检测不同毒力结核分枝杆菌感染对巨噬细胞凋亡的影响及其Caspase-3和Bcl-2的表达

该文为探讨不同毒力的结核分枝杆菌感染对巨噬细胞凋亡的调控作用及其机制。实验用结核分枝杆菌国际标准强毒株H37Rv株和卡介苗BCG分别感染巨噬细胞RAW264.7株,同时设空白对照组,在感染后1,6,12,24 h,用流式细胞技术检测各组巨噬细胞的凋亡率,应用Western blot检测细胞Caspase-3和Bcl-2蛋白表达。结果发现,结核分枝杆菌感染组的凋亡率显著高于对照组,差异具有统计学意义(P<0.05);BCG感染组凋亡率高于H37Rv感染组,在感染后1,12,24 h凋亡率显著升高,差异具有统计学意义(P<0.05)。巨噬细胞感染结核分枝杆菌后其Caspase-3蛋白表达增高,结核分枝杆菌感染组的Caspase-3蛋白表达高于对照组:对照组相似文献   

结核分枝杆菌持续感染小鼠模型的建立及其免疫特征

为建立小鼠结核分枝杆菌持续感染模型并研究其免疫应答特征,选取雌性C57BL/6小鼠,经尾静脉感染结核分枝杆菌H37Rv株,并以异烟肼和利福平联合治疗。分别于感染后4、8、12周处死小鼠,用平板法计数肺和脾荷菌数,酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清中特异性抗体水平及亚类,流式细胞术检测CD4+脾淋巴细胞经结核分枝杆菌抗原——纯化蛋白衍生物(PPD)刺激后分泌细胞因子的细胞比例。结果显示,感染4周后小鼠肺和脾荷菌数lg CFU分别达3.67±0.25和3.54±0.24,至少持续8周;药物治疗可有效降低脏器荷菌数。感染12周后,感染组血清中抗结核分枝杆菌特异性抗体水平显著升高(P0.01),且以IgG1为主;治疗组总IgG抗体水平显著低于感染组(P0.01),且IgG2a相对较高(P0.05)。感染组CD4+脾淋巴细胞中γ干扰素(IFN-γ)和白细胞介素2(IL-2)分泌细胞比例显著增加(P0.01和P0.001),而IL-4分泌细胞比例显著降低(P0.01);治疗组IL-2和IL-4分泌细胞比例显著低于正常组(P0.05和P0.01)。本研究建立的小鼠结核分枝杆菌持续感染模型有望用于结核病治疗性疫苗和药物的研发及筛选。     

利用双向电泳技术研究异烟肼耐药MTB感染U937引致的差异表达蛋白

利用双向电泳技术对结核分枝杆菌（MTB）异烟肼（INH）耐药株和敏感株感染人源巨 噬细胞（U937）后的全细胞蛋白表达图谱进行差异比较和分析,发现其中产生差异的有86个蛋白质斑点.利用基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱技术对其中8个差异表达蛋白质斑点进行分析鉴定,获得8个明确的肽质量指纹图谱.通过在蛋白质数据库中进行检索分析,确定这8个蛋白质中的2个为在INH耐药株感染的U937中差异表达的干细胞生长因子和主要组织相容性复合物Ⅰ类抗原,6个为在敏感株感染的U937中差异表达的微管蛋白β4、信号转导和转录激活子3、延长因子-2激酶、环指蛋白29、锌指蛋白193和SNARE Vti1a-β蛋白.实验结果显示,INH耐药株和敏感株感染后的U937表达蛋白有差异,这有助于分析解释临床中观察到的受INH耐药株感染的病例出现毒力下降、致病性下降、传染性降低以及潜伏期延长的现象.结果为针对INH耐药株进行的新疫苗的设计提供了探索方向.     

丝裂原活化的细胞外信号调节激酶在金黄色葡萄球菌诱导的U937细胞凋亡中的作用

目的探讨细胞外信号调节激酶（ERK1／2）在金黄色葡萄球菌（简称金葡菌）诱导的人巨噬细胞系U937细胞凋亡中的作用。方法采用AnnexinVFITc／PI双染流式细胞仪检测U937细胞凋亡,用Westernblotting方法分析不同作用时间MEK和ERK1／2的磷酸化水平。预先用不同浓度的PD98059（ERK途径抑制剂）处理U937细胞1h,观察金葡菌感染30min后U937细胞的凋亡情况。结果U937细胞经过金葡菌处理后,发生凋亡,细胞凋亡率呈时间依赖性升高;随着感染时间的延长,MEK和ERK1／2的磷酸化水平逐渐增加,尤以ERK2比较明显。U937细胞的凋亡可被PD98059抑制。结论金葡菌以时间依赖的方式诱导U937细胞凋亡;金葡菌诱导U937细胞凋亡的效应与激活ERK1／2信号转导通路有关。     

肺泡Ⅱ型上皮细胞自噬体与结核分枝杆菌相互作用的研究

目的:检测LC3在肺泡Ⅱ型上皮细胞A549上的表达情况,及结核分枝杆菌刺激后对其表达的影响,探讨自噬在结核分枝杆菌感染上皮细胞中所起的作用。方法:体外培养肺泡Ⅱ型上皮细胞A549,在结核分枝杆菌感染A549细胞0h,24h分别提取RNA,采用RT-PCR的方法检测LC3mRNA的表达情况。采用凋亡坏死染色试剂盒在结核分枝杆菌感染24h后检测对照组,3-MA组,MTB组和3-MA+MTB组的细胞坏死情况。在结核分枝杆菌感染A549细胞4h,8h,16,24h采用Non-Radioactive Cytocity Assay的方法检测对照组,3-MA组,MTB组和3-MA+MTB组上清液LDH的OD值。结果:LC3在肺泡Ⅱ型上皮细胞显著表达,结核分枝杆菌感染后LC3表达降低。细胞凋亡和坏死染色结果显示空白组和3-MA组没有明显差异(P>0.05),MTB组和3-MA+MTB组有明显差异(P<0.05)。LDH检测显示MTB组和3-MA+MTB组上清液LDH的OD值数据两两之间有明显差异(P<0.05)并且有时间依赖性。结论:肺泡II型上皮细胞自噬体在抵抗结核分枝杆菌的感染过程中起一定的作用。     

流式细胞术检测胞内重组耻垢分枝杆菌的活力研究

目的建立一种快速检测胞内分枝杆菌活力的方法。方法将一定量培养至对数生长期的含pMV-eis的重组耻垢分枝杆菌感染U937巨噬细胞,以含空质粒的耻垢分枝杆菌为对照,吞噬作用2 h后洗去胞外细菌,再分别培养4、12、24和48 h后收集细胞并裂解之。获得的胞内细菌用FDA荧光染料染色后用流式细胞仪检测死亡率,并与平板菌落计数法进行比较。结果流式细胞仪检测出感染12 h后重组耻垢分枝杆菌胞内死亡率较对照组均有显著下降（P〈0.05）,流式细胞仪检测法与平板菌落计数法相比差异无统计学意义（P〉0.05）。结论流式细胞术与传统的平板计数法相比具有快速、敏感、方便的特点,可用于分枝杆菌活菌快速检测。     

结核分枝杆菌对宿主巨噬细胞死亡方式的调控

结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis,Mtb）感染后能抑制宿主巨噬细胞（M西）的免疫反应,并在其中生存、复制。研究表明Mtb减毒株感染主要诱导宿主Mφ凋亡,凋亡能抑制胞内Mtb的活力;而Mtb毒力株感染能抑制凋亡的完成,诱导Mφ坏死,最终导致Mtb扩散、感染临近细胞。通过对Mtb感染诱导宿主Mφ不同死亡方式的讨论,进一步认识Mtb的致病机制。     

异烟肼耐药结核分枝杆菌感染人源巨噬细胞的蛋白质组学研究

利用双向电泳技术,对人源巨噬细胞U937感染异烟肼耐药结核分枝杆菌前后的全细胞蛋白表达图谱进行差异比较和分析,发现其中产生差异的有32个蛋白质斑点,利用基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱技术,对其中5个表达明显上调的蛋白质斑点进行分析鉴定,获得5个明确的肽质量指纹图谱,通过在数据库中进行检索分析,确定这5个蛋白质分别为热休克蛋白105_β、凋亡抑制蛋白-1、磷酸甘油酸变位酶1、组织蛋白酶B、桥粒胶蛋白3.上述发现有助于了解耐药结核分枝杆菌入侵早期导致的巨噬细胞蛋白质组表达变化,为深入研究耐药结核分枝杆菌-宿主相互作用提供了探索方向.     

PI3K/AKT途径在大肠埃希菌诱导U937细胞凋亡中的作用

目的探讨PI3K/AKT信号转导通路在大肠埃希菌（Escherichia coli,E.coli）诱导的人巨噬细胞系U937细胞凋亡中的作用。方法利用Western blot分析检测E.coli感染不同时间后磷酸化及非磷酸化AKT的表达;预先用不同浓度的LY294002（PI3K途径抑制剂）处理U937细胞60min,观察E.coli感染30min后U937细胞的凋亡情况。结果随着感染时间的延长,磷酸化AKT的表达逐渐下降。加入PI3K的抑制剂LY294002后,U937细胞的凋亡率逐渐升高。结论PI3K/AKT信号转导通路参与了E. coli诱导的U937细胞凋亡过程。LY294002通过特异性地抑制PI3K/AKT活性增加E.coli诱导的U937细胞凋亡率。     

应用专一性寡核苷酸微阵列可靠地检测结核分枝杆菌利福平耐药性

DNA微阵列代表聚合酶链反应产物诊断测序的发展方向 .根据结核分枝杆菌rpoB基因利福平抗药性决定区域内点突变及其它重排的特征 .研制一种快速地鉴定结核分枝杆菌利福平耐药菌株的中等密度微阵列方法 .利福平抗药性通过使荧光标记扩增遗传物质与微阵列杂交测定 .检测5 3株利福平耐药结核分枝杆菌和 15株利福平敏感结核分枝杆菌 .微阵列方法的检测结果与药物敏感性试验和DNA测序结果完全一致 .临床标本PCR扩增后仅 1 5h可检出利福平耐药临床分离株 .表明寡核苷酸微阵列是高效的、专一性的方法 ,可作为检测利福平抗药性的快速方法以弥补传统培养方法的不足     

Investigation of the mechanism of temperature sensitivity of the electroreceptors of ampullae of lorenzini

In experiments on Black Sea skates (Raja clavata), the potential of the receptor epithelium of the ampullae of Lorenzini and spike activity of single nerve fibers connected to them were investigated during electrical and temperature stimulation. Usually the potential within the canal was between 0 and –2 mV, and the input resistance of the ampulla 250–400 k. Heating of the region of the receptor epithelium was accompanied by a negative wave of potential, an increase in input resistance, and inhibition of spike activity. With worsening of the animal's condition the transepithelial potential became positive (up to +10 mV) but the input resistance of the ampulla during stimulation with a positive current was nonlinear in some cases: a regenerative spike of positive polarity appeared in the channel. During heating, the spike response was sometimes reversed in sign. It is suggested that fluctuations of the transepithelial potential and spike responses to temperature stimulation reflect changes in the potential difference on the basal membrane of the receptor cells, which is described by a relationship of the Nernst's or Goldman's equation type.I. P. Pavlov Institute of Physiology, Academy of Sciences of the USSR, Leningrad. I. M. Sechenov, Institute of Evolutionary Physiology and Biochemistry, Academy of Sciences of the USSR, Leningrad. Pacific Institute of Oceanology, Far Eastern Scientific Center, Academy of Sciences of the USSR, Vladivostok. Translated from Neirofiziologiya, Vol. 12, No. 1, pp. 67–74, January–February, 1980.