复合诱变选育林肯霉素高产菌株

以林肯链霉菌9502(Streptomyces lincolnensis9502)为出发菌株,进行NTG诱变处理,并用高效的琼脂块培养法对菌株进行筛选,得到产林肯霉素相对效价提高35.4%的变异株9502-7。对9502-7菌株孢子采用紫外线处理,得到变异高产菌株9502-7-12,其相对效价较出发菌株提高50%以上。     

氮离子注入诱变选育恩拉霉素高产菌株

利用氮离子注入对链霉菌的诱变效应,筛选高产恩拉霉素的变异菌株。利用不同剂量的氮离子对杀真菌放线菌S.fungicidicus NL629-3菌株进行诱变处理,研究低能氮离子注入对其存活率及产恩拉霉素能力的影响。低能氮离子注入剂量在60×1013ions/cm2时对链霉菌的诱变效应显著,试验得到了5株恩拉霉素产量较高的突变菌株,其中N3-643菌株经连续传代4次,遗传稳定性较好,其摇瓶发酵水平较对照提高了41%,放大发酵生产后平均发酵水平提高25.8%。离子注入诱变是获得高产恩拉霉素突变菌株的有效方法。     

紫外-激光复合诱变原生质体选育林可霉素高产菌株

以SL98-2-8为出发菌种,研究了紫外线、He-Ne激光以及紫外线与He-Ne激光复合对林肯链霉菌原生质体的诱变效应,结果表明He-Ne激光对紫外线引起的损伤有较好的修复作用.通过紫外线-He-Ne激光复合诱变,筛选到一株优良菌种SL98-2-8-116,其摇瓶效价达到3 629 μg/mL,较出发菌种提高了18.3 %,10次传代后生产性能稳定.     

林肯链霉菌双亲灭活原生质体融合的研究

分别以紫外线、热灭活林肯链霉菌 94 7和 95 0 2原生质体 ,然后进行灭活双亲的原生质体融合 ,从 1 6株融合子筛选到林肯霉素高产株。用双亲的互补营养缺陷型对林肯链霉菌原生质体的制备、融合、再生的部分条件进行了研究。发现含 0 .4 %Gly和 34 %蔗糖的SM培养基最适于实验菌株原生质体的制备、再生。聚乙二醇 (PEG)分子量对原生质体融合影响不大 ,其在P缓冲液中的浓度却很重要。含 5 0 %PEG的P缓冲液最有利于原生质体融合     

葡萄糖异构酶高产菌株的诱变选育

葡萄糖异构酶产生菌链霉菌B6经紫外线、亚硝基胍等诱变处理,经反复筛选获得T208变异株。测定了该菌产酶的适宜生长条件。该菌株比出发菌株酶活力提高2.75倍,可达550u/mol.该菌菌丝粗壮,易培养,有利于工业化生产。     

激光诱变玫瑰孢链霉菌结合链霉素抗性筛选法选育达托霉素高产菌株

将经过20 mW激光辐照20 min的达托霉素(Daptomycin)生产菌株-玫瑰孢链霉菌(Streptomyces roseosporus)D-38的孢子悬液倾注在含有1．9λg／mL链霉素的高氏一号培养平板上。通过链霉素抗性法筛选获得了10％正变率的突变株,其中突变株LC-54摇瓶发酵单位为81．2 mg／L,比出发菌株提高了39％。     

维吉霉素产生菌株X-435的诱变育种

链霉菌菌株x-435是从北京郊区采集的土样中分离得到的1株维吉霉素产生菌。为了提高维吉霉素的产量,采用紫外线对出发菌株x-435进行紫外线诱变处理,诱变处理后在高氏培养基上产生3种菌落形态,确定草帽型的菌落为阳性突变株的菌落形态,经过筛选获得效价高于出发菌株近20倍的突变株F5-25-u-28,且传代5代后稳定性较好。     

链霉素抗性突变--纳他霉素高产菌株的选育研究

应用链霉素抗性筛选法,将经过紫外线诱变处理的纳他霉素生产菌——褐黄孢链霉菌(Streptomyces gilvosporeus)ATC13326的孢子涂布在含有链霉素最小抑制浓度(0．6μg／mL)的培养基平板上,获得了122株链霉素抗性突变株。其中纳他霉素产量高于出发菌株的有13株,产量阳性效率达到10．6％,同时获得了产抗生素能力为出发菌株1．46倍的突变株SG-56。     

一株妥布拉霉素高产菌株特性的研究

用高温和NTG处理暗黑链霉菌410-II(Streptomyces tenebrarius410-II)的孢子,得到六株无色突变株。所产抗生素只有两个组分,经分析为氨甲酰妥布拉霉素(carb…yltobramycin)和阿普拉霉素(Apramycin),不再含有出发菌株产生的氨甲酰卡那霉素(Carbamoylkanamycin)。在适宜的发酵条件下,所含两个组分的比例约为I：1。突变株基本不产生可溶性紫色素,发酵液离心所得上清液虽加入Fe冲,也不变成紫色,有利于提取工艺。六株突变株中W1028一M,所产抗生紊总效价比原株410-Il高20％以上,发酵液中氨甲酰妥布拉霉素含量比4100l提高约45—50％。由f组分减少,提取分离效率提高,在实验室用10升发酵液进行提取实验,妥布拉霉素单组分的收率达到25％o突变株w1028一M5是一株产量增高、收率提高、适用于生产的菌株。     

原生质体诱变选育ε-聚赖氨酸高产菌株

以白色链霉菌UN2-71为出发菌株,对其原生质体进行硫酸二乙酯(DES)诱变,选育ε-聚赖氨酸高产菌株。经过试管初筛和摇瓶复筛,得到1株稳定性好的菌株D3-32,摇瓶产量达到1.56g/L,比出发菌株提高49.43%。采用2.3L发酵罐进行发酵试验,控制pH分两阶段培养后,ε-聚赖氨酸最高产量达到4.59g/L,比出发菌株提高了2.65倍。     

硝酸盐、镁盐对林可霉素生物合成的促进作用

在林肯链霉菌生物合成林可霉素代谢调节的研究中,发现硝酸盐可明显促进林可霉素的生物合成．加入硝酸钾０．８％,林肯链霉菌合成林可霉素的产量可增加３７％．在发酵９６ｈ之前加入硝酸盐均能促进林可霉毒的合成,但产量的增加随加入时间的延迟而降低．硝酸钾在促进产量的同时,使菌体生长减少,看来硝酸盐对林可霉素的合成与菌体生长之间起着调节作用．洗涤菌体试验指出,硝酸盐的加入诱导了林可霉素合成所需要的酶系,这可能是加入硝酸盐后,产生进一步氮代谢的结果;蛋白胨不能代替硝酸盐,进一步说明硝酸钾的作用并不是作为氮源利用．在蛋白质合成抑制剂氯霉素存在下,硝酸盐不再能促进林可霉素的合成,说明氯霉素抑制了硝酸盐或其代谢中间物所诱导的酶系的合成．同时还报导了镁盐促进林可霉素生物合成现象的初步观察结果．硫酸镁在促进林可霉素产量提高的同时,使菌体生长延迟．硫酸镁的这种作用机制可能是通过磷酸镁铵沉淀,降低了培养基中游离氨和可溶性磷酸盐浓度,解除了铵盐和磷酸盐对林可霉素合成的抑制．     

林可霉素生产中三级种子罐的发酵工艺优化

【背景】林可霉素是一种在临床应用上占有重要地位的林可酰胺类抗生素,关于调控发酵生产中三级种子罐相关参数优化林可霉素发酵工艺的研究较少。【目的】优化林可霉素发酵工艺,提高林可霉素发酵效价及市场竞争力。【方法】对林可霉素生产中三级种子罐的培养基和接种量及三级种子移种菌龄进行优化。【结果】在三级种子罐培养基中葡萄糖、淀粉、玉米浆、黄豆饼粉和硫酸铵浓度分别为64.0、5.0、15.0、14.5和3.5g/L,三级种子罐接种量为25%及三级种子移种菌龄为60h的优化条件下,林可霉素四级发酵效价高达7883U/mL,比优化前效价提高了10%。【结论】对林可霉素生产中三级种子罐相关参数进行调控,初步优化了林可霉素发酵工艺,提高了发酵效价,为优化林可霉素发酵工艺提供了新思路。     

林可霉素生物合成的研究进展

林可霉素是林可链霉菌(Streptomyces lincolnensis)产生的林可酰胺类抗生素,它抑制细菌细胞的蛋白质合成,临床上主要用于治疗革兰氏阳性菌引起的感染性疾病。林可霉素生物合成基因簇已被克隆和测序。近年来,围绕林可酰胺和丙基脯氨酸的生物合成、调控等进行了深入研究,其硫化反应取得了突破性成果,本文综述了林可霉素生物合成的新进展。     

林肯链霉菌合成林可霉素代谢调节的研究

在摇瓶条件下研究了葡萄糖、铵盐、磷酸盐对林可霉素产生菌林肯链霉菌的生长及林可霉素生物合成的影响。发酵过程中林可霉素的合成主要发生在菌体生长期,逐渐下降。使用6%的葡萄糖未发现通常所说的“葡萄糖效应”。0.2%铵盐有利于细胞生长,但0.8%NH+4对林可霉素的生物合成具有抑制作用。发酵48h后补加0.6% NH^＋_４,对林可霉素的生成没有显著影响。0.05%～0.1%磷酸盐对林可霉素合成具有较强的抑制作用。并就磷酸盐对菌体由初级代谢转向次级代谢的作用作了初步考察。     

Amplification of lmbB1 gene in Streptomyces lincolnensis improves quantity and quality of lincomycin A fermentation

Abstract

As a lincosamide antibiotic, lincomycin is still important for treating diseases caused by Gram-positive bacteria. Manufacturing of lincomycin needs efforts to, e.g. maximize desirable species and minimizing unwanted fermentation byproducts. Analysis of the lincomycin biosynthetic gene cluster of Streptomyces lincolnensis, lmbB1, was shown to catalyze the conversion of L-dopa but not of L-tyrosine and then further generated the precursor of lincomycin A. Based on the principle of directed breeding, a strain termed as S. lincolnensis 24-2, was obtained in this work. By overexpressing the lmbB1 gene, this strain produces efficacious lincomycin A and suppresses melanin generation, whereas contains unwanted lincomycin B. The good fermentation performance of the mutant-lmbB1 (M-lmbB1) was also confirmed in a 15?L-scale bioreactor, which increased the lincomycin A production by 37.6% compared with control of 6435?u/mL and reduced the accumulation of melanin by 29.9% and lincomycin B by 73.4%. This work demonstrated that the amplification of lmbB1 gene mutation and metabolic engineering could promote lincomycin biosynthesis and might be helpful for reducing the production of other industrially unnecessary byproduct.     

利用Tn5型转座突变系统筛选高产阿维菌素菌株*

目的: 转座突变技术是发现新功能基因和获得高产天然产物菌株的一种有效策略。通过理性设计和构建Tn5型转座突变系统,并将其应用于阿维链霉菌,筛选高产阿维菌素的工程菌株。方法: 在转座突变载体pUCTN转座插入片段的上游和下游分别引入链霉菌常用的强启动子kasOp*和P21,强化插入位置上游和下游基因的转录表达;在插入片段两端分别添加双向转录终止子T1和T2,有效终止插入序列两端靶基因的转录,引入强启动子和终止子的目的在于增强对转座突变株生理代谢活动的扰动。结果: 通过优化供体菌和受体菌的比例,转座效率显著提高。随机选择500株转座突变株进行发酵和阿维菌素产量测试,筛选到3株突变株的阿维菌素产量明显高于出发菌株产量的50%以上。结论: Tn5转座突变系统为研究阿维链霉菌的基因功能和生理代谢提供了有效的分子遗传工具。     

中性植酸酶产生菌的激光复合诱变筛选

采用激光复合诱变方式筛选产中性植酸酶的大肠杆菌(Escherichia coli)、枯草杆菌(Bacillus subtilis),混合波长λ=1.06 0.53μm,辐照时间1 m in,辐照功率15 W;酶的细胞定位实验表明,所产中性植酸酶是胞外酶;酶学特性测定表明,大肠杆菌所产植酸酶酶反应最适pH为7.4,最适温度为37℃,枯草杆菌所产植酸酶反应最适pH为7.4,最适温度为37℃;酶学性质分析表明,大肠杆菌所产植酸酶具有一定的pH适性和一定的温度耐受性。     

激光复合诱变选育叶酸高产菌

利用高效液相色谱测定发酵液中叶酸含量,比较产朊假丝酵母(Candida utilis)、异常汉逊酵母(ftan-senula anomala)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)产叶酸能力的高低,从而确定生产叶酸的最佳菌种.出发菌株经紫外照射诱变后,再采用激光复合诱变方式进行进一步的筛选,并对其传代稳定性进行研究,以期进一步获得稳产高产叶酸产生菌突变株.结果表明产朊假丝酵母产叶酸量最高.紫外照射3 min得到的Y1.4菌株产叶酸量与原始菌株相比,产量提高了33.8%.激光一紫外复合诱变后筛选出4株产量较高的菌株,其中以Y2.12产量最高.Y2.12产叶酸量与原始菌株相比,提高了65.8%.经传代培养分析,Y2.12诱变株的产量稳定.该结果表明,激光复合诱变是获得高产叶酸的有效途径.