哺乳动物细胞中重组蛋白瞬时表达技术（TGE）的研究进展

近年来越来越多的重组蛋白,尤其是单克隆抗体,作为生物药应用于医疗。临床及实验室研究中,经常要求在短时间内生产一定量的候选蛋白供应研究需求。经典的建立稳定细胞系生产重组蛋白过程复杂冗长,而作为替代方法,瞬时基因表达技术在数周内即可生产数十至数百毫克重组蛋白,得到广泛应用。本文将总结近年来工业及学术上,在哺乳动物细胞尤其是人胚胎肾细胞（HEK293）TL中国仓鼠卵巢细胞（CHO）中瞬时表达重组蛋白的一系列研究,概述瞬时表达技术在宿主细胞改造、表达载体最优化设计、瞬时转染条件等方面的研究进展,并展望其未来发展方向。     

哺乳动物细胞中重组蛋白瞬时表达技术(TGE)的研究进展

近年来越来越多的重组蛋白,尤其是单克隆抗体,作为生物药应用于医疗。临床及实验室研究中,经常要求在短时间内生产一定量的候选蛋白供应研究需求。经典的建立稳定细胞系生产重组蛋白过程复杂冗长,而作为替代方法,瞬时基因表达技术在数周内即可生产数十至数百毫克重组蛋白,得到广泛应用。本文将总结近年来工业及学术上,在哺乳动物细胞尤其是人胚胎肾细胞(HEK293)及中国仓鼠卵巢细胞(CHO)中瞬时表达重组蛋白的一系列研究,概述瞬时表达技术在宿主细胞改造、表达载体最优化设计、瞬时转染条件等方面的研究进展,并展望其未来发展方向。     

用于重组蛋白生产的哺乳动物细胞表达新技术

近年来,用于重组蛋白生产的哺乳动物细胞表达领域涌现出一系列革命性的新技术。优化的工程细胞为表达重组蛋白提供了优良的宿主;基于荧光的筛选方法可以快捷地得到高表达细胞株;高通量的培养工艺能够预测适合外源蛋白表达的细胞培养条件;可抛弃式生物反应器为大规模细胞培养提供了更多的选择;大规模瞬时表达技术节省了重组蛋白的生产时间。这些新技术提高了重组蛋白的研发和生产效率,加快了蛋白药物的工业化进程。     

生产药物蛋白的替代方法仍在缓慢发展

ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＮＥＷＳ 2 0 0 1年 2 1卷 2 8期第 3页报道 :多年前 ,人们已经在利用诸如ｒＤＮＡ细菌或培养的哺乳动物细胞等传统方法生产重组蛋白中遇到了重重困难。生产几千克重组蛋白的生物反应器成本需上亿元 ,哺乳动物细胞培养极易受真菌污染 ,且产量极低。因此 ,许多公司正在探索生产药物蛋白的替代方法 ,这些方法主要集中在转基因动、植物上。2 0世纪 80年代 ,一些公司如Ｇｅｎｔｙｍｅ(Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ ,ＭＡ)就开始在转基因农畜中开发ｒＤＮＡ蛋白产品。之后 ,通过转基因动植物生产重组蛋白的研究逐渐增多 ,但这方…     

哺乳动物细胞培养生产药用蛋白的关键环节

近年来,应用哺乳动物工程细胞系统生产药用蛋白显示了越业越重要的地位,本重点介绍了当前如何在生产药用蛋白的哺乳动物工程细胞表达系统,培养、生产技术,认证,生产过程组织等关键环节上进行优化,从而达到高效,安全、经济生产模式的核心技术和策略。     

生产重组蛋白的植物表达系统

作为高附加值重组蛋白生产平台,由于在成本和安全性方面的优势,植物已成为继微生物、哺乳动物等表达系统之后,获得广泛认同的极具潜力的蛋白表达系统。植物表达系统主要包括转基因植株,叶绿体转化植物,瞬时表达系统,细胞悬浮培养。综述了这些表达系统生产重组蛋白的产量和质量,尤其是各种表达系统的优缺点。     

用于重组蛋白药物生产的CHO细胞无血清培养基的研究进展

哺乳动物表达系统因其具有类似于人源化细胞的翻译后修饰方式,已经成为重组蛋白药物生产的主要表达系统.中国仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary, CHO)细胞是生产重组蛋白的理想哺乳动物细胞宿主,目前近70％批准上市的重组蛋白药物是由CHO细胞生产的.常规细胞培养所用的培养基需要补充血清才能正常生长,但血清...     

重组人蛋白C的研究进展

人蛋白C具有抗凝,促纤维蛋白溶解和潜在的抗炎作用,本在简要介绍了人蛋白C的结构,功能的基础上,重点对哺乳动物细胞和转基因动物表达重组人蛋白C的研究进展作了综述。     

登革2型病毒非结构蛋白NS4B及其突变体的真核表达与鉴定

目的：构建登革2型病毒非结构蛋白NS4B及其突变体Δ2K-NS4B基因的真核载体,并观察二者在哺乳动物细胞内的定位情况。方法：从登革2型病毒43株的全长cDNA克隆载体上扩增获得编码NS4B及缺失2K片段的NS4B突变体Δ2K-NS4B的基因;通过基因重组的方法分别将2段基因克隆入真核表达载体pcDNA6/V5-HisA,获得重组真核表达载体pc/D2-NS4B和pc/D2-Δ2K-NS4B;经脂质体法转染BHK-21细胞后,用RT-PCR、间接免疫荧光和Western印迹鉴定表达的蛋白。结果：重组蛋白D2-NS4B和D2-Δ2K-NS4B可在BHK-21细胞中表达,二者均定位于细胞质中,并具有较好的抗原性,能够被抗登革2型病毒NS4B的多克隆抗体特异识别。结论：重组蛋白D2-NS4B和D2-Δ2K-NS4B在哺乳动物细胞胞质中的正确表达,为深入了解NS4B在登革病毒致病过程中的生物学功能奠定了基础。     

哺乳动物细胞表达系统研究进展

目前,哺乳动物细胞已成为生产多种生物药物的首选宿主细胞。哺乳动物细胞表达系统可进行翻译后修饰,表达的重组蛋白接近人源构象,因此被大量用于治疗性重组蛋白的生产,如何建立高效的哺乳动物细胞表达系统也受到研究者们的重视。随着基因组学、转录组学、蛋白质组学以及代谢组学研究不断深入,近几年来在优化哺乳动物表达系统方面取得了长足的进步。从高效表达载体构建、宿主细胞改造、高通量筛选、培养基优化等方面阐述哺乳动物细胞表达系统的研究进展,以期为研究者们提供一定的帮助。     

《大规模哺乳动物细胞培养技术》

本书着重介绍了如何利用细胞生物学、生物化学、发酵、病毒学、微生物学及蛋白化学等方面的技术和方法进行大规模的细胞培养和蛋白质药物的生产。 内容包括:1.大规模哺乳动物细胞培养;2.重组DNA技术在哺乳动物细胞工程及     

基因工程菌合成哺乳动物蛋白的下游加工问题

70年代兴起的基因工程,使人们很快地看到这一新技术的巨大潜力,迄今为止,通过多种高效大肠杆菌载体系统的构建和应用,使许多原核和真核蛋白,特别是哺乳动物蛋白都可在大肠杆菌中成功地生产。这些蛋白高水平的表达是由于通过克隆该蛋白的编码顺序到多拷贝质粒上的强启动子,和核糖体的结合部位之后,从而构成重组表达质粒。运用这种技术所克隆的基因在大肠杆菌中表达时,蛋白的积累可高达大肠杆菌体总蛋白的50％。     

利用转基因植物生产生物药

传统的生物技术常利用哺乳动物细胞、细菌和真菌培养作为转基因系统 ,来生产生物药。鉴于今后对生物药例如治疗贫血的红细胞生成素和治疗糖尿病的胰岛素 ,以及通过基因组研究发现的新的药用蛋白的需求量均将大量增加 ,故有必要利用另一种转基因系统来生产价格既低廉 ,使用又安全的重组生物药。认为适合于上述目的者为高等植物。利用转基因植物来生产重组药用蛋白和肽有很多优点 ,例如 :(1)植物容易转化 ;(2 )使用安全 ,因植物不是人类病原体的宿主 ,故与动物细胞培养比较 ,利用重组植物生产的生物药不论提纯与否 ,都不大有可能污染人类病原…     

利用哺乳动物细胞表达外源蛋白的研究进展

利用哺乳动物细胞表达外源蛋白已广泛应用于生物产品的制备,哺乳动物细胞是表达具有天然活性蛋白的最佳宿主,且具有易被转染,遗传稳定,产物可分泌表达,并易于纯化和大规模生产等方面的优势。本文对选择载体类型,载体元件（包括启动子,增强子,选择标记等）以及在哺乳动物细胞大规模培养过程中培养环境,细胞凋亡的抑制和控制细胞增殖和基因表达的Tet-switch系统等方面的进展作一综述,以探讨提高该系统表达产量的有效方法,更好地应用于生物制品的生产。     

杆状病毒用于哺乳动物细胞快速高效表达外源基因的研究

现已发现杆状病毒可进入某些培养的哺乳动物细胞,这提示可将杆状病毒作为一种对哺乳动物细胞的新型基因转移载体。对杆状病毒转移载体的改造及对哺乳动物细胞的基因转移方式进行了进一步的研究。以绿色荧光蛋白基因为报告基因,利用Bac-to-Bac系统构建了分别含有正向和反向CMV启动子表达盒的两种重组杆状病毒。可观察到CMV启动子在Sf9细胞中可启动报告基因的表达,但表达效率较低。用重组杆状病毒感染后Sf9细胞的培养上清直接与HepG2细胞作用,以流式细胞术检测基因转移效率及荧光表达强度,发现这两种病毒在相同的感染复数下对HepG2细胞具有相似的基因转移及表达效率。同时,利用流式细胞术进一步研究了直接使用重组杆状病毒感染4d后Sf9细胞的培养上清对哺乳动物细胞进行基因转移的方法。通过对HepG2细胞的实验结果显示,将带毒Sf9细胞培养上清(1.2×10⁷PFU/mL)用哺乳动物细胞培养基1倍稀释后,37℃下孵育靶细胞12h(moi=50),可达到较高的基因转移及表达效率,同时不会对细胞造成明显损伤。将重组杆状病毒与脂质体和逆转录病毒这两种系统对HepG2及CV1细胞的基因转移效率进行了比较,结果发现在同样未经浓缩等特殊处理的条件下重组杆状病毒对这两种细胞的基因转移效率是最高的。因此可以认为,经过适当改造后的Bac-to-Bac重组杆状病毒系统可作为一种对哺乳动物细胞简便高效的基因转移表达载体。     

衣藻叶绿体表达重组蛋白及表达优化策略

近年来,转基因技术已日趋成熟,医学、工业上的应用也越来越广泛。以重组蛋白为基础的药物治疗是目前医药生产领域发展最快的一项技术。它们的高特异性和低副作用使得治疗效率十分突出。但是重组蛋白表达的复杂性也给生产带来了一定限制。为了促进重组蛋白的应用,人们对适宜其表达的系统和能促进其表达的策略进行了探索。研究发现,衣藻叶绿体作为重组蛋白的生物反应器,能实现重组蛋白快速、高效、低成本生产。同时,衣藻能在人工培养基和人为控制的条件下生长,降低了受污染的风险,与传统的生产系统比较具有不可比拟的优越性。因此,衣藻叶绿体作为医药重组蛋白生物反应器在未来的生物技术领域将发挥巨大作用。     

蛛丝蛋白研究及其应用前景

蛛丝是由高度特化的上皮细胞分泌的多聚蛋白纤维组成的,这些多聚蛋白质纤维又是由存在着高度重复序列的水溶性的蛋白单体聚合而成的,蛛网牵引丝的强度,韧性和模系数都可与人工合成的高性能的纤维相媲美,故称生物钢,已经在哺乳动物细胞中获得表达的有60,110和140kD等几种不同分子量的重组蛛丝蛋白,而且表达的这些重组蛋白质都是分泌性的,利用表达的这些重组蛋白质经过抽丝和牵拉等工艺之后获得的人造蛛丝具备了天然蛛丝的各项机械性能,作为一种新兴的生物材料,具有巨大的开发应用前景。     

CRISPR-Cas9基因编辑技术对细胞内源蛋白进行荧光标记的实验操作

CRISPR-Cas9是目前广泛应用的基因编辑技术,可对目的基因进行高效精准编辑,快速实现目的基因的敲除或敲入。Cas9蛋白在sgRNA引导下对靶序列进行剪切并造成DNA双链断裂,在与剪切位点两端同源的DNA模板序列存在时,可通过同源重组修复方式引入外源序列,实现荧光蛋白或其他标签在基因组上的精准敲入,进而实现对内源蛋白进行荧光标签的融合标记。通过基因编辑技术对内源目的蛋白进行标记,可避免由于过表达造成蛋白质定位、动力学或功能等的潜在影响,可显著提升细胞成像实验的稳定性和可重复性。本文重点介绍了利用CRISPR-Cas9基因编辑系统对目的蛋白进行荧光蛋白或自标记蛋白标签标记的方法与操作流程,为构建内源蛋白荧光标记的哺乳动物细胞系提供参考。     

用于药用蛋白生产的外源表达系统

种表达系统在重组蛋白生产上将长期共存.而通过遗传改造、基因组学、蛋白质组学等研究方法不断改进各种外源蛋白表达系统的性能,不断建立更加优越的外源蛋白表达系统则是大家共同努力的目标.     

重组人PLCζ蛋白在昆虫细胞/杆状病毒表达系统内的表达、纯化及活性测定

PLCζ是PLC家族的一种新型同工酶,在哺乳动物卵母细胞激活中起着极其重要的作用。近年来,体外大量表达和纯化有活性的PLCζ蛋白用于结构生物学研究一直未能获得成功。本研究首次在杆状病毒表达系统中表达和纯化重组人PLCζ蛋白,首先将人PLCζ基因克隆至pFastBac-HTA质粒构建重组载体,转化DH10Bac发生位点特异性转座,经抗性和蓝白斑筛选,获得重组穿梭质粒Bacmid-PLCζ;在脂质体介导下将穿梭质粒转染Sf9昆虫细胞产生重组病毒,扩增病毒感染Sf9昆虫细胞进行蛋白表达;利用Ni~(2+)亲和柱及分子筛来纯化蛋白,并通过考马斯亮蓝染色、Western blotting及飞行时间质谱对蛋白进行鉴定,并进行酶活性测定。结果显示重组蛋白在Sf9昆虫细胞感染杆状病毒后72 h达到峰值并以分泌形式表达在细胞培养基中,Ni~(2+)亲和柱及分子筛纯化后的重组蛋白经Western blotting及电离飞行时间质谱鉴定为PLCζ蛋白,酶活性可达326.8 U/mL。该实验结果为重组人PLCζ蛋白大规模生产和生物医学应用研究提供了可参考利用的技术。