人乳头瘤病毒6b型H增强子样序列在大肠杆菌中增强基因转录和β—干 …

将人乳头瘤病毒６ｂ型（ＨＰＶ６ｂ）基因组上游调控区（ＵＲＲ）５４０ｂｐ的Ｓａｕ３Ａ－Ｎａｒｌ片段（Ｈ序列）,正反向插入β－干扰素表达载Ｔｒｐ劝子上游,使β－ＩＦＮ表达明显增强,可使基因表达水平提高３．６倍和２．１倍。Ｈ序列正反向插入增强子检测载体不仅使β－半乳糖苷酶表达活性增加－１０倍,还能使半乳糖苷酶ｍＲＮＡ量明显增高,证明Ｈ序列对被调控基因的增强作用是发生在转录水平。     

人乳头瘤病毒6b型(HPV-6b)的上游调控区在大肠杆菌中也具有增强子样的效应

采用痘苗病毒7.5k、11k及N2启动子,以大肠杆菌β-半乳糖苷酶(β-lac)、氯霉素乙酰基转移酶(CAT)作为标记基因,构建了大肠杆菌增强子样序列的系列检测载体。采用上述检测载体发现人乳头瘤病毒6b(Human papillomavirus type 6b,HPV-6b)上游调控区(Upstream regulating region,URR)中540bp的Sau3A-Nar Ⅰ片段,在大肠杆菌中对痘苗病毒启动子控制的CAT基因的表达有明显的增强作用,可使基因表达提高4～5倍;对β-lac基因的表达可提高3～6倍。根据这一片段的插入方向增强基因表达水平有所不同。     

SV40 DNA Hind Ⅲ B片段增强人β干扰素基因在大肠杆菌中的表达

近年来发现,许多DNA和RNA肿瘤病毒具有一种可以增加某些基因转录活性的调控序列,称为增强子。但增强子只在真核细胞才起作用。侯云德等在研究SV40 72bp重复序列对干扰素基因在原核细胞中表达的影响时,发现SV40 DNA Hind Ⅲ B片段对人αD型干扰素基因在原核细胞中有顺式(cis)的增强作用。本文进一步观察到,该片段对人β干扰素基因在大肠杆菌中的表达也有类似的增强作用。     

在大肠杆菌中提高人α1b型基因工程干扰素的表达

将人α１ｂ型干扰素（ＩＦＮ-α１ｂ）基因插入带有原核增强子样序列的新型载体Ｐｂｖ３２２,使干扰素在大肠杆菌中的表达水平明显高于原表达载体,达到１.６×１０^８ｕ／Ｌ培养液。重组质粒的特点是：含增强子序列Ｘ,ｔｒｐ启动子控制。利用ＤＥＡＥ-Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、ＣＭ-Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ离子交换层析及单克隆抗体亲和层析纯化ＩＦＮ-α１ｂ,获得了电泳纯产品,其比活性为２×１０^７ｕ／ｍｇ,分子量为１９ｋＤａ。此外,用Ｐａｔ１５３代替Ｐｂｖ３２２,构建了带有和不带有Ｘ序列的两种表达载体,平行对比表明增强子Ｘ序列可以将ＩＦＮ-α１ｂ表达提高４倍     

β干扰素基因在大肠杆菌中的表达

通过Bal 31酶酶切及筛选从β干扰素基因组克隆中分离到成熟β干扰素基因,并组建了一个在Tac启动子控制下表达β干扰索基因的质粒。研究了不同诱导条件对β干扰素表达的影响。Β干扰素在大肠杆菌中表达的产量为10μ／l。     

SV40 DNA Hind Ⅲ B片段对人αD型干扰素基因在原核细胞中表达的增强作用

近年来,从动物病毒到真核细胞都相继发现有增强子的存在,它能明显地增强其邻近基因的转录速率。但是,在原核表达系统中尚未见报导。本文在探讨SV40增强子对原核表达系统的影响时,发现SV40 DNA Hind Ⅲ B片段对人αD型干扰素基因在大肠杆菌中的表达有明显的增强作用。 pBV181含有完整的人αD型干扰素基因,在P1启动子的控制下,在大肠杆菌中(BM-     

利用带有原核增强子样序列的新型载体在大肠杆菌中高效表达人α肿瘤坏死因子

将去除信号肽的人肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)cDNA插入到带有原核增强子样序列Px的新型表达载体pBV320中,使TNF cDNA 5′端直接置于大肠杆菌trp启动子下游,采用37℃恒温培养,使TNF在大肠杆菌中获得了高效表达,表达活性达1.35(±0.17)×10~6U/L菌液。表达的TNF-α对L929细胞的毒性作用可被抗人肿瘤坏死因子-α的单克隆抗体所中和。表达菌裂解液作SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,显示有一条分子量与TNF分子量吻合、约为17000道尔顿的蛋白带。利用DEAE-Sepharose阴离子交换层析及Sephacryl S-200凝胶过滤对上述重组人TNF-α进行纯化,获得电泳纯产品,比活性为1.48×10~6U/mg。     

重组人干扰素α-2b在大肠杆菌中分泌表达

人干扰素α-2b原始基因在重组原核工程菌中表达量偏低,所以我们在不改变干扰素原有氨基酸组成的前提下,根据大肠杆菌密码子偏爱性使用定向突变技术对huIFNα-2b基因进行点突变。将大肠杆菌STⅡ信号肽基因与突变后huIFNα-2b基因融合并于信号肽5′端和huIFNα-2b基因3′端引入合适的酶切位点。融合基因克隆至载体pCSE,pET-22b和pPAK4L中,此3种载体分别含有组成型启动子、T7启动子和phoA启动子。融合基因在载体pCSE中表达量很低,其中约有50%的目标蛋白能够成功实现分泌。在E.coliBL21中,pET-22b经过IPTG诱导可以实现huIFNα-2b的高表达,但STⅡ信号肽不能被有效切除。含有phoA启动子的载体pPAK4L其在E.coliW3110中可以实现huIFNα-2b较高水平的分泌表达,经过低磷诱导其表达量最高可至20μg/mL(A550)菌液,约有30%的目标蛋白质信号肽能够被成功切除并分泌到胞间质中。     

猪β-干扰素的原核表达及其对猪流行性腹泻病毒的抑制作用研究

本研究通过PCR技术克隆了猪β干扰素全基因,设计引物亚克隆猪β干扰素成熟蛋白编码基因并对,5'端1个稀有密码子进行了大肠杆菌偏嗜性改造.构建了猪IFN-β原核单纯表达载体pRLC-poIFNβ,实现了poIFN-β在大肠杆菌中的表达,表达产物约占菌体总蛋白的17.3%.表达产物以包涵体形式存在,用含6mol/L盐酸胍的变性液溶解及含GSH-GSSG复性液复性处理,复性后的表达产物经凝胶层析纯化后,MDBK细胞-VSV病变抑制法测定结果表明,重组猪β干扰素具有良好的抗病毒活性,约为5.6x105U/mg.用重组猪β干扰素处理猪肾传代细胞PK-15后,细胞病变抑制法(CPE50)测定结果表明重组猪β干扰素可显著抑制猪流行性腹泻病毒(PEDV)的感染.     

人乳头瘤病毒6型L1基因的克隆和表达及鉴定

克隆人乳头瘤病毒6型(HPV-6)保护性抗原L1基因,构建L1基因表达载体。从临床诊断尖锐湿疣的病理组织标本中提取HPV-6的DNA,采用高保真PCR扩增其保护性抗原L1基因,T-A克隆后测定核苷酸序列。构建pET32a的L1表达载体,在E.coliBL21DE3宿主菌中用不同浓度的IPTG诱导表达。采用SDS-PAGE鉴定表达产物。所克隆的L1基因与报道的相应核苷酸序列同源性为99.20%~99.93%,氨基酸序列同源性高达99.80%~100%。SDS-PAGE结果显示,在构建的载体中成功表达预计大小分子量的融合蛋白,成功构建了HPV-6的保护性基因L1的表达系统。     

人乳头瘤病毒16碧蓝晚期基因L1在大肠杆菌中的表达

人乳头瘤病毒（ＨＰＶ）感染与宫颈癌的发生关系密切。其晚期蛋白Ｌ１是主要结构蛋白,可以刺激机体产生中和抗体,对病毒攻击可以起到保护作用。本研究将ＨＰＶ１６型中国分离株的Ｌ１基因定向克隆到原核表达载体ｐＥＴ－２１ｃ质粒中,建立ＨＰＶ１６ Ｌ１在大肠杆菌中的高效表达系统ｐＥＴ２１ｃ－ＨＰＶ１６ Ｌ１,该系统在ＩＰＴＧ的诱导下可表达６０ｋｕ的Ｌ１蛋白,表达效率为２３％,此蛋白通过Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ得     

人乳头瘤病毒6型L1基因的克隆及蛋白表达

目的：在大肠杆菌中表达经密码子优化的人乳头瘤病毒6型（HPV6）L1的融合蛋白。方法：PCR方法扩增HPV6 L1,基因,测序及序列比对后,对基因进行密码子优化并合成优化后的基因HPV6mLI,将其克隆入原核表达载体pGEX4T-1,IPTG诱导融合蛋白在大肠杆菌BL21（DE3）中表达,SDS-PAGE鉴定表达产物。结果：酶切和测序结果证实HPV6 mL1基因的原核表达载体构建正确;以1mmol／L IPTG于37℃诱导4h,蛋白以包涵体形式表达;表达产物的相对分子质量与预期值一致,为80000。结论：获得大肠杆菌表达的HPV6L1蛋白,为其结构功能研究和疫苗研发提供了基础。     

人乳头瘤病毒18型病毒样颗粒在大肠杆菌中的表达及免疫原性分析

利用大肠杆菌表达系统可溶性表达人乳头瘤病毒18型(HPV18)L1蛋白,经过纯化和重组装过程获得HPV18病毒样颗粒(VLPs),研究其免疫原性和诱发中和抗体生成的水平。首先,提取HPV18的基因组DNA,通过PCR扩增获得HPV18 L1基因片段,将其插入pTrxFus表达载体,在大肠杆菌中可溶性表达HPV18 L1蛋白;其次,通过硫酸铵沉淀、离子交换层析和疏水相互作用层析获得高纯度的HPV18 L1蛋白,而后透析去除预先加入的还原剂DTT,使HPV18 L1蛋白自发组装成VLPs;最后,通过动态光散射技术和透射电子显微镜鉴定HPV18 VLPs的大小和形态,利用假病毒细胞中和实验评价HPV18 VLPs在实验动物体内的免疫原性和中和抗体生成水平。结果表明,HPV18L1蛋白可以在大肠杆菌表达系统中以可溶形式表达,经过纯化的HPV18 L1蛋白可以自发组装成为半径约为29.34nm、与HPV病毒外观相似的VLP。该VLPs在小鼠体内的中和抗体半数有效剂量为0.006μg,在兔及山羊体内诱导中和抗体滴度高达107。总之,本研究利用原核表达系统可简便高效地获得具有高度免疫原性的HPV18 VLPs,为HPV18...     

利用TGATG序列在大肠杆菌中直接表达非融合的人αD型干扰素

本文利用人αD型干扰素基因信号多肽编码区内自身的TGATG序列,在大肠杆菌中有效地表达非融合的人αD型干扰素。其根据是:第一,纯化干扰素的分子量为19.5k,而不是27k的融合蛋白;第二,干扰素活性峰的分布集中在19.5k附近;第三,干扰素抗体的吸收峰与其活性峰相一致;第四,纯化干扰素N端序列分析证明DNA水平设计的准确性。同时,还证明大肠杆菌能够识别并加工人αD型干扰素信号多肽。 在探讨TGATG序列对下游基因表达的影响时发现,“翻译联结”(ATG-TGATG)方式起始的基因表达水平比一般ATG起始方式高约10倍;而在ATG-TGATG起始方式中,第一和第二种读码框架之间的距离,即使相差27个氨基酸编码序列,后一种基因的表达水平也无明显差异。     

采用PL启动子在大肠杆菌中直接表达人aD型干扰素

从p8218、pUR-222、pBV-114及pKC-30组建杂交质粒pBV一867,使人aD型干扰素基因在PL启动于控制下在大肠杆菌中能够直接表达。每升菌液的干扰素平均产量为0.8 x107单位。     

β-半乳糖苷酶基因在正常人及白血病人骨髓细胞的表达

为探索组织化学方法检测标志基因在正常骨髓细胞及白血病细胞的表达,本研究利用脂质体介导将ＮｅｏＲ基因和ＬａｃＺ基因共转移正常人及白血病人骨髓细胞。然后,采用Ｘ－ｇａｌ染色的方法,我们观察了ＬａｃＺ基因在转导细胞的表达。结果显示：ＬａｃＺ基因在正常人及白血病人骨髓细胞表达的阳性率分别为１３．３３％±２．６８％和１５．３９±３．６９％。经Ｇ４１８筛选后,转导阳性细胞率达到４６．０６％±３．４７％和４８．２２％±４．４７％。提示：经脂质体介导ＬａｃＺ基因在正常骨髓细胞及白血病细胞可获得高效的转移率。同时表明,利用组织化学方法可有效地检测标志基因的表达。     

用pKKH质粒在大肠杆菌中表达HuIFN－β

应用ＤＮＡ重组技术,将ＨｕＩＦＮ－β基因插入到质粒ｐＫＫＨ的ｔａｃ启动子下游,转化大肠杆菌ＪＭ１０１和ＪＭ１０３,经ＩＰＴＧ诱导,表达ＨｕＩＦＮ－β,收集并裂解细菌,用Ｗｉｓｈ－ＶＳＶ系统细胞病变抑制法检测生物学活性为２．１８×１０８－８．７×１０８ＩＵ／Ｌ菌液。经初步纯化ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳可见分子量为２０ＫＤ较纯的表达带。