乙肝病毒核心蛋白及核心颗粒的结构及功能研究进展

乙型肝炎是由嗜肝DNA病毒(Hepatitis B virus,HBV)引起的一种世界范围内的传染性疾病.受HBV慢性感染的人群罹患肝硬化和原发性肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)的相对危险性至少增加100倍,并最终导致死亡,给人们的健康造成极大的威胁和损害.鉴于此,世界上许多生物医学家早已把他们的研究目标集中到了乙肝病毒,以期弄清楚该病毒的基本结构,致病机理、免疫原性、免疫逃避和生化分子遗传规律等方面的问题.而近来在这些研究中,对乙肝核心抗原(HBcAg)结构、功能及免疫逃避机制的研究又成了引人注目的焦点.本文综合了近年来国内外对乙肝核心抗原(HBcAg)及其核衣壳和核心抗原缺失突变体的研究资料,从以下几个方面对该领域的研究作了较为深入的分析和概述.     

乙型肝炎病毒核心蛋白变构调节剂的研究进展

由于乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)的共价闭合环状DNA的持续存在和病毒介导的宿主免疫反应钝化,导致慢性乙型肝炎病毒感染很难治愈。现有的核苷(酸)类似物或聚乙二醇干扰素疗法难以实现高比率的HBV表面抗原清除。目前正在研发的核心蛋白变构调节剂有望大幅度降低血清表面抗原。本文就HBV核心蛋白的结构、功能以及核心蛋白变构调节剂的分类、应用前景等方面进行综述。     

丙型肝炎病毒核心蛋白抑制乙型肝炎病毒转录的分子机理

为研究丙型肝炎病毒 (HCV)核心蛋白抑制乙型肝炎病毒 (HBV)表达的分子机理 ,从HCV和HBV共感染中国病人血清中分离了 5个含HCV 5′非编码区 ( 5′NCR)和核心区 (CR)cDNA序列的克隆 .序列比较和系统发育分析显示 :从共感染病例中分离的HCV序列与其它已发表的从单独HCV感染病例中分离的序列没有显著差异 .共转染实验证实采用从其中 1例共感染病人中分离的核心蛋白cDNA基因所表达的核心蛋白 ,可抑制HBV表面抗原 (HBsAg)和HBVe抗原 (HBeAg)的表达 ,缺失突变分析说明HCV核心蛋白的C端疏水区对这种抑制作用是必需的 ,报道基因产物分析进一步说明了HBVC启动子和增强子Ⅱ是HCV核心蛋白的效应靶序列之一 ,而HCV核心蛋白在肝细胞和非肝细胞中均对HBV和其他细胞和病毒的基因的转录起负调节作用 .因此 ,认为HCV核心蛋白是一种多功能的负调节因子 ,与HCV和HBV以及HCV与细胞之间的相互作用密切相关     

HBV基因型、基本核心启动子区双突变和肝细胞癌发生及临床病理特征的关系

目的探讨乙型肝炎病毒(HBV)基因型、基本核心启动子(BCP)区双突变(简称BCP双突变)和肝硬化(LC)、肝细胞癌(HCC)发生的关联,分析BCP双突变和HCC临床病理特征的关系。方法随机收集233例慢性HBV感染者的血清,其中80例为慢性乙型肝炎(CHB)患者、75例为LC患者、78例为HCC患者,并系统整理患者的常规检查和病理等资料。采用实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)检测BCP双突,用特异性引物多重PCR扩增确定HBV基因型。用SPSS 11.0分析结果。结果 HBV基因型结果均为B和C型,分别在CHB和LC组,CHB和HCC组间分布差异有统计学意义(P<0.05),在LC和HCC组间分布差异无统计学意义(P>0.05),感染C基因型与LC和HCC发生相关(分别OR=2.73,95%CI=1.29～5.82;OR=2.00,95%CI=0.98～4.09)。BCP双突变也分别在CHB和LC组,CHB和HCC组间分布差异有统计学意义(P<0.05),在LC和HCC组间分布差异无统计学意义(P>0.05),双突变与LC和HCC发生相关(分别OR=1.91,95%CI=0.96～3.82;OR=2.05,95%CI=1.04～4.06)。BCP双突变和伴肝硬化的HCC相关(P<0.05)。结论感染HBV C基因型、BCP双突变可能均是LC和HCC发生的危险因素,BCP双突变可作为LC和HCC早期预警生物标记物。     

福建省慢性HBV感染者HBV基因S区、基本核心启动子区和前C区基因变异特征分析

为研究福建省慢性HBV感染者HBV基因多样性及变异规律,了解该人群HBV-DNA的病毒学特征。收集慢性HBV感染者血清标本,通过巢式PCR法扩增其HBV基因序列,比对NCBI数据库中标准基因型序列,分析HBV基因S区,基本核心启动子区(BCP)及前C区的序列变异情况,并对这些变异可能造成的病毒抗原表达,疫苗逃逸,患者病症改变等情况进行探讨。最终成功扩增82例HBV全长基因序列,其中B基因型56例,C基因型26例。基因组特定功能区序列分析发现慢性HBV感染者HBV基因在S区(23.2%)、BCP区(61.0%)和前C区(29.3%)均出现了不同程度的变异。其中主蛋白(HBsAg)主要抗原决定簇a决定簇45.8%位点出现了变异,这些变异位点中包括与肝炎重症化及免疫逃逸密切相关的位点(aa126、aa129、aa145等)。位点G1896A(19.5%),G1764A(11.0%)和A1762T(9.8%)依然是BCP/前C区的主要突变位点。而位点A1752G(25.6%)高突变率的出现在BCP区应引起关注。此外位点G1764A(χ~2=5.742,P=0.030)、A1896G(χ~2=14.392,P=0.000)以及A1762T/G1764A(χ~2=7.289,P=0.012)的突变更容易发生在HBeAg阴性的样品中;而位点A1846T(χ~2=11.882,P=0.003)、A1762T(χ~2=6.561,P=0.038)和A1896G(χ~2=6.958,P=0.030)的突变与HBV-DNA的病毒载量存在一定相关性。总之,福建省慢性HBV感染者在HBV不同基因功能区域均存在不同程度的变异,一些与HBeAg表达情况、HBV-DNA载量、疫苗免疫逃避及肝细胞癌发生具有相关联的变异位点已经出现,BCP区A1752G位点的高频率出现应值得关注,对于这些变异位点的患者应加强监测。     

改变乙型肝炎病毒核心抗原基因3′端序列对其在原核细胞中表达的影响

乙型肝炎病毒(HBV)的核心抗原基因(C基因)编码185个氨基酸残基,在原核细胞或痘苗病毒系统中能表达并装配成27nm大小的核心抗原(HBcAg)多聚体颗粒。已证实HBV C基因3′端编码近40个氨基酸的碱基序列,不是表达形成HBcAg颗粒所必需的。用外源基因替换这部分序列,已表达出表面带有外源基因产物的杂合颗粒,它具有很好的免疫原性,成为新型的基因工程多决定簇颗粒载体疫苗。但我们的实验中发现,用另外的外源基因替换3′端序列能显著影响HBV C基因在大肠杆菌中的表达,不同组成的外源基因其影响程度有所不同。     

乙肝病毒核心蛋白病毒样颗粒作为载体在表位疫苗中的应用

乙型肝炎病毒核心抗原(hepatitis B core antigen,HBcAg)是由乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV) C基因编码的病毒蛋白,是HBV的衣壳蛋白,主要存在于HBV核衣壳表面。乙肝病毒核心蛋白(hepatitis B virus core protein,HBc)来源于HBcAg,由183或185个氨基酸组成。由于HBc本身具有高度的免疫原性,并且可携带自身或外源病原体的抗原/表位在体外自组装成病毒样颗粒,20世纪80年代开始HBc就被用于疫苗载体的研究。现对HBc近年来作为载体在表位疫苗中的应用作一概述。     

乙肝病毒核心抗原基因在大肠杆菌中的表达

根据乙型肝炎病毒(HBV)DNA全基因组克隆pHBV-NC的酶切图谱,分别用限制性内切酶HincⅡ-AvaⅠ和BgLⅡ剪切pHBV—NC_1-DNA,获得了两种不同长度HBV核心抗原基因片段:HBcAgⅠ片段和HBcAgⅡ片段。用带有P_R启动子的质粒pCQV2和带有Lac启动子的质粒pUR222与HBcAgⅠ段和HBcAgⅡ片段连接,分别转化到大肠杆菌中,获得了三种不同的表达菌株,命名为pHBcAgⅠ、pHBcAgⅡ和pLcAgⅡ,并对其核心抗原的表达量做了比较。     

河南省乙型肝炎病毒分型特征及小S蛋白主要亲水区变异特点分析北大核心CSCD

为了解河南省乙型肝炎(乙肝)HBV基因型分布及其主蛋白抗原主要亲水区(MHR)氨基酸(aa)位点变异情况。本研究采集河南省2012年HBV流行病学调查的部分HBsAg和HBeAg阳性的血清样本,提取HBV DNA并进行序列扩增,测序得到s基因序列,利用Mega6.0软件比较分析。共得到HBVS基因序列50条,基因型分布B型为16.0%(8/50)、C型为84.0%(42/50)。血清型分布中,adrq+为HBV主要流行血清型,流行率为84.0%。S基因MHR aa位点变异中,T126变异率最高,为14.0%。HBV MHR变异株总流行率为24.0%(12/50),其中B型的突变率为37.5%(3/8),C型的突变率为21.4%(9/42)。河南省乙肝基因型分布以C型为主,B型次之。血清型主要为adrq+为主,adw2次之。HBV MHR aa位点存在变异,应在今后的计划免疫和HBIG治疗中给予重视。     

肝癌组织中HBV核心基因启动子突变的研究

为深入了解乙肝病毒(HBV)致癌机理,用套式PCR对广西14例血清HBV DNA阳性的原发性肝癌患者癌组织、10例乙型病毒性肝炎患者血清及10例乙肝病毒无症状携带者血清HBV核心基因启动子进行扩增,阳性者用Sanger氏双脱氧法做序列分析,发现肝癌组织10例PCR阳性,阳性率71.4%,所有PCR阳性标本的整合体均有乙肝病毒核心基因启动子双突变序列(nt 1 762 A→T, 1 764 G→A),并且在其周围各序列都有不同部位的点突变,标本C14核苷酸的缺失突变高达10个.乙肝患者6例PCR阳性,其中3例乙肝病毒核心基因启动子发生双突变.无症状携带者中4例PCR阳性,其中仅1例发生双突变.结果提示乙肝病毒核心基因启动子双突变在肝癌患者中较常见,肝炎患者次之,无症状携带者居最后.     

肝癌患者体内乙型肝炎病毒基因组的突变

乙型肝炎病毒(HBV)属于嗜肝DNA病毒科,其基因组有3．2kb,含4个重叠的开放阅读框架(ORF),编码核心蛋白、e蛋白、X蛋白、聚合酶以及HBV表面抗原(HBsAg)。为研究HBV的基因突变与肝细胞癌(HCC)发生的关系,本文对来自HCC病人不同基因型的HBV进行测序,研究其X、前C、前S和S区突变情况。     

肝癌组织中HBV核心基因启动子突变的研究

为深入了解乙肝病毒 (HBV)致癌机理 ,用套式PCR对广西 14例血清HBVDNA阳性的原发性肝癌患者癌组织、10例乙型病毒性肝炎患者血清及 10例乙肝病毒无症状携带者血清HBV核心基因启动子进行扩增 ,阳性者用Sanger氏双脱氧法做序列分析 ,发现肝癌组织 10例PCR阳性 ,阳性率 71.4 % ,所有PCR阳性标本的整合体均有乙肝病毒核心基因启动子双突变序列 (nt 176 2A→T ,176 4G→A) ,并且在其周围各序列都有不同部位的点突变 ,标本C14核苷酸的缺失突变高达10个。乙肝患者 6例PCR阳性 ,其中 3例乙肝病毒核心基因启动子发生双突变。无症状携带者中 4例PCR阳性 ,其中仅 1例发生双突变。结果提示乙肝病毒核心基因启动子双突变在肝癌患者中较常见 ,肝炎患者次之 ,无症状携带者居最后。     

乙肝病毒核心蛋白钉突部位基因工程改造对其功能的影响

通过在乙肝病毒核心蛋白钉突部位插入标签蛋白EGFP及小片段多肽,研究各种改造对HBc功能的影响。采用RLIC方法,构建野生型HBc、HBc钉突部位带不同接头的EGFP融合重组体、缩短的EGFP融合重组体,并构建与HBc功能互补的质粒HBV1.1c－,将不同重组体与HBV1.1c－共转染HEK293细胞,通过观察荧光及Southern blotting检测病毒复制中间体,判断相应基因工程改造对重组蛋白中不同结构域功能的影响。RLIC方法可有效地用来进行片段缺失,且缺失片段大小及位置无明显限制。带柔性或刚性接头的重组HBc-EGFP均可产生绿色荧光,但荧光在细胞内分布形态不同,两种重组HBc-EGFP均不能支持正常的HBV复制,各种截短的插入片段以及aa79-80单独缺失体亦不能支持HBV复制。结果表明RLIC方法是一种基因工程改造的有力工具,不同类型接头对重组蛋白的结构和功能有不同影响,aa79-80对维持HBc的主要功能之一——支持HBV复制有重要作用。     

HBV基因组中GRE相关的DNA片段能介导多种激素对转录的调节作用

乙型肝炎病毒(HBV)能引起急性和慢性的乙型肝炎,慢性HBV感染可能导致肝硬变,最终引发肝细胞癌(HCC)。在世界范围内慢性HBV感染几乎波及三亿人,其中四分之三在亚洲。一些研究结果表明男性遭受慢性HBV感染、肝损伤和肝细胞癌的危险性高于女性。许多临床报告证明,给慢性HBV患者服用可的松类甾类激素可使患者血清中的HBsAg水平上升,同样的激素处理也能使培养细胞中的HBcAg表达水平升高。1988年Tur-Kaspa等用DNaseⅠ足迹法证实HBV基因组含有一个糖皮质激     

乙肝病毒BCP区突变（A1762T/G1764A）对乙肝病毒复制的影响研究

通过构建乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus, HBV）单倍体分子，阐明HBV基本核心启动子突变（A1762T/+G1764A,BCP）对HBV复制的影响。本研究收集了HBeAg阴性的慢乙肝患者，将其中两例BCP突变的序列通过重叠PCR克隆到HBV1.3倍体的复制质粒；构建环状的HBV单倍体分子，转染Huh7.0细胞后，通过ELISA、实时荧光定量PCR等分析BCP突变对病毒复制的影响；通过荧光素酶实验分析BCP突变对HBV preC mRNA转录的影响。55例HBeAg阴性的慢乙肝患者中有30例带有A1762T/G1764A的突变；克隆带有BCP突变的临床序列到HBV 1.3倍体转染细胞后，上清中HBeAg为阴性，表面抗原降低10%(P>0.05)；构建的HBV单倍体环化后形成闭合环状的cccDNA分子，转染细胞后，结果表明BCP突变后，HBeAg下降55.48%(P<0.05)，表面抗原无显著性差异（P>0.05），细胞内病毒颗粒中DNA水平为野生型的3.18倍，上清中HBV DNA为野生型的1.36倍；BCP突变后preC mRNA水平降低81.05...     

山东某医院患者乙型肝炎核心抗体阳性特征分析

目的 了解2016—2020年山东某医院就诊患者乙型肝炎核心抗体(core antibody against hepatitis B, HBcAb)分布特征及乙型病毒性肝炎(viral hepatitis type B,简称乙型肝炎)感染现状。方法 用电化学发光免疫分析法(electrochemi-luminescence immunoassay)对采集的257 922份血清样本进行乙肝五项检测,并对HBcAb阳性样本的时间、性别、年龄及乙肝五项不同组合模式的特征进行分析。结果 人群中乙型肝炎病毒(hepatitis b virus, HBV)核心抗体(core antibody against hepatitis B, HBcAb)阳性有102 598例,阳性率为39.78%;2020年阳性例数最多而阳性率最低,阳性率总体呈现逐年下降的趋势,时间差异有统计学意义(χ²=122.74,P<0.05);男性阳性率高于女性,性别差异有统计学意义(P<0.05);>70岁组阳性率最高为66.38%,不同年龄组阳性率差异有统计学意义(χ²     

无偿献血者中隐匿性乙型肝炎病毒感染及表面抗原突变分析

采用多种免疫学检测和核酸检测相结合的方法调查了我国南方某城市无偿献血者中隐匿性乙型肝炎病毒(HBV)感染的存在情况。结果在9023例乙肝表面抗原(HBsAg)阴性的无偿献血者中,共发现17例HBV DNA阳性,隐匿性HBV感染者的发生率为0.19%(95%CI:0.11～0.30%)。序列分析显示其中6例在HBsAg"a"表位(aa124～aa147)存在不同程度氨基酸突变,突变发生率为42.9%(6/14,有3例未扩增出"a"表位片段序列),G145R突变是该地区隐匿性HBV携带者中发生频率最高的突变(4/6,66.7%)。隐匿性HBV感染者中基因型C的比例(10/17)显著高于HBsAg阳性的HBV感染者(0/15,P<0.01)。     

乙型肝炎病毒DNA在患者血清及肝组织中存在状态的研究

对29例肝炎,1例尸检肝组织和血清中乙型肝炎病毒的DNA(HBV DNA)进行了研究,发现HBsAg( )/HBeAg( )患者中,有9/17(52.94％)血清HBV DNA阳性;HBsAg( )/抗-HBe( )患者中,2/6(33.33％)也为阳性。从30例肝组织中提取DNA经琼脂糖电泳,Southern吸印转移及分子杂交试验结果表明,27例HBV DNA阳性,全部有游离型HBV DNA。27例中有5例经用标记pBR322探针杂交排除非特异杂交带后,在高分子量区有HBV DNA特异的杂交带,提示有HBV DNA整合。     

乙型肝炎病毒核心抗体IgM的蛋白芯片检测法研究

目的:探索蛋白芯片技术检测乙型肝炎病毒(HBV)抗HBc-IgM的可行性。方法:应用Nano-Plotter TM-压电式微量喷墨点阵制备系统自制的核心抗原蛋白芯片在经10%山羊血清封闭后加入待测血清37℃孵育,PBST清洗晾干后后再次加入检测抗体即HRP-抗人Ig M抗体,芯片用伯乐成像仪检测有无信号。结果:24份HBs Ag和抗HBc阳性血清中经蛋白芯片检测抗HBc-IgM阳性率为83.3%(20/24);24份健康志愿者血清中经蛋白芯片检测抗HBc-IgM阳性率为4.1%(1/24)。乙肝血清与健康志愿者血清化学发光信号差异明显。结论:蛋白芯片技术可较好地应用于定性检测HBV抗HBc-IgM,为临床快速判断是否存在HBV感染和监测慢性肝炎HBV活动性提供新的辅助诊断方法。     

KNK437抑制乙型肝炎病毒复制及转录

乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)在肝细胞内复制过程中,病毒反转录酶(P蛋白)与前基因组RNA(Pregenomic RNA,pgRNA)上的RNA包装信号ε形成P-ε复合物,启动反转录合成和核衣壳装配。封闭P-ε相互作用是一种极具吸引力的抗HBV策略。已知P-ε形成RNP复合物正常发挥活性时,需要热休克蛋白(Heat-shock proteins,Hsps)参与。本研究探索Hsps抑制剂KNK437对HBV复制及转录的影响。主要运用了三种工作模型:HepG2.2.15细胞系、瞬时转染1.05×HBV(pCH9-3091)质粒的Huh7细胞系和瞬时转染1.3×HBV(pGEM-1.3×HBV)质粒的Huh7细胞系。采用CCK-8方法检测KNK437的细胞毒性,ELISA测定细胞培养液上清中HBsAg和HBeAg的分泌水平;q-PCR和qRT-PCR分别检测细胞内HBV核衣壳中DNA和细胞内HBV RNA水平;Western blotting检测细胞内衣壳亚单位(core)表达水平;qRT-PCR检测细胞内Hsps本身的转录水平。结果表明:20μM KNK437对细胞没有毒性,且在该浓度下KNK437除HepG2.2.15模型外,均下调HBV HBsAg和HBeAg的胞外分泌,抑制细胞内HBV核衣壳中DNA合成,降低细胞内HBV RNA转录水平,最低可使DNA水平降至1.5%左右,RNA水平降至30%左右,从而表明KNK437抑制HBV复制和转录。在HepG2.2.15中的Western blotting显示,KNK437明显减少细胞内衣壳亚单位(core)表达水平。KNK437也抑制Hsp70,Hsp90b,Hsp40等三种热休克蛋白RNA的转录,从而验证了它的确是一种泛Hsps抑制剂。本研究结果显示KNK437具有潜在抗HBV应用前景。