灵芝原生质体的分离及其转化

对灵芝（赤芝）进行了原生质体的形成和再生实验,研究了渗透压稳定剂、菌龄、酶解条件对原生质体分离的影响,以及渗透压稳定剂、培养基对原生质体现生的影响,另外还尝试用电穿孔在灵芝原生质体中进行报告基因（report gene）β-gal的转化,结果β-gal在菌丝体中有表达。     

灵芝原生质体分离与再生研究

首次详细,系统地探讨了灵芝原生质体分离与再生的条件,结果表明,用０．６ｍｏｌ／Ｌ甘露醇配制成含２％溶壁酶和０．５％崩溃酶的复合醇,在３０℃,ｐＨ为６．０时酶解３小时,可得到最高的原生质体得率,但考虑到原生质体的再生,以酶解２．５小时为最适。     

灵芝原生质体分离与再生研究

首次详细、系统地探讨了灵芝原生质体分离与再生的条件,结果表明：用0．6mol／L甘露醇配制成含2％溶壁酶和0．5％崩溃酶的复合酶,在30℃,pH为6.0时酶解3小时,可得到最高的原生质体得率。但考虑到原生质体的再生,以酶解2．5小时为最适。酶解2．5小时所得原生质体经精制,用纤维二糖培养基（以0.6mol／L甘露醇为渗透压稳定剂）进行双层平板（上层平板含0．2％琼脂）培养法再生,原生质体的再生率最高。本研究为以后进行灵芝原生质体的融合以及灵芝的转基因研究打下了基础。     

灵芝原生质体分离与再生研究*

首次详细、系统地探讨了灵芝原生质体分离与再生的条件,结果表明：用0．6mol／L甘露醇配制成含2％溶壁酶和0．5％崩溃酶的复合酶,在30℃,pH为6.0时酶解3小时,可得到最高的原生质体得率。但考虑到原生质体的再生,以酶解2．5小时为最适。酶解2．5小时所得原生质体经精制,用纤维二糖培养基（以0.6mol／L甘露醇为渗透压稳定剂）进行双层平板（上层平板含0．2％琼脂）培养法再生,原生质体的再生率最高。本研究为以后进行灵芝原生质体的融合以及灵芝的转基因研究打下了基础。     

灵芝原生质体制备、再生及融合的研究

报道不同菌龄、酶液浓度、稳渗剂对灵芝原生质体产率及不同种类、不同浓度的稳渗剂对原生质体再生的影响。结果表明,诱变后具抗药性标记的“中国红灵芝”菌种（mH1）原生质体制备时菌丝最适菌龄为48小时,酶液浓度为3％,稳渗剂以0．6mol／L蔗糖为佳;诱变后具抗药性标记的“韩国红灵芝”（mK1）原生质体制备时菌丝最适菌龄为40小时,酶液浓度为1％,稳渗剂为0.4mol／L甘露醇时原生质体产率最高。mH1,mK1原生质体均以蔗糖作稳渗剂再生率较高,其最佳浓度为0．6mol／L。在该条件下mH1原生质体再生率为3．20×10-2,mK1为5．40×10-2。在此基础上,以30％的PEG作为融合诱导剂进行灵芝原生质体融合,并获得了融合子,融合率为140×10-2。     

影响枯草杆菌原生质体转化的因素

原生质体转化是将外源基因导入细菌的主要方法之一,其转化频率受制于多种因素。本研究以激BacillussubtilisDB104为宿主菌,以枯草杆菌的高表达型质粒pNQ122为外源DNA,研究了原生质体再生率、原生质体浓度和用于制备原生质体的细胞生长期对转化频率的影响,获得了在该系统中实现高频率转化的条件。该转化条件使外源基因在多个B.subtilis菌株中的转化成为可能,并使从B.subtilis中筛选中性蛋白酶基因获得成功。     

灵芝原生质制备,再生及融合的研究

报道不同菌龄、酶液浓度、稳渗剂对灵芝原生质体产率及不同种类、不同浓度的稳渗剂对原生质体再生的影响。结果表明,诱变后具抗药性标记的“中国红灵芝”（菌种ｍＨ１）原生质体制备时菌丝最知菌龄为４８小时,酶液浓度为３％,稳渗剂以０．６ｍｏｌ／Ｌ蔗糖为佳;诱变后具抗药性标记的“韩国红灵芝”（ｍＫ１）原生质体制备时菌丝早适菌龄为４０小时,酶液浓度为１％,稳渗剂为０．４ｍｏｌ／Ｌ甘露醇时原生质体产率最高。ｍＨｌ,     

地衣芽孢杆菌原生质体的制备、再生及转化研究

目的：提高地衣芽孢杆菌原生质体的产量和形成率,为进一步提高原生质体转化率打下基础。方法：通过酶解法对地衣芽孢杆菌工业生产菌株Bacillus licheniformis303原生质体的制备及再生条件进行了研究。考察了菌体生长状态、溶菌酶浓度、处理时间、渗透压稳定剂和再生培养基等因素对地衣芽孢杆菌原生质体的制备及再生的影响。结果：对数生长后期的菌体,以SMMP作渗透压稳定剂,溶菌酶浓度为100mg/mL,37℃下酶解30min,原生质体生成量可达8×109个/mL;再生培养基选用含1mol/L琥珀酸钠的DM3时,再生率最高可达17%。在此条件下,采用PEG法将游离型质粒pHY-P43-secQ转化宿主菌B.lichenifor-mis303,转化率可达10~15 CFU/μg DNA。     

原生质体紫外诱变选育灵芝新菌种的研究

对灵芝原生质体进行了紫外诱变处理 ,经过粗筛和精筛后 ,从中选出多糖含量和产量明显高于原始菌株的两株诱变株 430 2 0 #和 430 2 6#。经过 1 0代PDA斜面继代培养及其摇瓶试验和连续 3次 3t罐的中试试验 ,表明所得诱变株为比原始菌株更优秀的稳定高产、高多糖含量的灵芝生产菌株。本研究为选育适合发酵的灵芝生产菌种提供了一种快速、有效的方法     

葡萄原生质体分离及瞬时转化体系的建立

为了建立葡萄原生质体进行遗传转化的技术,该研究以葡萄品种‘黑香蕉’的叶片和愈伤组织为材料,分析纤维素酶和离析酶的浓度与配比、渗透压和酶解时间等主要因素对葡萄原生质体分离的影响,探讨建立稳定、高效的葡萄原生质体分离与瞬时转化体系,为鉴定目标基因的功能奠定基础。结果表明:(1)葡萄叶片原生质体的分离以3.0%纤维素酶和0.75%离析酶的酶组合,在0.6mol/L甘露醇溶液中,酶解14h为宜,每克游离产量为4.09×106个原生质体,活力为83.12%。(2)葡萄愈伤组织原生质体的分离以2.0%纤维素酶和0.5%离析酶的酶组合,在0.5mol/L甘露醇溶液中,酶解14h为宜,每克游离产量为6.05×106个原生质体,活力为84.13%。(3)利用该方法得到的葡萄原生质体为受体,采用40%PEG-4000介导转化质粒载体pEZS-NL,目标基因瞬时表达产物检测表明,GFP蛋白表达稳定、清晰。该研究建立的葡萄原生质体制备和转化体系,可以用较少量的质粒DNA获得外源基因在原生质体内的表达,为葡萄功能基因的研究提供技术支持。     

红曲霉原生质体的制备、再生及其遗传转化系统

原生质体是研究和建立真菌遗传转化系统的重要工具。为了建立原生质体介导的红曲霉遗传转化系统,考察了各种细胞壁裂解酶和渗透压稳定剂等对红曲霉原生质体形成和再生的影响。将红曲霉分生孢子在铺有玻璃纸的平板上30℃培养30~40 h收获的菌丝体最有利于原生质体的形成和释放。红曲霉菌丝体形成和释放原生质体最适裂解酶和酶解时间分别为：0.3 % lysing enzyme、0.1 % cellulase和1 % snailase的酶组合,30℃作用2.5 h;最适渗透压稳定剂是：1mol /L MgSO4。最适合原生质体再生的培养基为含0.6 mol/L蔗糖的CM培养基。原生质体液涂布单层再生培养基的方法,再生率最高,菌株M34和N18分别为8.5 %和36.4 %。在PEG和CaCl2存在下,以潮霉素B为抗生素选择标记,用质粒pBC-Hygro和pNL1共转化菌株M34原生质体,每微克DNA克获得100个稳定转化子。     

New Triterpenoids from the Fruiting Bodies of Ganoderma lucidum and Their Bioactivities

Phytochemical investigation of the AcOEt extract of G. Lucidum has led to the isolation of two new triterpenoids, 1 and 2 , together with five known ones, 3 – 7 . The structures of the new compounds were identified as 12β‐acetoxy‐3β,7β‐dihydroxy‐11,15,23‐trioxolanost‐8‐en‐26‐oic acid butyl ester ( 1 ) and 12β‐acetoxy‐3,7,11,15,23‐pentaoxolanost‐8‐en‐26‐oic acid butyl ester ( 2 ) on the basis of detailed spectroscopic analysis (mass spectrometry, and 1D‐ and 2D‐NMR experiments). The antimicrobial activities of 1 and 2 were also evaluated.     

链霉菌11371原生质体的制备与再生

为选育链霉菌11371的高产Tetramycin菌株,摸索该菌株的原生质体的制备与再生。结果表明,链霉菌11371原生质体制备和再生的最佳条件为菌丝生长培养液中甘氨酸浓度为0．7％,培养温度为28℃,培养时间为42h,溶菌酶浓度为3mg／mL,酶解温度为37℃,酶解时间为90min。最佳再生培养基为R2YE培养基。     

Preparation and Regeneration of Chalara paradoxa Protoplasts

A lignan mixture from sesame salad oil containing episesamin and sesamin as major components was fed to rats. Lignans at the dietary level of approximately 0.2% tended to decrease plasma and liver cholesterol levels with an accompanying increase in the fecal excretion of neutral steroids, particularly when the dietary fat source was evening primrose oil containing γ-linolenic acid. There was a decreasing trend in the specific activity of Δ5-desaturase in liver microsomes whereas that of Δ6-desaturase tended to increase, in particular in rats fed with safflower oil. The proportion of dihomo-γ-linolenate increased in response to the reduction of Δ5-desaturation activity, and that of docosapentaenoate (n-6) decreased in liver phosphatidylcholine in both groups of rats, suggesting that lignans interfered with various steps of linoleate metabolism. However, the production by the aorta of prostacyclin and by platelets of thromboxane A₂ was not influenced by lignans. Thus, episesamin and/or sesamin functioned as a regulator of cholesterol and linoleate metabolism in rats.     

石防风原生质体遗传转化及抗除草剂植株的再生

以石防风（Ｐｅｕｃｅｄａｎｕｍｔｅｒｅｂｉｎｔｈａｃｅｕｍ（Ｆｉｓｃｈ．）Ｆｉｓｃｈ．ｅｘＴｕｒｃｚ．）叶柄愈伤组织为材料建立以致密细胞团为主的悬浮培养物,用酶解法获得原生质体。用ＰＥＧ法将拟南芥菜（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａ（Ｌ．）Ｈｅｙｎｈ．）抗除草剂基因导入原生质体后进行液体浅层培养。转化细胞经除草剂ｃｈｌｏｒｓｕｌｆｕｒｏｎ筛选,通过胚状体途径产生抗性小植株。转化处理１０６个原生质体,以加入４０～５０μｇ／ｍＬ质粒ＤＮＡ,ＰＥＧ终浓度为１０％,于１ｍＬ转化介质中,２６℃黑暗下处理２０ｍｉｎ的效果最好。ｃｔＤＮＡ的加入对转化结果无明显影响。分子杂交试验表明,突变的ａｌｓ基因已整合进转化植株的基因组中。转基因植株的细胞在脱分化过程中仍具有抗ｃｈｌｏｒｓｕｌｆｕｒｏｎ的能力;移栽成活的转基因小苗仍表现出抗除草剂特性,而未转化的植株在低浓度除草剂下即逐渐死亡。表明转入的ａｌｓ基因在石防风细胞内能够稳定表达。