9禽流感病毒的检测和鉴定。     

新型H7N9亚型禽流感病毒多重荧光RT-PCR快速检测方法的建立

为研制新型H7N9亚型禽流感病毒快速检测试剂盒,根据GenBank中公布的新型H7N9亚型(2013年)禽流感病毒血凝素抗原(HA)和神经氨酸酶抗原(NA)的基因序列,设计两套特异性的引物和探针,建立基于TaqMan探针的多重荧光RT-PCR快速检测新型H7N9亚型禽流感病毒方法。实验结果表明,该方法灵敏度高、特异性好,能够检测到最低浓度为10拷贝/μL数量级的阳性标准品,不但能够将禽流感病毒H7亚型与H1、H3、H5、H6和H9亚型区分开,而且可将新型N9亚型禽流感病毒与原有的N9亚型区分开。采用该方法对珠海市2 700份样品的检测结果与预期结果一致,证实该方法具有较好的推广应用前景。     

近年来华东地区家鸭中禽流感病毒的亚型分布

[目的]为了研究近年来华东地区家鸭中禽流感病毒的亚型分布情况.[方法]对2002-2006年分离自华东地区家鸭的180株禽流感病毒的HA亚型和其中88株禽流感病毒的NA亚型分别进行了测定.[结果]近年来华东地区家鸭中至少存在9种HA亚型和6种NA亚型组成的H1N1,H3N1,H3N2,H3N8,H4N6,H5N1,H5N2,H6N2,H6N8,H8N4,H9N2,H10N3,H11N2共13种亚型的禽流感病毒.[结论]华东地区家鸭中有多种亚型的禽流感病毒分布,应加强家鸭禽流感的监测和防制工作.     

禽流感病毒与人禽流感的研究进展

禽流感病毒(AIV)与甲型流感病毒同属正黏病毒科(Orthonuxoviridae).迄今根据血凝素H,共有16个亚型,神经氨酸酶N共有9个亚型,可组成144种亚型.虽然H1～16均存在于禽中,但迄今已报道可直接感染人的AIV为H5、H7、H9及H10.其中1997年香港特区流行的亚型是H5N1,有18例患者,6例死亡.1999、2000、2004年在中国内地及香港特区感染人的AIV主要是H9N2亚型.有报道,H7N2、H7N3、H7N7、H10N7亚型分别曾在荷兰、美国、加拿大、埃及感染人,但病例数少,且未有患者死亡.     

H7N9亚型禽流感病毒非结构蛋白1(NS1)基因序列分析及2013上海分离株NS1的原核表达

目的:对2013年3月发生的感染人的新型H7N9亚型禽流感病毒的非结构蛋白1(NS1)基因序列进行同源性分析,构建NS1重组质粒并表达。方法:从GenBank获得2006~2013年不同来源的H7N9亚型病毒NS1序列,并进行同源性比较;利用PCR方法从H7N9亚型禽流感病毒株A/Shanghai/4664T/2013(H7N9)基因组cDNA中扩增得到全长NS1基因,并将该片段定向克隆到原核表达载体pET28a上,构建重组质粒pET28a-NS1,经酶切鉴定,将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞后,IPTG诱导表达,且进行Western印迹分析。结果:经序列分析,2013年暴发的H7N9型禽流感病毒的NS1基因核苷酸序列同源性为95%~100%,与之前暴发的H7N9型流感病毒NS1基因序列的同源性为86.4%~90.7%,表明2次暴发的该型流感分离株属于不同的进化分支;PCR扩增得到约680 bp的NS1基因序列,所克隆的NS1基因在原核细胞中的表达产物主要以包涵体形式存在,SDS-PAGE检测结果表明重组蛋白相对分子质量为25×103,Western印迹分析证实表达产物为H7N9禽流感病毒NS1蛋白。结论:为进一步研究H7N9亚型流感病毒NS1蛋白功能及基于NS1蛋白的抗病毒药物奠定了基础。     

H3亚型鸭源流感病毒聚合酶PB1基因的序列分析

目的阐明H3亚型鸭流感病毒与其他亚型流感病毒的关系。方法对活禽市场分离的3株H3N8亚型鸭源流感病毒聚合酶PB1基因进行了序列分析。结果3株鸭源H3N8流感病毒聚合酶PB1基因核苷酸同源性为99.9%,与H9N2亚型流感病毒(DK/ST/2143/00)的同源性为96.31%~96.44%,而与H3N8亚型鸭流感病毒(Mal/Alberta/279/98)为88.65%~88.79%。系统进化树分析表明,本实验中的3株病毒属于相同的分支,且与A/duck/Hong Kong/Y439为代表的H9N2亚型禽流感病毒位于一进化分支,说明三株H3N8亚型流感病毒重排了H9N2亚型禽流感病毒的基因片段。结论不同亚型禽流感病毒在贮存宿主体内的重排以及重排病毒的新特点如鸭H3N8亚型流感病毒对禽的致病性,应当引起我们的高度重视。     

一种更灵敏的特异性检测H9亚型禽流感抗体的间接ELISA方法的建立

H9亚型禽流感在全球范围内广泛流行,控制其传播需监测H9亚型禽流感病毒的感染情况及疫苗的免疫效果。为了建立便于检测且灵敏特异的H9亚型禽流感抗体间接ELISA方法,本实验利用不同亚型之间变异较大的H9亚型禽流感病毒HA蛋白的头部球状区作为包被抗原,确定了最佳复合封闭液和抗体稀释液,提高了其特异性。结果显示建立的ELISA方法灵敏度高于血凝抑制试验(HI),且与H3N2、H5N2、H7N9亚型流感病毒及新城疫病毒(NDV)、鸡传染性支气管炎病毒(IBV)、鸡传染性法氏囊病毒(IBDV)和产蛋下降综合征病毒(EDSV)的阳性血清均无交叉反应。另外,利用该方法及HI试验对200份临床鸡血清样本进行检测,两种检测方法的符合率达97%,且存在较高的相关性(R2=0.981 1)。     

H7N9禽流感病毒与其他流感病毒对雪貂致病性与传播力的比较

目的针对2013年3月中国爆发的人感染H7N9禽流感病毒,在雪貂体内进行致病性及传播力的研究,并与甲型H1N1流感病毒、H5N1禽流感病毒进行比较。方法对新发H7N9毒株、甲型H1N1流感病毒、H5N1禽流感病毒感染雪貂后的临床症状、体征,呼吸道排毒情况,组织病理学变化等进行评价和比较,并对H7N9毒株在雪貂群体中的传播力进行研究。结果雪貂模型的临床症状、死亡率、病毒传播以及组织病理学分析显示:H7N9病毒的致病性低于H5N1,与2009年起源于北美的甲型H1N1流感病毒相当。新发H7N9禽流感病毒可以在雪貂的呼吸道、心脏、肝脏以及嗅球进行复制。值得注意的是H7N9禽流感可以通过飞沫在雪貂间进行低水平的传播,并且在传播过程中,病毒基因组内有多个位点的氨基酸发生了替换。结论 H7N9禽流感病毒对雪貂的致病性较H5N1禽流感病毒低,与甲型H1N1流感病毒对雪貂的致病性相当,H7N9禽流感病毒可在雪貂间进行传播。     

我国H9N2亚型禽流感病毒的流行和进化特点

H9N2亚型禽流感病毒(AIV)于1966年从北美的火鸡群中首次被分离以来。自20世纪90年代以来,H9N2病毒已经在世界多个国家和地区发展成地方流行并形成了稳定的种系,是当前禽流感流行的主要亚型之一,严重危害养禽业的发展。此外,H9N2亚型AIV也可以感染猪,甚至能够直接感染人,具有重要的公共卫生意义。H9N2亚型AIV还可以为H5N1、H7N9以及H10N8等能够直接感染人并致死的AIV提供部分甚至整套内部基因,潜在危害备受关注。对H9N2亚型AIV在我国的流行和进化特点进行了简要综述。     

禽流感病毒H9N2在人肺组织的复制

禽流感病毒H9N2亚型在多种陆禽流行并反复感染哺乳动物猪和人,其对公共卫生安全呈潜在巨大威胁。本文应用体外禽流感病毒H9N2亚型感染人肺组织和免疫组化实验,探讨禽流感病毒H9N2亚型跨种间感染人的机制、H9N2病毒在人肺组织复制特性及组织嗜性。结果显示,禽流感病毒H9N2亚型(Ck/GX/1875/04、Ck/GX/187/05)和季节性人流感病毒H3N2亚型(A/ST/602/05)均可感染人肺组织;免疫组化检测流感病毒核蛋白(Nucleoprotein,NP),病毒复制的主要靶细胞为肺泡细胞、呼吸细支气管上皮细胞和细支气管上皮细胞;免疫组化和免疫荧光双重染色法检测流感病毒感染肺泡类型,禽流感病毒H9N2亚型感染II型肺泡细胞。结果提示,禽流感病毒H9N2可适应宿主人以及在人肺上皮细胞有效复制,病毒持续感染人有助于病毒基因进化进而演变成大流行新型流感病毒的潜能。     

甲型N9亚型流感病毒神经氨酸酶基因进化分析

通过对甲型N9亚型流感病毒神经氨酸酶(NA)核苷酸进化趋势的研究,进而探寻2013年新型H7N9亚型禽流感病毒产生的根源。本次研究选取美国国立生物技术信息中心(NCBI)的甲型N9亚型流感病毒的NA序列,采用生物软件ClustalX 2.0和MEGA 6.0建立进化树形图。对其欧亚分支,采用BEAST软件2.1.2和Datamonkey interface在线软件,计算和分析选择压力和进化速率。采用Bioedit软件对NA的氨基酸置换熵值计算并分析。系统进化树表明2013年新型H7N9亚型禽流感病毒可划分至现代欧亚分支之内,并且该分支的每位点每年核苷酸置换速率均值为3.8354×10-3,选择压力dN/dS均值为0.140413。16、19、40、53、81、84、112、256、335、359和401的氨基酸变异位点熵值0.5。研究分析表明2013年新型H7N9亚型禽流感病毒的NA片段基因可能来自甲型N9亚型流感病毒逐步进化的结果,最早可追溯到1996年的A/duck/Siberia/700/1996(H11N9)流感毒株,新型H7N9亚型禽流感病毒来源不是来自外界环境压力引起突变的结果。     

人感染H7亚型禽流感事件

本研究综述了自1959年以来国内外发生的人感染H7亚型禽流感事件。大多数是在家禽爆发禽流感期间,农场工人在处置感染鸡群过程中被暴露而感染;也有曾接触活禽或曾到过活禽市场而感染;有经禽流感病毒致病的哺乳动物（海豹）感染于人或实验室感染（事故）所致。引起人感染的H7亚型中已知有H7N2、H7N3、H7N7以及2013年在中国发现的新的致病亚型H7N9。H7N2、H7N3、H7N7感染以结膜炎为主,大多为轻症;而H7N9感染以严重的呼吸道感染为特征,表现为重症肺炎,呼吸窘迫综合症,病死率高达33.6%。     

2012-2015年广东省活禽市场外环境禽流感病毒污染状况研究

研究广东省活禽市场外环境禽流感病毒污染状况并及时发现人流感发病潜在的危险因素,为人流感防治提供科学参考依据。应用传染病技术监测平台信息管理系统数据,采用描述性流行病学方法分析各种亚型病毒感染的流行病学特征,研究2012-2015年广东省活禽市场外环境禽流感病毒污染。共采集检测广东省21个地市级样本33079份,FluA 总阳性率为24．23％,H5、H7和 H9型高致病性禽流感病毒阳性率分别为3．70％、3．89％和13．53％;除2012年阳性率呈现季节性增加外,其他年份 FluA 核酸检测阳性率均在冬春季出现一个高峰。不同部位或地点采集的标本中,宰杀或摆放禽肉案板表面阳性率最高（FluA39．49％,H58．41％,H77．41％,H923．84％）,而采集的粪便标本阳性率最低（FluA14．99％,H51．73％、H72．38％、和 H97．23％）;所采集的标本所对应的相关动物种类中,鸡（64．08％）、鸭（55．84％）和鸟类（51．92％）的禽流感病毒阳性率都达到50％以上,H5、H7和 H9在各禽类中均可以检出。同时发现,在环境中检出 H7亚型多的地区分布与其相应地区 H7N9感染的病例数呈显著相关性,（r ＝0．689,P ＜0．05）;对2322份样本进行 H6亚型核酸检测,总阳性率为2．58％,并选取 H5、H6和 H9亚型标本153份进行 N 亚型检测,检测出 H5N1、H5N2、H5N6、H6N2和 H9N2等多种亚型。2012-2015年广东省21个地市活禽市场均存在 HA 亚型（H5、H7、H9和 H6）和 NA 亚型（N1、N2、N6）等多种亚型的污染,污染程度呈现季节性分布,不同样本类型和禽类其禽流感病毒分状况不同,H7亚型的污染严重程度与 H7N9的病例感染数呈正相关性。     

抗H5N1亚型禽流感病毒血凝素单克隆抗体的制备及鉴定

目的建立稳定分泌抗H5N1亚型禽流感病毒血凝素单克隆抗体的杂交瘤细胞系,为进一步研究禽流感诊断技术奠定基础。方法以纯化的H5亚型禽流感病毒按常规方法免疫BALBc小鼠,最后一次免疫后第3天取其脾细胞与SP20细胞在聚乙二醇作用下融合,用选择性培养、有限稀释法克隆和血凝抑制试验进行筛选,对获得阳性克隆株用ELISA方法进行亚型鉴定,并用37株H5、H7、H9亚型AIV测定其特异性、覆盖性。结果最后获得了3株分泌特异性抗体的杂交瘤细胞,命名为1E5、4A4、4B1,经长期体外培养和冻存后复苏能稳定地分泌抗体。经鉴定,其亚型均为IgG1、kappa链。腹水HI效价1∶210～1∶216,细胞培养上清HI效价1∶26～1∶28。3株杂交瘤所分泌的单克隆抗体均能与本中心保存的全部20株H5亚型禽流感病毒分离株发生反应,而与15株H9亚型禽流感病毒分离株、2株H7亚型禽流感病毒分离株以及H1H4、H6H15亚型禽流感病毒标准毒株均不反应,与鸡新城疫病毒、鹅新城疫病毒、鹅腺病毒和鸡产蛋下降综合征病毒等均无交叉反应。结论所获3株单克隆抗体可用于禽流感病毒特异性诊断试剂的研制。     

华东地区家鸭中N1亚型禽流感病毒NA基因的遗传进化分析

为了解华东地区家鸭内禽流感病毒的遗传进化情况,对2002~2006年分离自华东地区家鸭的3种主要N1亚型的禽流感病毒:2株H1N1、10株H3N1和14株H5N1,共26株病毒的NA基因进行了遗传进化分析。结果表明,华东地区家鸭中的N1亚型的禽流感病毒正处于不断进化状态中。14株H5N1禽流感病毒均在NA的茎部缺失20个氨基酸(49~68位),而其他N1亚型的禽流感病毒的NA都未见发生此缺失。H3N1病毒可能与H1N1病毒发生了NA基因的重排,但是目前还没有直接证据表明华东地区家鸭中H5N1禽流感参与了基因重排。     

高致病性A(H5N6)亚型禽流感病毒全基因组序列测定方法的建立

建立以Sanger测序方法为基础的新型A(H5N6)亚型禽流感病毒全基因组扩增方法。从GenBank和Global Initiative on Sharing All Influenza Data(GISAID)下载近五年H5亚型流感病毒的HA基因序列,N6亚型流感病毒的NA基因序列,以及H5N1和H9N2亚型流感病毒内部6个基因序列,每个基因序列分别进行比对,在相对保守区域设计用于分段扩增的引物,共32对,选用3株病例分离病毒及6株环境分离病毒对引物进行验证。优化后的32对引物能够有效地扩增9株H5N6亚型禽流感病毒,其中3株病例分离病毒的扩增产物条带单一,无非特异扩增。6株环境标本分离病毒扩增产物中,个别反应有非特异扩增产物。建立了一种能够获得高致病性H5N6亚型禽流感病毒全基因组序列的Sanger测序方法,该方法简单、快速,为新型H5N6亚型禽流感病毒的进化分析提供了基础。     

高致病性A(H5N6)亚型禽流感病毒全基因组序列测定方法的建立北大核心CSCD

建立以Sanger测序方法为基础的新型A(H5N6)亚型禽流感病毒全基因组扩增方法。从GenBank和Global Initiative on Sharing All Influenza Data(GISAID)下载近五年H5亚型流感病毒的HA基因序列,N6亚型流感病毒的NA基因序列,以及H5N1和H9N2亚型流感病毒内部6个基因序列,每个基因序列分别进行比对,在相对保守区域设计用于分段扩增的引物,共32对,选用3株病例分离病毒及6株环境分离病毒对引物进行验证。优化后的32对引物能够有效地扩增9株H5N6亚型禽流感病毒,其中3株病例分离病毒的扩增产物条带单一,无非特异扩增。6株环境标本分离病毒扩增产物中,个别反应有非特异扩增产物。建立了一种能够获得高致病性H5N6亚型禽流感病毒全基因组序列的Sanger测序方法,该方法简单、快速,为新型H5N6亚型禽流感病毒的进化分析提供了基础。