抗艰难梭菌毒素纳米抗体在乳酸乳球菌中重组表达及其功能分析

本研究旨在构建表达抗艰难梭菌毒素的纳米抗体重组乳酸乳球菌。所述的抗体为免疫羊驼后从外周血中分离的天然缺失轻链的纳米抗体(分别命名为E3、AA6)。构建重组质粒pNZ8148-E3-AA6,转化乳酸乳球菌NZ9000后诱导表达,SDSPAGE及Western blot检测到32 kD的目的蛋白。利用镍柱亲和层析法纯化重组蛋白E3-AA6,BCA试剂盒测定其浓度。通过细胞变圆实验以及CCK8实验鉴定其功能,E3-AA6能够抑制艰难梭菌毒素TcdB的毒性。本实验成功构建了重组表达载体pNZ8148-E3-AA6,通过NICE系统实现了二价抗体的表达,为治疗艰难梭菌引发的感染提供了新的治疗途径。     

产气荚膜梭菌α毒素在干酪乳杆菌中的诱导表达及其小鼠口服免疫力

[目的]构建产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens,C.perfringents)α毒素基因的重组干酪乳杆菌口服疫苗,为产气荚膜梭菌毒素中毒的防治提供有效方法.[方法]将构建的重组产气荚膜梭菌α毒素基因细胞表面型载体pPG1及分泌表达载体pPG2电转化乳酸乳杆菌(Lactobacillus casei L.casei),获得阳性重组菌pPG1-α/L.case/393乳酸乳杆菌表面表达系统和pPG2-α/L.casei 393乳酸乳杆菌分泌表达系统.重组菌以1%乳糖为诱导物,在MRS培养基中进行诱导,通过Western-blot和间接免疫荧光方法鉴定,确定目的蛋白的表达.将重组菌口服免疫BALB/c小鼠,收集免疫小鼠粪便及眼冲洗液及外生殖道黏液样本测定小鼠产生抗α毒素的特异性slgA抗体水平,采集小鼠血液样本测定血清中抗α毒素的特异性lgG抗体水平.并对免疫小鼠进行α毒素的腹腔攻毒试验及对获得的抗血清进行α毒素中和试验测定.[结果]重组干酪乳杆菌pPG1-α/L.casei 393及pPG2-/L.casei 393免疫小鼠能够产生明显的抗α毒素的slgA和IgG抗体水平,其对α毒素中和试验结果为完全保护.腹腔攻毒实验结果为能抵抗3倍最小致死剂量(minimum lethal dose,MLD100)的α毒素攻击.[结论]表达产气荚膜梭菌α毒素免疫保护性抗原的重组乳酸乳杆菌口服免疫动物能够产生良好的局部和系统体液免疫应答和免疫中和效力.     

艰难梭菌毒素A的可溶性表达及抗原性分析

目的 实现艰难梭菌(Clostridioides difficile,C.difficile)毒素A(toxin A, TcdA)的可溶性表达并鉴定其抗原特异性。方法 使用生物信息学软件对TcdA受体结合域进行B细胞表位分析,选择优势抗原表位区段进行基因合成。将合成的基因连接到表达载体pET-28a和pET-32a中,构建重组质粒pET-28a/TcdA和pET-32a/TcdA,转化到BL21(DE3)感受态细胞中进行表达,并对诱导温度进行优化。采用镍柱纯化融合蛋白,然后用肠激酶酶切获得目的蛋白。最后使用艰难梭菌检测试剂盒检测蛋白的抗原性。结果 选择TcdA受体结合区域优势抗原表位区段2 231～2 708 aa进行表达。成功表达pET-28a/TcdA和pET-32a/Trx-TcdA重组蛋白。其中pET-28a/TcdA为包涵体形式。pET-32a/Trx-TcdA实现了部分可溶性表达,并且优化诱导温度(18℃)后,可溶性表达量进一步提高。表达的pET-32a/Trx-TcdA融合蛋白纯度较好,产量约为4.5 mg/L,经酶切后获得几乎没有冗余氨基酸的TcdA。经检测,TcdA蛋...     

腐败梭菌α毒素基因的克隆表达及其类毒素的免疫原性研究

根据GenBank公布的腐败梭菌α毒素基因序列,设计了一对引物,并以腐败梭菌基因组为模板,经PCR特异性扩增出腐败梭菌菌株HeB01的α毒素基因。序列分析表明,该基因产物大小为1323bp,与GenBank报道的4个腐败梭菌参考菌株α毒素基因序列同源性高于99·5%。将扩增的α毒素基因定向克隆到原核表达载体pQE30中,得到重组质粒pQE30-α,将重组质粒转化大肠杆菌M15中,得到重组菌株M15(pQE30-α),经IPTG诱导后,SDS-PAGE分析可见表达的48kD特异条带;Westernblot和ELISA检测实验表明:表达的α毒素与抗天然α毒素抗体发生特异性反应,说明α毒素蛋白具有较好的免疫原性。将表达的α毒素蛋白制成类毒素疫苗,免疫小鼠后,具有一定的保护能力,表明该重组菌株有望作为腐败梭菌基因工程类毒素疫苗的候选生产菌株。     

产气荚膜梭菌α毒素在干酪乳杆菌中的诱导表达及小鼠口服免疫保护效力的测定

摘要: 【目的】构建产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens, C．perfringens）α 毒素基因的重组干酪乳杆菌口服疫苗,为产气荚膜梭菌毒素中毒的防治提供有效方法。【方法】将构建的重组产气荚膜梭菌α毒素基因细胞表面型载体pPG1及分泌表达载体pPG2电转化乳酸乳杆菌（Lactobacillus casei L.casei）,获得阳性重组菌pPG1-α/ L.casei 393 乳酸乳杆菌表面表达系统和pPG2-α/ L.casei393乳酸乳杆菌分泌表达系统。重组菌以1%乳糖为诱导物,在MRS培养基中进行诱导,通过Western-blot和间接免疫荧光方法鉴定,确定目的蛋白的表达。将重组菌口服免疫BALB/c小鼠,收集免疫小鼠粪便及眼冲洗液及外生殖道黏液样本测定小鼠产生抗α毒素的特异性sIgA 抗体水平,采集小鼠血液样本测定血清中抗α毒素的特异性IgG抗体水平。并对免疫小鼠进行α毒素的腹腔攻毒实验及对获得的抗血清进行α毒素中和试验测定。【结果】重组干酪乳杆菌pPG1-α/ L.casei 393及pPG2-/ L.casei 393免疫小鼠能够产生明显的抗α毒素的sIgA 和IgG 抗体水平,其对α毒素中和试验结果为完全保护。腹腔攻毒实验结果为能抵抗3倍最小致死剂量的α毒素攻击。【结论】表达产气荚膜梭菌α毒素免疫保护性抗原的重组乳酸乳杆菌口服免疫动物能够产生良好的局部和系统体液免疫应答和免疫中和效力。     

B型肉毒毒素重组Hc亚单位疫苗的免疫原性研究

目的:用大肠杆菌表达重组B型肉毒毒素受体结合区Hc抗原(BHc)作为亚单位疫苗,并研究其免疫原性。方法:构建pTIG-Trx-BHc原核表达载体,用大肠杆菌表达并纯化重组BHc抗原;免疫BALB/c小鼠以研究它的免疫原性。结果:大肠杆菌表达并纯化获得了重组BHc抗原,免疫小鼠后能刺激机体产生高效价的抗BHc抗体和保护性免疫反应。该重组BHc亚单位疫苗1μg剂量2次免疫小鼠即可产生对104LD50剂量B型肉毒毒素攻毒的完全保护,血清中和效价可达1.33 IU/m L。结论:大肠杆菌表达的重组BHc抗原具有良好的免疫原性,能够有效地保护小鼠抵抗B型肉毒毒素的攻击,该BHc抗原能够作为亚单位候选疫苗预防B型肉毒毒素中毒。     

艰难梭菌毒素A 对胆管癌细胞株FRH-0201 增殖和凋亡的影响

目的:研究艰难梭菌毒素A(TcdA)对人胆管癌细胞株FRH-0201细胞凋亡影响及作用机制。方法:采用MTT法检测细胞增殖抑制率,荧光染色检测TcdA作用后细胞形态学变化,流式细胞术检测细胞凋亡,免疫细胞化学法检测Bcl-2表达水平,Caspase3活性检测试剂盒检测Caspase-3的活性。结果:TcdA能抑制胆管癌细胞株FRH-0201细胞增殖且呈时间、剂量依赖性,荧光染色和流式细胞仪检测到细胞凋亡,与对照组相比,TcdA作用后Bcl-2蛋白表达下降,差异有统计学意义(P<0.05),Caspase-3活性增强,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:TcdA可以通过下调Bcl-2蛋白表达表达,激活Caspase-3而诱导FRH-0201细胞凋亡。     

表达乙型脑炎病毒E蛋白重组减毒沙门菌活载体疫苗株的构建

目的:构建表达乙型脑炎病毒(JEV)E蛋白的口服重组减毒鼠伤寒沙门菌活载体疫苗株。方法:克隆JEV E基因,将其插入表达载体pYA3341中,构建重组质粒pYA3341-E,将重组质粒电转入鼠伤寒沙门菌疫苗株X4550(缺失asd、cya、crp基因),获得重组疫苗菌株X4550(pYA3341-E);鉴定重组菌E蛋白的表达,测定重组菌的稳定性、生长曲线、安全性,以及小鼠的免疫试验和血清中和试验。结果:酶切鉴定和序列测定证实重组质粒构建成功;SDS-PAGE检测有目的蛋白条带;Western印迹证实表达的E蛋白能与猪抗JEV阳性血清特异性结合;重组菌株在体外营养选择压力下,可稳定地携带重组质粒传代繁殖,在体内可较稳定地定居于肠系膜淋巴结和脾脏;小鼠口服试验证实重组菌无毒性作用,安全可靠;小鼠口服重组菌免疫,ELISA检测产生了抗JEV抗体;中和试验表明产生的抗体具有中和活性。结论:构建了能稳定表达JEV E蛋白的口服减毒鼠伤寒沙门菌疫苗株X4550(pYA3341-E),为研究乙型脑炎口服基因工程疫苗奠定基础。     

携带HCV核心蛋白原核表达质粒与真核表达质粒的减毒伤寒沙门菌诱导小鼠免疫应答之比较

丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白是丙肝疫苗的重要候选抗原,然而,该蛋白因具有免疫调控作用而影响免疫应答的诱导。构建了HCV核心蛋白的两种表达质粒,一种是体内激活型原核表达质粒pZW-C,另一种是真核表达质粒pCI-C。将该两种质粒转化减毒鼠伤寒沙门菌SL7207,得到重组菌SL7207/pZW-C和SL7207/pCI-C,分别将重组菌口服接种小鼠,检测小鼠的免疫应答,结果发现:①SL7207/pCI-C免疫鼠的CD3 CD4 T细胞持续降低,而SL7207/pZW-C免疫鼠的CD3 CD4 T细胞无明显改变;②SL7207/pCI-C免疫只诱导低水平抗HCV核心蛋白抗体,加强免疫对抗体阳转率及抗体水平无明显影响,而SL7207/pZW-C免疫组所有小鼠均产生较高水平的抗核心蛋白抗体。③SL7207/pCI-C免疫鼠脾细胞的体外增殖活性、细胞毒性T细胞活性以及加强免疫对细胞免疫应答的增强作用均明显不及SL7207/pZW-C免疫鼠。结果提示:携带真核表达质粒pCI-C的沙门菌因在小鼠细胞内表达天然形式(结构以及磷酸化修饰)的HCV核心蛋白,可能通过对T细胞的免疫抑制作用而弱化免疫应答。而以携带原核表达质粒pZW-C的沙门菌免疫可避免这一问题,并具有接种方便,成本低廉等优点,从而可望作为基于HCV核心蛋白为靶抗原的HCV疫苗的候选免疫方式。     

O型口蹄疫病毒VP1基因与大肠杆菌不耐热肠毒素LTB 基因的融合表达及表达产物的免疫原性分析

以质粒pMDTLT为模板、用PCR的方法扩增出LTB基因,然后将其插入到pETVP1质粒中VP1基因的上游,构建了含有融合基因LTBVP1的表达质粒pETLTBVP1。转化宿主菌BL21(DE3)LysS后进行诱导表达,诱导菌经SDS-PAGE显示重组蛋白以包涵体的形式表达,分子量约为39kD;Western blotting分析表明,重组蛋白能与FMDV阳性血清及兔抗霍乱毒素(CT)血清反应,说明融合蛋白保持了LTB和VP1各自的免疫学活性。小鼠免疫实验表明:该融合蛋白通过腹腔接种小鼠能诱导产生较强的免疫应答反应,免疫鼠产生的血清抗体水平高于试验中商品口蹄疫疫苗免疫组。     

O型口蹄疫病毒VPl基因与大肠杆菌不耐热肠毒素LTB基因的融合表达及表达产物的免疫原性分析

以质粒pMDTLT为模板,用PCR的方法扩增出LTB基因,然后将其插入到pETVP1质粒中VP1基因的上游,构建了含有融合基因LTBVP1的表达质粒pETLTBVP1.转化宿主菌BL21(DE3)LysS后进行诱导表达,诱导菌经SDS-PAGE显示重组蛋白以包涵体的形式表达,分子量约为39 kD;Western blotting分析表明,重组蛋白能与FMDV阳性血清及兔抗霍乱毒素(CT)血清反应,说明融合蛋白保持了LTB和VP1各自的免疫学活性.小鼠免疫实验表明:该融合蛋白通过腹腔接种小鼠能诱导产生较强的免疫应答反应,免疫鼠产生的血清抗体水平高于试验中商品口蹄疫疫苗免疫组.     

艰难梭菌毒素A原核表达及重组蛋白纯化

目的构建艰难梭菌(Clostridium difficile,C.difficile)毒素A羧基末端原核表达载体,优化诱导表达条件及纯化重组蛋白。方法利用聚合酶链式反应扩增C.difficile毒素A羧基末端基因序列,并将此序列转入pET-28b载体,构建pET-28b-tcdA重组表达载体,并将表达载体转化到BL21(DE3)感受态大肠埃希菌细胞中,分别在不同条件下进行诱导表达,获得最佳诱导表达条件后进行大量表达,最后用Ni柱对重组蛋白进行亲和纯化,得到纯化后的重组蛋白。结果成功构建了pET-28b-tcdA重组表达载体,其重组蛋白表达最佳诱导条件:菌液吸光度值取0.6、温度取25℃、IPTG终浓度取1.0mmol/L、诱导时间取10h。蛋白纯化咪唑磷酸盐洗脱液最佳浓度取200mmol/L。结论成功构建pET-28b-tcdA重组表达载体,在大肠埃希菌BL21(DE3)中可以有效表达,并获得高浓度重组蛋白,为进一步制备TcdA适配子奠定了一定实验室基础。     

大肠杆菌热稳定肠毒素与霍乱毒素B亚单位融合蛋白免疫原性的评价

构建了霍乱毒素B亚单位(CTB)和大肠杆菌热稳定肠毒素(ST）的重组表达载体pMCST1、pMCST2。二的不同是,前为单拷贝ST,后为双拷贝ST。在大肠杆菌DH50α中融合蛋白高效表达。用这两种重组蛋白分别免疫小鼠,都诱导产生了高滴度的抗CTB和抗ST的血清。表明这两组融合蛋白具有良好的CTB和ST的免疫原性,为进一步构建抗CTB和抗ST的产毒性细菌腹泻疫苗打下了基础。     

真核细胞表达单纯疱疹病毒Ⅰ型包膜糖蛋白B及其抗原性与免疫原性分析

为在真核细胞中表达并纯化I型单纯疱疹病毒(HSV I)包膜糖蛋白gB,并分析其抗原性和免疫原性,化学合成了包膜糖蛋白gB1胞外区基因片段,构建真核表达载体,并转染至HEK293细胞,表达的蛋白用羊抗HSV1+HSV2血清作为一抗,用ELISA检测其抗原性;用纯化的gB1蛋白免疫昆明小鼠,观察诱发抗体产生的时间及其效价,并用ELISA和Western blot检测小鼠抗gB1多克隆抗体特异性识别重组gB1抗原的能力,评价其免疫原性。结果显示在HEK293细胞中成功表达重组gB1蛋白,ELISA证实羊抗HSV1+HSV2多抗能够识别重组gB1蛋白;重组gB1蛋白免疫小鼠7周后,小鼠血清中多克隆抗体效价达到5×103,表明在真核细胞中高效表达并纯化的重组gB1蛋白具有良好的抗原性和免疫原性,为HSV检测试剂和疫苗研究提供了理论基础。     

C型产气荚膜梭菌β1、β2毒素基因的融合

利用PCR技术 ,从C型产气荚膜梭菌染色体DNA中扩增出 β1 和 β2 毒素基因 ,构建了含 β1 - β2 融合基因表达质粒的重组菌株BL2 1(DE3) (pETXB1_2 )。经酶切鉴定和序列测定证实 ,构建的重组质粒pETXB1_2含有 β1 - β2 融合基因 ,且基因序列和阅读框架正确。经ELISA检测 ,重组菌株表达的 β1 - β2 融合蛋白能够被 β1 、β2 毒素抗体识别。免疫实验结果表明 ,用β1 - β2 融合蛋白免疫的小鼠可以抵抗 1MLD的C型产气荚膜梭菌C5 9_4 4毒素攻击 ,表明构建的重组菌株可以作为预防仔猪红痢基因工程亚单位苗的候选菌株。     

IL-12增强流感血凝素DNA疫苗在小鼠中抗流感作用

流感病毒的表面抗原血凝素 (hemagglutinin ,HA)能作为DNA疫苗抗流感病毒攻击 ,在小鼠模型中检测白介素 12 (interleukin 12 ,IL 12 )能否作为HADNA疫苗佐剂增强小鼠抗流感病毒攻击。将IL 12和HA共同免疫小鼠 ,免疫 2次 ,间隔 3周 ,加强免疫后用致死量流感病毒攻击。共同免疫IL 12和HADNA与单独免疫HA相比 ,无论初免还是加强免疫后血清中抗HA的IgG抗体显著提高 ,小鼠体重丢失 (一种临床症状 )明显减少且提高了小鼠的存活率。这些结果表明了IL 12能作为一种佐剂提高流感DNA疫苗的免疫效价。     

艰难梭菌毒素A对胆管癌细胞株FRH-0201增殖和凋亡的影响

目的：研究艰难梭菌毒素A（TcdA）对人胆管癌细胞株FRH-0201细胞凋亡影响及作用机制。方法：采用MTT法检测细胞增殖抑制率,荧光染色检测TcdA作用后细胞形态学变化,流式细胞术检测细胞凋亡,免疫细胞化学法检测Bcl-2表达水平,Caspase3活性检测试剂盒检测Caspase-3的活性。结果：TcdA能抑制胆管癌细胞株FRH-0201细胞增殖且呈时间、剂量依赖性,荧光染色和流式细胞仪检测到细胞凋亡,与对照组相比,TcdA作用后Bcl-2蛋白表达下降,差异有统计学意义（P〈0.05）,Caspase-3活性增强,差异有统计学意义（P〈0.05）。结论：TcdA可以通过下调Bcl-2蛋白表达表达,激活Caspase-3而诱导FRH-0201细胞凋亡。     

重组PA4复制子病毒颗粒疫苗免疫原性的分析

目的:构建携带炭疽毒素保护性抗原第四结构域(PA4)基因的重组Semliki森林病毒(SFV)复制子病毒颗粒,并对其免疫原性进行研究。方法:将编码炭疽PA4的SFV复制子DNA载体pSCAR-SPA4,与辅助SFV DNA载体pSHCAR共转染BHK21细胞,制备表达PA4的重组复制子病毒颗粒;用重组复制子病毒颗粒疫苗免疫小鼠,并采用ELISA法检测其血清抗体水平和细胞因子IFN-γ和IL-4。结果:免疫小鼠血清中检测到较高的抗体水平,免疫小鼠的脾淋巴细胞经特异性抗原刺激后产生了明显的T细胞增殖反应并分泌产生了IFN-γ和IL-4。结论:重组PA4复制子病毒颗粒疫苗免疫小鼠后能够产生特异性的抗体反应和细胞免疫反应。制备的重组PA4复制子病毒颗粒极有潜力作为人用炭疽候选疫苗,为进一步研究新型炭疽疫苗奠定了基础。     

编码流感病毒血凝素基因和CD40L的核酸疫苗抗小鼠流感研究

为了检测表达CD40L的质粒能台作为核酸疫苗佐剂提高A／PR8／34流感病毒血凝素(HA)DNA疫苗的免疫应答,构建了表达鼠CD40L的质粒,行将它与A型流感病毒的HADNA疫苗用电击的方法共同免疫BALB／C小鼠(各30μg),免疫两次,间隔三周,第二次免疫后1周,用致死量流感病毒A／PR8／34攻击。发现与单独免疫30μgHA相比,血清中抗HA的IgG抗体节明显提高,且以IgG2a抗体提高为主,小鼠体重减轻非常少且体重恢复加快。实验结果显示,CD40L能作为流感病毒核酸疫苗佐剂,提高小鼠抗流感病毒攻击的能力。