黄病毒NS2B-NS3pro蛋白酶的结构研究进展

黄病毒能引起严重的人类疾病,但是并无特定药物来治疗病毒感染。黄病毒非结构蛋白NS3的N端区域及其辅因子NS2B构成蛋白酶,该酶切割病毒的多聚蛋白形成成熟的结构蛋白和非结构蛋白来帮助病毒完成增殖过程。NS2B-NS3pro蛋白酶在黄病毒生命周期中起关键的作用,使之成为抗病毒药物研发的重要靶标。本文综述了黄病毒属中寨卡病毒、登革热病毒、西尼罗病毒的NS2B-NS3pro蛋白酶结构的研究进展,并介绍了相关抑制剂与蛋白酶形成的复合物结构,以期为研发抗黄病毒药物提供必要的参考。     

具有蛋白酶及解旋酶活性的HCV-NS3重组蛋白的纯化及活性分析

为深入探讨HCV-NS3蛋白的酶动力学性质,制备了具有蛋白酶及解旋酶活性的HCVNS3重组蛋白。利用PCR扩增HCV非结构基因NS3,插入pPIC9,测序分析。携带NS3基因的重组质粒(pPIC9-NS3)转化毕氏酵母菌菌株GS115,甲醇诱导表达NS3蛋白。重组蛋白首先采用Hitrap chelating柱进行亲和分离,之后使用Mono S HR柱进一步纯化。对纯化后的NS3重组蛋白的酶活性进行分析,结果表明,获得的重组蛋白分别具有蛋白酶及解旋酶活性。本研究为深入探讨NS3编码酶的功能和开发抗病毒药物创造条件。     

具有蛋白酶及解旋酶活性的HCV-NS3重组蛋白的纯化及活性分析

为深入探讨HCV-NS3蛋白的酶动力学性质,制备了具有蛋白酶及解旋酶活性的HCV NS3重组蛋白.利用PCR扩增HCV非结构基因NS3,插入pPIC9,测序分析.携带NS3基因的重组质粒(pPIC9-NS3)转化毕氏酵母菌菌株GS115,甲醇诱导表达NS3蛋白.重组蛋白首先采用Hitrap chelating柱进行亲和分离,之后使用Mono S HR柱进一步纯化.对纯化后的NS3重组蛋白的酶活性进行分析,结果表明,获得的重组蛋白分别具有蛋白酶及解旋酶活性.本研究为深入探讨NS3编码酶的功能和开发抗病毒药物创造条件.     

圣路易斯脑炎病毒NS2B-NS3蛋白酶的原核表达及其抑制剂的筛选

【目的】圣路易斯脑炎病毒(St. Louis encephalitis virus,SLEV)属于黄病毒科,是一种单股正链RNA病毒。黄病毒编码的非结构蛋白NS3在病毒复制以及多聚蛋白加工过程中起着重要作用,NS2B是其发挥作用的重要辅助因子。因此,NS2B-NS3蛋白酶复合物是抗病毒药物的重要靶标。本研究旨在构建SLEV NS2B-NS3蛋白酶的原核表达系统并建立其抑制剂的高通量筛选方法,从而发现其小分子抑制剂。【方法】通过PCR扩增SLEVNS2B-NS3蛋白的编码区,构建原核表达质粒;在大肠杆菌BL21(DE3)中,经异丙基硫代半乳糖苷(Isopropyl β-D-thiogalactoside)诱导得到可溶性的NS2B-NS3蛋白,并用镍亲和层析方法进行纯化;基于荧光共振能量转移(Fluorescence resonance energy transfer)技术检测NS2B-NS3蛋白酶活性,建立其抑制剂的高通量筛选平台。【结果】SLEV NS2B-NS3蛋白酶纯化程度高达95%以上,基于酶活测定的抑制剂筛选平台准确可行。对700多个上市药物进行筛选后,发现原花青素对SLEVNS2B-NS3蛋白酶具有明显的抑制活性。【结论】本研究为SLEVNS2B-NS3蛋白酶抑制剂提供了一种操作方便、高通量的筛选方法,并首次发现了原花青素具有抑制SLEV NS2B-NS3蛋白酶活性的功能,可以作为治疗SLEV感染的潜在靶向药物。     

庚型肝炎病毒NS3蛋白在昆虫细胞中的表达

庚型肝炎病毒(HGV)/GB病毒C(GBV-C)疑似引起人类庚型肝炎[1～3].HGV和GBV-C为同一病毒的两个不同分离株,本文将其称为GBV-C/HGV.GBV-C/HGV属黄病毒科,为单股正链RNA病毒,全长约9.4kb.基因组中仅含有一个单一开放阅读框,编码E1、E2结构蛋白和NS2、NS3、NS4及NS5非结构蛋白.GBV-C/HGV的NS3蛋白具备丝氨酸蛋白酶活性和解旋酶活性[3],在NS3蛋白中还存在线性抗原表位[4],因此,NS3蛋白是GBV-C/HGV的重要功能蛋白.     

日本脑炎病毒NS3蛋白酶活性检测及抑制剂高通量筛选方法的建立

日本脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)是单股正链RNA病毒,全基因组仅含有一个开放阅读框,编码一条多聚蛋白前体,病毒编码的NS3蛋白酶在JEV多聚蛋白加工过程中起着重要作用,是重要的药物靶标。通过PCR扩增了NS2BH-NS3蛋白酶的编码区,构建了原核表达质粒并转化到大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导得到可溶性的NS3蛋白酶,用镍亲和层析方法进行了纯化。建立了基于荧光共振能量转移的NS3蛋白酶活性检测方法,并确定了最佳的反应条件,对113个化合物进行了筛选,发现其中两个化合物对JEV NS3蛋白酶具有一定的抑制活性。本研究为JEV NS3蛋白酶的活性研究及抑制剂筛选提供了一种操作方便、成本低廉的方法。     

丙型肝炎病毒的非结构蛋白3抑制剂

丙型肝炎严重威胁人类健康,非结构蛋白3（NS3）在丙型肝炎病毒（HCV）多聚蛋白水解过程中起重要作用,被公认为治疗丙型肝炎的有效药物靶标。该文介绍目前国内外有关NS3蛋白酶抑制剂（包括寡肽类抑制剂和非肽小分子抑制剂）的研究进展。     

丙型肝炎病毒NS3蛋白酶在酵母系统中的可溶性表达

利用毕赤酵母系统表达具有催化活性的丙型肝炎病毒 (HCV)NS3蛋白酶 .将PCR直接扩增的病毒NS3丝氨酸蛋白酶基因和重组的带有辅酶的单链NS3 NS4A蛋白酶基因 ,分别插入表达载体pPICZαA的EcoRⅠ和XbaⅠ克隆位点 ,转化毕赤酵母GS115 ,可溶性表达NS3蛋白酶和单链NS3 4A蛋白酶 ;ELISA法测定表达蛋白酶的抗原性 ;原核高效表达载体pBVIL1表达酶切底物NS5A B片段 ,体外与蛋白酶共同温育 ,SDS PAGE鉴定蛋白酶催化活性 .载体测序结果表明 ,重组载体pPICZαA NS3和pPICZαA NS3 4A中的目的基因序列插入正确 ;SDS PAGE结果显示 ,培养物上清中存在分泌型目的蛋白带 ;ELISA结果证实 ,表达蛋白与HCV阳性血清有结合活性 ;蛋白酶与底物NS5A B片段不同作用时间的SDS PAGE ,看到约 2 4kD处底物条带的分解 .说明用毕赤酵母表达系统成功地表达了可溶性HCVNS3和单链NS3 4A蛋白酶 ;两种结构形式的蛋白酶在体外系统中都有催化活性 ,同时也都具有抗原性 .该研究为大量和方便地获得有催化活性的HCVNS3蛋白酶提供了有效途径 .     

一种新的丙型肝炎病毒单链丝氨酸蛋白酶基因的构建、表达与鉴定

根据丙型肝炎病毒 (HCV)丝氨酸蛋白酶晶体结构特点 ,设计并构建了一种新的单链型丝氨酸蛋白酶分子 .该分子由辅因子NS4A的核心序列、柔性连接子GSGS和NS3丝氨酸蛋白酶结构域组成 .利用设计的 3条引物 ,通过 2轮PCR获得单链丝氨酸蛋白酶基因 ,插入原核表达载体pQE30中 ,转化大肠杆菌M15 ,获得重组克隆 .经低剂量诱导和低温培养 ,目的基因获得高水平可溶表达 .以金属螯合层析法纯化的重组蛋白纯度达 95 %以上 .间接ELISA法检测 98份血清证实 ,该蛋白具有良好的抗原性和特异性 ;以重组蛋白底物NS5ab和单链丝氨酸蛋白酶建立了简便、实用的丝氨酸蛋白酶体外活性检测系统 ;以该系统观察了PMSF和EDTA对蛋白酶活性的影响 .结果表明 ,PMSF能够抑制蛋白酶的酶切活性 ,而EDTA不能抑制酶的活性 .单链型HCV丝氨酸蛋白酶的成功表达以及体外活性检测系统的建立 ,为丝氨酸蛋白酶抑制剂的研制奠定了物质基础 .     

A型流感病毒NS1蛋白结构研究进展

近年来A型流感严重威胁着人类和畜禽的健康,随着研究的深入,人们已经发现A型流感病毒的NS1蛋白对病毒毒力有重要影响,是一个多功能毒力因子、宿主细胞抗病毒免疫抑制子。根据其功能的不同分为效应区和RNA结合域。目前NS1蛋白结构已经解析,使人们可以直观的认识其各个功能位点的作用机制。该文综述了NS1蛋白的结构特征、已知的功能位点及其功能,为在结构水平上研究NS1蛋白的功能提供参考。     

丙型肝炎病毒基因组结构及功能

丙型肝炎病毒（hepatitis C virus, HCV）是单股正链的RNA 病毒,全长为9.6 kb,包括1个大的开放阅读框（ORF）和两侧的5′,3′非编码区（UTRs）.核糖体通过进入HCV 5′UTR 端的内部核糖体进入位点（IRES）,将HCV基因组翻译成1个聚蛋白前体.前体聚蛋白被宿主和病毒的蛋白酶共同切割成为若干个具有独立功能的HCV蛋白,根据功能的不同分别命名为C、E1、E2、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A 和NS5B,它们不但在HCV的生活史中发挥着重要的作用,也影响着宿主细胞的信号传导、凋亡及物质代谢等一系列生化过程.近年来,随着HCV体外细胞摸型的不断发展,其病毒分子生物学方面的研究取得了很大的进展.本文从基因组结构及其编码的蛋白功能等方面阐述了HCV病毒的研究进展,为致病机理的研究及抗HCV药物的开发和疫苗研制等提供理论基础.     

HCV NS3/4A蛋白酶与Faldaprevir类似物的分子识别机制及其复合物运动模式

Faldaprevir类似物(Faldaprevir analogue molecule,FAM)能有效抑制HCV NS3/4A蛋白酶的催化活性,是一种潜在抗HCV先导化合物。通过生物信息学统计分析了已报道的HCV NS3/4A蛋白酶晶体结构,得到了FAM-HCV NS3/4A蛋白酶晶体结构。对FAM-HCV NS3/4A蛋白酶复合物进行了20.4 ns的分子动力学模拟,重点从氢键和结合自由能两个角度分析了二者分子识别中的关键残基及结合驱动力。氢键和范德华力是促使FAM特异性结合到蛋白V132?S139、F154?D168、D79?D81和V55的活性口袋中的主要驱动力,这与实验数据较为吻合。耐药性突变实验分析了R155K、D168E/V和V170T定点突变对FAM分子识别的影响,为可能存在的FAM耐药性提供了分子依据。最后,用自由能曲面和构象聚类两个方法探讨了体系的构象变化,给出体系的4种优势构象,为后续的基于HCV NS3/4A蛋白酶结构的Faldaprevir类似物抑制剂分子设计提供一定的理论帮助。     

A型流感病毒NS1蛋白与宿主的相互作用

A型流感病毒非结构蛋白1(nonstructural protein l, NS1)全长约为230个氨基酸,主要包括两个功能结构域,即 N-末端的RNA结合结构域和C-末端的效应结构域.NS1是一个多功能病毒蛋白,它不仅影响着该病毒其他基因的表达,更能通过与宿主细胞多种因子的相互作用干预宿主细胞的正常功能,抵抗宿主的抗病毒系统.因此, NS1被认为是A型流感病毒的一个重要毒力因子.本文综述了 NS1蛋白与宿主相互作用的最新研究进展,为进一步揭示NS1 蛋白的功能提供了参考.     

禽流感病毒H5N1亚型NS1蛋白的研究进展

NS1蛋白（non—structural protein1）是A型流感病毒重要的非结构蛋白,作为流感病毒的致病因子,NS1通过多种方式增强病毒的致病性和毒力。就H5N1禽流感病毒NS1蛋白的结构与功能进行了综述。     

可调控表达人博卡病毒1型非结构蛋白NS1稳定细胞系的建立及其反式转录激活作用初探

人博卡病毒1型(Human bocavirus 1,HBoV1)非结构蛋白NS1是多功能蛋白,对病毒复制有重要作用,同时可诱导宿主细胞凋亡。在研究NS1蛋白功能时,降低NS1蛋白对宿主细胞的毒性作用是急需解决的问题。基于此,文中建立了可调控表达HBoV1非结构蛋白NS1的稳定细胞系。构建NS1重组慢病毒质粒(含可调控启动子),应用转染试剂将NS1重组慢病毒质粒转染至HEK293T细胞。通过嘌呤霉素筛选抗性细胞、多西环素诱导NS1表达,建立可稳定表达NS1-100、NS1-70蛋白的HEK 293T细胞系,利用荧光标记蛋白和Western blotting检测,确定NS1蛋白的表达。并在稳定表达NS1细胞系中转染HBoV1启动子-荧光素酶基因的质粒,分析NS1的反式转录激活活性。结果表明NS1蛋白可在建立的细胞系中稳定表达,且稳定表达NS1蛋白对HBoV1启动子有较强的激活活性,为进一步研究非结构蛋白NS1的功能及人博卡病毒致病机理奠定了良好的基础。     

HCV NS3/4A蛋白酶胞内荧光检测方法的建立

目的:建立丙型肝炎病毒NS3/4A丝氨酸蛋白酶胞内荧光检测方法。方法:利用EGFP分子内合适位点可以插入一定长度外源片段而不影响荧光性能的特性,构建EGFP分子内插入NS3/4A蛋白酶识别序列NS5AB的EGFP-5AB重组分子。将EGFP-5AB与NS3/4A蛋白酶共表达,若短肽链被切断,则EGFP的两个部分解离,荧光消失,从而可以监测HCV NS3/4A蛋白酶的存在。通过将NS5AB插入三种不同位点,寻找最合适的插入位点;将EGFP-5AB转染进入不同宿主细胞,验证其在不同细胞的表达情况并选择最佳宿主细胞。结果:确定EGFP 173-174氨基酸位点是合适的插入位点;确定CHO-K1为理想的荧光检测系统宿主细胞;在构建的细胞模型中,能够检测到EGFP被切割后的条带,但检测不到荧光信号,说明EGFP-5AB蛋白被有效切割,该方法可以检测到NS3/4A丝氨酸蛋白酶的存在。结论:成功构建了一种在哺乳动物细胞中检测NS3/4A蛋白酶切割活性的荧光检测方法。     

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS2的研究进展

丙型肝炎病毒（hepatitis C virus,HCV）是一种严重危害人类健康的病原体,全球感染率约3％,中国普通人群抗HCV阳性率约3．2％。然而,到目前为止,HCV感染还没有有效的治疗方法。近年的研究发现,HCV非结构蛋白NS2在HCV感染中扮演着重要角色,具有许多重要功能。NS2可以在HCV病毒的包装过程中发挥其功能,还可调节宿主细胞的基因表达及凋亡过程。此外,NS2蛋自还可参与NS5A磷酸蛋白的高度磷酸化修饰过程及为感染性HCV病毒粒子产生所必需。本文综述近几年来关于NS2蛋白的研究进展。     

SARS冠状病毒PLpro蛋白酶的结构与功能

SARS冠状病毒基因组编码2种病毒蛋白酶,即木瓜样蛋白酶（PLpro）和3C样蛋白酶(3CLpro).其中,PLpro蛋白酶结构与功能研究是近年来冠状病毒分子生物学研究的热点之一. PLpro蛋白酶参与SARS冠状病毒1a(1ab)复制酶多聚蛋白N端部分的切割加工,是SARS冠状病毒复制酶复合体(RC)形成的重要调节蛋白分子;最新研究表明,SARS冠状病毒PLpro蛋白酶是一种病毒编码的去泛素化酶（DUB）,对细胞蛋白具有明显去泛素化作用;而且对泛素(Ub)和泛素样分子ISG15均具有活性. PLpro蛋白酶对宿主抗病毒天然免疫反应具有负调节作用,是SARS冠状病毒的一种重要干扰素拮抗分子.PLpro蛋白酶是一种多功能病毒蛋白酶.本文结合作者课题组研究工作,对SARS冠状病毒PLpro蛋白酶结构和功能研究最新进展进行综述.     

家蚕浓核病毒中国株非结构蛋白1(NS1)的表达

利用PCR技术扩增出BmDNV-3 NS1基因,将目的基因与原核表达载体pET-30a进行连接,转化BL21 star菌并在该菌中表达,经Western blot鉴定表达的产物为BmDNV-3 NS1蛋白,纯化NS1蛋白并制备兔多克隆抗体.同时BmDNV-3 NS1基因亚克隆到杆状病毒转移载体pFastBae-HTb-eGFP中,转化BmDH10BAC感受态细胞,提取的重组Bacmid通过脂质体包埋转染家蚕BmN细胞,再以收获的重组病毒感染家蚕幼虫.家蚕BmN细胞和幼虫感染重组病毒2d后均观察到绿色荧光,经SDS-PAGE分析真核表达的产物与预测的NS1-eGFP融合蛋白大小不一致,说明NS1-eGFP融合蛋白被昆虫内源性的蛋白酶降解.降解的产物用NS1蛋白抗体进行Western blot鉴定为BmDNV-3 NS1蛋白.     

小RNA病毒3C蛋白酶及其裂解底物

小RNA病毒科是一类大的动物病毒科,小RNA病毒蛋白的合成需要自身蛋白酶裂解形成多个结构蛋白和功能蛋白,3C蛋白酶是一些小RNA病毒的自身蛋白水解酶之一,3C蛋白酶还可以裂解一些宿主的蛋白,利于病毒的复制。3C蛋白酶结构特点、活性中心、酶切位点如何,裂解的底物功能怎样,是进一步了解3C蛋白酶作用机制的关键。就这些问题进行综述。