人Nek2蛋白原核表达纯化及其多克隆抗体制备

目的:通过原核表达系统表达人Nek2蛋白,优化表达条件并纯化Nek2蛋白,制备抗Nek2多克隆抗体。方法:将Nek2基因片段构建到原核表达载体pET30a(+)上,转化大肠杆菌BL21(DE3);加入诱导剂IPTG诱导表达,对诱导温度、诱导剂IPTG终浓度、诱导时间等条件进行优化;利用12%SDS-PAGE后250mmol/L KCl染色切胶纯化蛋白质,将纯化后的Nek2蛋白进行质谱鉴定;纯化Nek2蛋白免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,运用ELISA、Western blot和免疫荧光实验检测多克隆抗体效价和特异性。结果:构建了pET30a(+)-Nek2重组原核表达质粒,诱导的重组人Nek2蛋白主要以包涵体的形式存在;蛋白质的最适诱导表达条件为28℃,180r/min条件下加入终浓度为0. 2mmol/L IPTG诱导32h;质谱分析纯化后的蛋白质为Nek2蛋白,最终获得浓度为1. 35mg/ml纯化后的Nek2蛋白;纯化蛋白免疫小鼠,多克隆抗体效价大于1∶243 000,且具有良好的抗原特异性;免疫荧光实验显示Nek2主要定位于细胞质和细胞核。结论:利用重组人Nek2蛋白获得具有良好抗原特异性的抗Nek2多克隆抗体。     

切胶纯化表达蛋白包涵体的可行性分析

目的:高效率地纯化以包涵体形式表达的蛋白。方法:将SDS-PAGE电泳后的目的蛋白用4mol/L的乙酸钠显现出来,切割下来的目的蛋白可直接用于免疫,将切割下来的目的蛋白装在透析袋中,在电场中将游离的目的蛋白洗脱下来可用于ELISA检测。结果:用该法得到的蛋白经ELISA和Western blot检测均能保持其原有的抗原性,并用该法纯化的蛋白成功制备了相应的多抗和单抗。结论:证实了回收的蛋白仍能保留原有的抗原性,与传统的方法比较,方法简单且比较经济实用特别是包涵体,为切胶纯化蛋白提供了一个新的方法。     

丙型肝炎病毒ns3区全长基因在大肠杆菌中的高效表达及纯化

利用PCR技术扩增HCV ns3基因,经BamHⅠ和HindⅢ双酶切后与原核表达质粒pProEX—HTb连接,转化感受态细胞Ecoli DH50α,酶切鉴定得阳性重组质粒pProEX—HTb—ns3并测序;pProEX—HTb—ns3转化宿主细胞获得工程菌,用IPTG诱导,获得NS3蛋白的高效表达,薄层扫描显示其占菌体总蛋白的35％;目的蛋白在变性条件下经Ni^2 -NTA凝胶亲和层析纯化,透析并浓缩后用丙型肝炎患阳性血清做为一抗行Western—Blot证实特异性和抗原性。结果成功表明,诱导表达产物主要以包涵体形式存在;6His—NTA纯化后获得目的蛋白,Western—blot结果显示纯化蛋白具有良好的抗原性。HCVNS3蛋白的高效表达及纯化,为利用NS3蛋白作为诊断抗原及制备单克隆抗体奠定了基础。     

人Nek2蛋白原核表达纯化及其多克隆抗体制备 *

目的通过原核表达系统表达人Nek2蛋白,优化表达条件并纯化Nek2蛋白,制备抗Nek2多克隆抗体.方法 将Nek2基因片段构建到原核表达载体pET30a(+)上,转化大肠杆菌BL21 (DE3);加入诱导剂IPTG诱导表达,对诱导温度,诱导剂IPTG终浓度,诱导时间等条件进行优化;利用12% SDS-PAGE后250mmol/L KCl染色切胶纯化蛋白质,将纯化后的Nek2蛋白进行质谱鉴定;纯化Nek2蛋白免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,运用ELISA,Western blot和免疫荧光实验检测多克隆抗体效价和特异性.结果 构建了pET30a(+)-Nek2重组原核表达质粒,诱导的重组人Nek2蛋白主要以包涵体的形式存在;蛋白质的最适诱导表达条件为28℃,180r/min条件下加入终浓度为0.2mmol/L IPTG诱导32h;质谱分析纯化后的蛋白质为Nek2蛋白,最终获得浓度为1.35mg/ml纯化后的Nek2蛋白;纯化蛋白免疫小鼠,多克隆抗体效价大于1∶243 000,且具有良好的抗原特异性;免疫荧光实验显示Nek2主要定位于细胞质和细胞核.结论: 利用重组人Nek2蛋白获得具有良好抗原特异性的抗Nek2多克隆抗体.     

幽门螺杆菌重组vacA-CtxB蛋白的原核表达及免疫学研究

目的原核表达幽门螺杆菌pQE-vctB(含H.pylori细胞空泡毒素毒性片段与霍乱毒素B亚单位的融合基因)在E.coil DH5α中诱导表达,以获得重组蛋白,鉴定其抗原性和免疫原性,为制备防治H.pylori感染的口服疫苗奠定基础。方法 (1)pQE-vctB转化E.coli DH5α,IPTG诱导表达重组蛋白VCTB,Western blot分析抗原性,镍离子柱纯化。(2)重组蛋白VCTB口服免疫小鼠,ELISA检测小鼠血清特异性IgG、小肠冲洗液IgA,以鉴定其免疫原性。结果重组蛋白VCTB经SDS-PAGE分析相对分子量(Mr)约为40kD,亲和层析后可获得纯度为92%以上的蛋白。Western blot分析显示能与VacA抗血清反应。ELISA检测显示,免疫小鼠的血清特异性抗体IgG,肠粘液IgA显著高于VacA对照组(P0.01)。结论 vacA和ctxB融合基因原核表达质粒转化E.coli DH5α表达菌获得了重组蛋白VCTB,表达量较高,纯度较高,有良好的抗原性和免疫原性,口服免疫小鼠可明显提高其免疫效果,产生较高水平的IgA,可用于制备防治H.pylori感染的口服疫苗。     

猪瘟病毒Erns在杆状病毒系统中的表达和纯化

采用Bac-to-Bac表达系统构建重组杆状病毒rAcV-MBP-Erns,感染Sf9昆虫细胞,经免疫荧光及Western blot分析证实MBP-Erns融合蛋白在Sf9细胞中高效表达。表达的MBP-Erns以可溶和包涵体两种形式存在。在Sf9细胞中规模化增殖重组病毒,经Amylose Resin亲和层析纯化获得高纯度MBP-Erns,制备的MBP-Erns具有良好免疫原性,这些工作为研究该蛋白的生物学功能和免疫原性奠定基础。     

肠产毒性大肠埃希菌F4ac菌毛蛋白FaeG亚单位的原核表达及免疫学鉴定

目的克隆并表达肠产毒性大肠埃希菌（ETEC）F4ac菌毛蛋白亚单位FaeG,为制备预防幼畜ETEC感染的疫苗奠定基础。方法以ETEC（C83902）基因组DNA为模板,PCR扩增faeG基因,插入原核表达质粒pGEX-6P-1,构建重组质粒pGEX-faeG。将pGEX-faeG转化大肠埃希菌BL-21I,PTG诱导表达。SDS-PAGE分析表达蛋白的相对分子质量和表达形式,Western blot鉴定其抗原性。将表达菌超声破碎后离心提取包涵体制备抗原,经口灌喂免疫小鼠,检测小鼠血清中抗FaeG的IgGI、gA,鉴定其免疫原性。结果扩增的faeG基因全长786 bp,与基因文库中的faeG基因同源性达96%。重组质粒pGEX-faeG经PCR及双酶切鉴定确有插入片段,且序列完整。表达产物FaeG相对分子质量约53 kD,主要存在于碎菌后的沉淀中,以包涵体形式表达。Western blot显示该蛋白可与ETEC F4ac阳性血清特异性结合,免疫后小鼠血清抗FaeG IgGI、gA明显高于PBS和GST对照组。结论成功构建了ETEC F4ac菌毛蛋白亚单位FaeG的重组质粒pGEX-faeC,表达了重组蛋白FaeG,该蛋白具有良好的抗原表达了重组蛋白FaeG,该蛋白具有良好的抗原性和免疫原性,可用于研制预防幼畜ETEC感染的疫苗。     

研究报告重组Ⅱ型登革病毒NS1的表达及其免疫原性的研究

目的：表达制备重组Ⅱ型登革病毒非结构蛋白NS1,检测该重组表达蛋白的免疫原性,为检测试剂盒的研制提供基础。方法：根据Ⅱ型登革病毒NS1蛋白基因序列（GenBank 登录号：NC_001474）,对基因序列进行编码密码子优化后进行全基因合成,随后,经双酶切将目的片段克隆到表达载体pET28a上,通过IPTG诱导表达;表达产物经Western blot鉴定后,进一步进行蛋白纯化和透析复性,制备获得重组Ⅱ型登革病毒NS1蛋白。收获的NS1蛋白免疫小鼠,制备多克隆抗体,通过间接酶联免疫学方法测定其效价,检测其免疫原性。结果：成功构建了Ⅱ型登革病毒NS1蛋白的表达载体。Western blot显示表达的重组蛋白能够被NS1单抗特异性的结合,纯化复性后的重组蛋白在小鼠体内表现出良好的免疫原性。结论：重组表达的NS1蛋白有良好的免疫原性,为以后的NS1单克隆抗体的制备和登革病毒检测试剂盒的研制提供了良好的基础。     

重组Ⅱ型登革病毒NS1的表达及其免疫原性的研究

目的:表达制备重组Ⅱ型登革病毒非结构蛋白NS1,检测该重组表达蛋白的免疫原性,为检测试剂盒的研制提供基础。方法:根据Ⅱ型登革病毒NS1蛋白基因序列(GenBank登录号:NC_001474),对基因序列进行编码密码子优化后进行全基因合成,随后,经双酶切将目的片段克隆到表达载体pET28a上,通过IPTG诱导表达;表达产物经Western blot鉴定后,进一步进行蛋白纯化和透析复性,制备获得重组Ⅱ型登革病毒NS1蛋白。收获的NS1蛋白免疫小鼠,制备多克隆抗体,通过间接酶联免疫学方法测定其效价,检测其免疫原性。结果:成功构建了Ⅱ型登革病毒NS1蛋白的表达载体。Western blot显示表达的重组蛋白能够被NS1单抗特异性的结合,纯化复性后的重组蛋白在小鼠体内表现出良好的免疫原性。结论:重组表达的NS1蛋白有良好的免疫原性,为以后的NS1单克隆抗体的制备和登革病毒检测试剂盒的研制提供了良好的基础。     

真核细胞表达单纯疱疹病毒Ⅰ型包膜糖蛋白B及其抗原性与免疫原性分析

为在真核细胞中表达并纯化I型单纯疱疹病毒(HSV I)包膜糖蛋白gB,并分析其抗原性和免疫原性,化学合成了包膜糖蛋白gB1胞外区基因片段,构建真核表达载体,并转染至HEK293细胞,表达的蛋白用羊抗HSV1+HSV2血清作为一抗,用ELISA检测其抗原性;用纯化的gB1蛋白免疫昆明小鼠,观察诱发抗体产生的时间及其效价,并用ELISA和Western blot检测小鼠抗gB1多克隆抗体特异性识别重组gB1抗原的能力,评价其免疫原性。结果显示在HEK293细胞中成功表达重组gB1蛋白,ELISA证实羊抗HSV1+HSV2多抗能够识别重组gB1蛋白;重组gB1蛋白免疫小鼠7周后,小鼠血清中多克隆抗体效价达到5×103,表明在真核细胞中高效表达并纯化的重组gB1蛋白具有良好的抗原性和免疫原性,为HSV检测试剂和疫苗研究提供了理论基础。     

Investigation of the mechanism of temperature sensitivity of the electroreceptors of ampullae of lorenzini

In experiments on Black Sea skates (Raja clavata), the potential of the receptor epithelium of the ampullae of Lorenzini and spike activity of single nerve fibers connected to them were investigated during electrical and temperature stimulation. Usually the potential within the canal was between 0 and –2 mV, and the input resistance of the ampulla 250–400 k. Heating of the region of the receptor epithelium was accompanied by a negative wave of potential, an increase in input resistance, and inhibition of spike activity. With worsening of the animal's condition the transepithelial potential became positive (up to +10 mV) but the input resistance of the ampulla during stimulation with a positive current was nonlinear in some cases: a regenerative spike of positive polarity appeared in the channel. During heating, the spike response was sometimes reversed in sign. It is suggested that fluctuations of the transepithelial potential and spike responses to temperature stimulation reflect changes in the potential difference on the basal membrane of the receptor cells, which is described by a relationship of the Nernst's or Goldman's equation type.I. P. Pavlov Institute of Physiology, Academy of Sciences of the USSR, Leningrad. I. M. Sechenov, Institute of Evolutionary Physiology and Biochemistry, Academy of Sciences of the USSR, Leningrad. Pacific Institute of Oceanology, Far Eastern Scientific Center, Academy of Sciences of the USSR, Vladivostok. Translated from Neirofiziologiya, Vol. 12, No. 1, pp. 67–74, January–February, 1980.     

Principles of organization and evolution of systems of regulation of functions

Evolution of living organisms is closely connected with evolution of structure of the system of regulations and its mechanisms. The functional ground of regulations is chemical signalization. As early as in unicellular organisms there is a set of signal mechanisms providing their life activity and orientation in space and time. Subsequent evolution of ways of chemical signalization followed the way of development of delivery pathways of chemical signal and development of mechanisms of its regulation. The mechanism of chemical regulation of the signal interaction is discussed by the example of the specialized system of transduction of signal from neuron to neuron, of effect of hormone on the epithelial cell and modulation of this effect. These mechanisms are considered as the most important ways of the fine and precise adaptation of chemical signalization underlying functioning of physiological systems and organs of the living organism