巢湖蓝藻腐殖化过程中形态与成份变化研究

通过对巢湖蓝藻进行微生物腐殖化改造,模拟藻类早期成岩过程,对蓝藻样品进行光学显微镜和扫描电镜形态观察,并对蓝藻样品有机元素、族组分和同位素数据及热重/差热进行分析。研究表明:蓝藻经微生物改造后,由群体生存逐渐转变为以个体形式存在,体内生化成分逐渐被降解。蓝藻样品有机N、S元素经微生物降解后,含量不断减少,蓝藻氯仿沥青A含量最高可达11.98%。进入厌氧阶段后,饱和烃和芳烃组分大量生成,沥青质含量明显增加,非烃部分减少。芳烃碳同位素富集12C,其它族组分逐渐富集13C。蓝藻气态烃排放量最大量为4.0%,游离态烃排放量随处理过程的深入逐渐增大,最高可达47.7%,烃排放的总吸热量逐渐减少,最低为14.77mW·s/mg。微生物对蓝藻改造过程效果显著,可为藻类烃源岩研究提供现代对比实例。     

生物有机肥和复合微生物菌剂对黄瓜产量和品质的影响

采用正交试验研究了生物有机肥和复合微生物菌剂对黄瓜产量、品质、农药残留以及毒害元素吸收的影响。结果表明,生物有机肥能使黄瓜数量平均每株增产12.5%,维生素C含量提高99.21%,氨基酸含量提高41.10%,有效降解黄瓜中多菌灵的残留,抑制黄瓜对Pb和As的吸收;微生物菌剂能使黄瓜数量比对照增加29.29%,产量增加22.76%,维生素C含量提高7.68%,氨基酸含量增加73.56%,对百菌清有很好的降解作用。     

环境微生物介导的木质素代谢及其资源化利用研究进展

木质素是一种丰富的芳烃生物大分子聚合物,其分解代谢与地球元素循环和生物资源利用密切相关。但由于木质素结构的复杂性和无规则性导致其难以降解,使得木质素降解的研究成为全球碳循环和生物质资源利用研究的难点。近年来,来自不同环境的微生物陆续被发现具有木质素降解能力,并解析出参与木质素分解代谢的多种氧化还原酶。然而对木质素详细的代谢过程仍不十分清楚,因此,探究木质素降解酶系、作用机理和代谢网络是研究微生物代谢木质素机理的关键。本文综述环境中参与木质素降解的微生物,重点解析其木质素解聚酶系组成、分泌机制和木质素的代谢途径,并在此基础上阐明近年来木质素生物转化的最新研究进展,以期为今后环境微生物代谢木质素机理及其资源化利用的研究提供参考。     

氧气对生物早期降解影响的实验模拟——以小型鱼类肠道微生物降解为例北大核心CSCD

一般研究中,通常将类似澄江动物群或关岭动物群为代表的生物软体印痕化石保存归因为与缺氧环境等有关的特异条件。本文关注到通常与化石降解和埋藏有关的缺氧环境推测并没有表达机理和成立条件;生物体内自身携带大量的微生物可能对生物的降解作用需要得到重视。为证实水体中氧气含量与生物非矿化组织印痕保存间的关系,本文通过设计条件控制(太湖银鱼,30℃,无菌纯净水、无外界微生物)进行有氧和缺氧环境的对比实验。该条件下的模拟对比实验研究证实:1)总体来说生物降解过程在有氧和缺氧环境下具有相似的降解速度;2)两者的降解实验在前期有短暂的差异,而144小时(6天)后有氧和无氧环境具有基本一致的降解速度和程度,其中较多样本6天后在缺氧环境的降解速度略高于有氧环境,短时间(6天)的降解差异是否会造成矿化差异有待研究;3)生物体本身携带的以肠道微生物为主的好氧和兼性厌氧微生物,足以使生物以蛋白质为代表的器官结构产生相似的破坏性降解,在本研究中是主要的降解因素;4)实验中所检出的生物体肠道内普遍存在的兼性厌氧微生物,可能是导致有氧和缺氧环境具有相似降解过程的主要原因;5)生物降解过程早期由于蛋白质的降解,微环境趋向于弱碱性而非一般推测的酸性;6)在实验设定条件下的有氧环境和缺氧环境对化石的形成和保存的早期过程相似,其他理化条件下的降解过程和结论需要进一步实验证实。     

明代古沉船饱水木材的原核微生物多样性分析

微生物是引起饱水木材降解劣化的主要因素之一。本文利用Illumina MiSeq高通量测序技术,分析明代"南澳Ⅰ号"古沉船船体饱水木材样品的原核微生物群落多样性,探讨饱水木材的原核微生物降解机制。结果表明:饱水木材样品与沉积物中的原核微生物种群丰富,且在含量上存在一定差异。在门水平上存在7个共有的优势菌门,分别为变形菌门(Proteobacteria)、绿弯菌门(Chloroflexi)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、螺旋体门(Spirochaetes)、厚壁菌门(Firmicutes)、酸杆菌门(Acidobacteria)和奇古菌门(Thaumarchaeota)。海底现场取的木材样品的菌群种类相似,存在丰富的厌氧、可以降解木材的菌群,但是含量存在着明显的差异;海底沉积物的细菌多样性及含量与木材样品存在明显的差异。脱盐过程中的木材样品含有大量好氧的铁氧化细菌(Ferritrophicum,8%)和脱硫菌(Desulfurivibrio,5.27%),可能参与铁硫元素的转化。结果表明原核微生物多样性是饱水木材保护过程中需重点关注的问题。     

氮磷含量对微生物修复油污土壤的影响

以甘肃西峰市油田附近土壤中的土著微生物为菌源,富集培养、筛选分离得到5种菌属的降解石油菌。通过向油污土壤中添加尿素、磷酸氢二铵的现场试验,历时63 d。研究了氮、磷含量在由5种菌制得的混合菌剂对油污的降解中的影响。结果表明,人为增加土壤中氮、磷元素对混合微生物菌剂修复油污土壤具有显著促进效果。在含油量1.5%和3%的污染土壤中,氮、磷元素的变化表现为两个阶段,前28 d氮、磷含量迅速减少,后35 d氮、磷含量变化表现出波动性,且在浓度为3%的污染土壤中,微生物菌剂的修复效果更为明显,最大降油率达到52.5%。利用GC-MS测定分析混合菌剂对石油主要成分藿烷的降解程度和演化规律的研究表明,混合菌剂对油污土壤中霍烷类化合物的降解均在80%以上,降解率较高,其中最高的是芒柄花根烷,达到86.3%.     

根分泌物在污染土壤生物修复中的作用

对根分泌物在植物根际微生态环境中 ,通过土壤 植物 微生物系统协同作用高效修复重金属和有机污染土壤的环境过程与机理进行了综述。根分泌物在重金属污染土壤植物修复中的作用主要表现在活化污染区重金属元素 ,使固定态转化为植物可吸收态 ,大大提高了重金属的植物有效性 ,通过植物的超积累作用 ,降低土壤中重金属污染物的含量 ;此外 ,根分泌物也可以和重金属形成稳定的螯合体 ,降低他们在土壤中的移动性 ,起到固定和钝化作用。对于有机污染物 ,根分泌物一方面为根际的微生物提供了丰富的营养和能源 ,使植物根际的微生物数量和代谢活力比非根际区高 ,增强了微生物对环境中的有机污染物的降解能力 ;另一方面植物根分泌到根际的酶系统可直接参与有机污染物降解的生化过程 ,提高降解效率。并对此领域今后研究工作的方向做了探讨     

石油污染土壤中菲、蒽和正十六烷的微生物降解

在模拟自然条件下,考察了芳香烃(菲、蒽)和脂肪烃(正十六烷)单独存在以及共存于土壤中时,土著微生物对它们降解的影响。结果表明,土著微生物对它们的降解均符合一级反应动力学。菲、蒽或正十六烷单独存在于土壤中时,其微生物降解速率常数分别为0.0226、0.0283和0.0096 d^-1。菲和正十六烷共存时,正十六烷能够作为土著微生物降解菲的共代谢底物,促进菲的降解,使菲的半衰期比其单独存在于土壤中缩短44%;同时,正十六烷的加氧酶被菲诱导,使其活性提高而增强对正十六烷的降解作用,其微生物降解半衰期比其单独存在于土壤中缩短49%。菲和蒽共存促进了土著微生物对菲的降解,却抑制了对蒽的降解。     

深水湖泊沉积物不同形态氮的生物地球化学特征——以百花湖为例

深水湖泊经历氧化及还原环境的交替变化,影响着湖泊水体氮的生物地球化学过程;其底层沉积物中一般具有特有的还原环境,其间氮的生物地球化学转化过程复杂。本文以云贵高原典型深水湖泊百花湖为例,在湖泊水体夏季分层期采集底层沉积物柱体,将沉积物柱体分层处理后,对不同深度沉积物中孔隙水、水溶态和吸附态不同形态氮含量,以及沉积物中颗粒态有机氮(PON)含量和同位素进行分析。结果表明,沉积物柱体孔隙水中的总氮(TN)主要由NH4+-N和有机氮两种形式存在,TN含量为6.9~42.8 mg·L-1,NH4+-N含量为6.6~25.6 mg·L-1。硝态氮及亚硝态氮含量均低于检测限,说明沉积物中硝酸盐经历了充分的反硝化过程以及可能存在的异化还原过程。吸附态NH4+-N含量明显高于水溶态。沉积物中的颗粒有机氮含量为0.22%~0.60%。同时,颗粒有机氮含量在剖面上的变化趋势符合指数衰减模式,表明颗粒态有机氮含量的变化可能经历成岩作用和微生物矿化过程;δ15N-PON值在31 cm以上随着深度的加深逐渐减小,变化范围为3.4‰~10.0‰,平均值为6.4‰,其中以10 cm以上同位素值降低趋势明显,其可能原因与微生物降解活动以及湖泊水体的交换有关。31 cm以下δ15N-PON值的变化趋势与表层相反,则可能是早期成岩作用影响的结果。孔隙水中δ15N-TN同位素值最高,吸附态和水溶态差异较小,且该同位素组成较PON富集15N,可推测孔隙水剖面NH4+-N浓度的升高可能与硝酸盐的异化还原有关。     

海洋石油降解微生物及其降解机理

微生物修复作为一种新型环保的生物修复技术,已成为海洋石油污染生物修复的核心技术。对海洋石油降解微生物的种类即细菌、蓝藻、真菌以及藻类进行了总结,对微生物对石油烃的降解途径与降解机理进行了综述。微生物降解烷烃的过程包括末端氧化、烷基氢过氧化物以及环己烷降解3种形式。微生物对芳香烃的降解是通过芳香烃被氧化酶氧化导致苯环开环来实现的。微生物对多环芳烃的降解是在单加氧酶或双加氧酶的催化作用下被最终降解为二氧化碳和水而被分解。并对影响石油烃降解微生物的因素包括温度、营养物质等因素进行了分析。     

若尔盖草甸退化对土壤碳、氮和碳稳定同位素的影响

为了解不同退化阶段高寒草甸土壤碳、氮和碳稳定同位素的差异,对若尔盖湿地内沼泽草甸、草原化草甸、退化草甸3个阶段土壤的碳、氮和碳稳定同位素进行了分析.结果表明:若尔盖湿地草甸土壤δ¹³C 值介于-26.21‰～-24.72‰之间,土壤δ¹³C 值随土层加深而增大.土壤δ¹³C 值与有机碳含量对数值呈线性负相关.表层土壤(0～10 cm)δ¹³C值大小顺序为草原化草甸>退化草甸>沼泽草甸,β值大小顺序为草原化草甸>沼泽草甸>退化草甸.沼泽草甸、草原化草甸、退化草甸0～30 cm 土壤碳含量分别为105.32、42.11和31.12 g·kg^-1,氮含量分别为8.74、3.41和2.81 g·kg^-1,C/N分别为11.26、11.23和10.89.随着草甸的退化,土壤碳、氮呈降低趋势,退化草甸C/N值低于沼泽草甸和草原化草甸.随着土层深度加深,碳、氮含量呈现降低趋势.草甸退化导致的土壤δ¹³C 值差异主要发生在表层0～10 cm.3个退化阶段中,退化草甸土壤的β值和C/N最低,表明退化草甸土壤矿化作用较强.     

混合生物结皮对土壤养分的影响与群落结构之关联——以黄土丘陵区的生物结皮为例

自然条件下生物结皮是藻、藓及地衣等结皮类型以不同比例组成的混合群落,显著影响土壤养分含量,目前混合生物结皮对土壤养分的影响与其群落结构的关系尚不清楚,限制了混合生物结皮土壤养分的评估。为此,研究通过测定单一组成的藻结皮、藓结皮以及80%藻+20%藓、60%藻+40%藓、40%藻+60%藓和20%藻+80%藓4个不同藻藓比例的混合生物结皮土壤有机碳、全氮、全磷、速效磷、铵态氮和硝态氮含量,研究了混合生物结皮土壤养分与其群落结构之间的关联。结果显示：(1)藓结皮层土壤有机碳、全氮、速效磷、铵态氮和硝态氮含量显著高于藻结皮,分别高出166.4%、77.2%、55.1%、56.2%和42.2%。(2)藻藓混合生物结皮土壤有机碳、全氮、速效磷和铵态氮含量与组成和盖度等结构特征有关,可以通过单一类型生物结皮土壤养分含量与盖度加权预测混合生物结皮土壤养分储量。(3)混合生物结皮土壤有机碳、全氮、速效磷和铵态氮储量实测值(x)与预测值(y)拟合的线性函数分别为y=0.97x、y=0.96x、y=1.18x和y=0.92x。(4)混合生物结皮对全磷和硝态氮含量的影响与群落结构无关。生物结皮对下层0—5 ...     

Inoculating native microorganisms improved soil function and altered the microbial composition of a degraded soil

Restoration managers inoculate microorganisms to enhance soil function and improve restoration success, but the efficacy of these inoculations in real-world conditions is still unclear. We conducted a field experiment to test whether applying extruded seed pellets inoculated with native microbes affected soil properties related to ecosystem function in severely degraded mine soil. We found that inoculating with bacteria did not affect soil carbon, metabolic quotient (a measure of microbial stress), or basal respiration, but increased soil nitrogen by 75%, substrate-induced respiration by 147% and reduced carbon-to-nitrogen ratio by 44% compared to the control. This suggests that the bacteria inoculant contained free-living N fixers that increased the soil N content. Thus, inoculating with bacteria could supplement nitrogen fertilizers in degraded soils during soil restoration. However, we found that inoculating with a mix of bacteria and cyanobacteria did not affect any of the soil properties. This finding is counter to results in laboratory studies, suggesting that field tests are critical for understanding real-world outcomes of microbial inoculation. Finally, we found that soil microbial composition was changed by the inoculation with a mix of bacteria and cyanobacteria. None of the treatments significantly changed the diversity of soil microbial communities. Our data suggest that microbial inoculation could improve some aspects of ecosystem function and thus provide beneficial effects that might facilitate restoration of degraded sites.     

Response of carbon and nitrogen content in plants and soils to vegetation cover change in alpine Kobresia meadow of the source region of Lantsang, Yellow and Yangtze Rivers

We conducted this study in lightly and severely degraded Kobresia pygmaea meadow in Gande County, Qinghai Province of China. The purpose of this research was to compare carbon and nitrogen concentrations, content and dynamics of aboveground tissue, belowground roots and soil (0-40 cm) between lightly and severely degraded Kobresia meadow. The results showed that C and N concentrations and C:N ratio of the aboveground tissue were significantly higher in lightly degraded grassland than in severely degraded grassland. In addition, total carbon and nitrogen concentrations of the aboveground tissue were ranked in order of forbs > grasses > sedges in the same grassland type. Total carbon and nitrogen concentrations of belowground roots were significantly higher in severely degraded grassland than in lightly degraded grassland. Total carbon and nitrogen concentrations were higher in the aboveground tissue than in the belowground roots. Total soil organic carbon concentration in severely degraded grassland was significantly lower than that in lightly degraded grassland, and decreased with depth. C and N content per unit area was ranked in order of 0-40 cm soil depth > belowground roots > aboveground issue in the same grassland type. The total carbon content per unit area of aboveground tissue, roots and 0-40 cm soil depth declined by 7.60% after degradation from lightly (14669.2 g m⁻²) to severely degraded grassland (13554.3 g m⁻²), i.e., 0-40 cm soil depth declined by 4.10%, belowground roots declined by 59.97% and aboveground tissue declined by 15.39%. The nitrogen content per unit area of aboveground tissue, roots and 0-40 cm soil depth increased after degradation by 12.76% from lightly (3352.7 g m⁻²) to severely degraded grassland (3780.6 g m⁻²), i.e., 0-40 cm soil depth increased by 13.07%, belowground roots declined by 55.09% and aboveground tissue declined by 16.00%. As a result of grassland degradation, the total carbon lost by 11149 kg hm⁻², and the total nitrogen increased by 4278 kg hm⁻².     

植被不同退化状态下尕海湿地土壤氮含量及酶活性特征

土壤中氮素的吸收、转化及含量的变化是影响植被生长的关键因素。为探讨湿地植被不同退化状态对土壤氮组分含量和相关酶活性的影响,以及土壤氮组分含量与相关酶活性之间的关系,以甘南尕海湿地不同植被退化状态样地（未退化CK、轻度退化SD、中度退化MD和重度退化HD）为研究对象,采用野外采样与室内实验相结合的方法,分析了植被不同退化状态下不同形态氮组分（全氮、铵态氮、硝态氮和微生物量氮）含量的变化特征,以及土壤氮转化酶（蛋白酶、脲酶、硝酸还原酶和亚硝酸还原酶）活性之间的相关关系。结果表明：（1）在植被退化状态下,土壤含水量逐渐减小,土壤温度呈先减小后增大的趋势;（2）随着植被退化程度的加剧,硝态氮含量呈增加趋势,而全氮、铵态氮和微生物量氮含量均随退化程度加剧呈减小趋势;土壤蛋白酶活性随退化程度的加剧而减小,脲酶活性呈先减小后增大的趋势,重度退化活性最高,轻度退化最低;硝酸还原酶活性随退化程度的加剧而增加,亚硝酸还原酶活性表现为"升-降-升"的变化趋势,即轻度退化活性最高,未退化和中度退化较低;（3）土壤蛋白酶活性与全氮、铵态氮和微生物量氮呈极显著正相关关系（P < 0.01）,与硝态氮含量呈显著负相关关系（P < 0.05）;硝酸还原酶活性与蛋白酶活性恰好相反;脲酶活性与微生物量氮含量呈极显著正相关关系（P < 0.01）,与全氮含量呈显著正相关关系（P < 0.05）;亚硝酸还原酶活性与全氮和铵态氮含量呈极显著正相关关系（P < 0.01）,与硝态氮含量呈显著负相关关系（P < 0.05）。综上,在尕海湿地植被退化条件下,土壤氮组分含量增加可以有效提高相关酶活性。     

呼伦贝尔典型退化草原土壤理化与微生物性状

以内蒙古克鲁伦河流域呼伦贝尔典型草原为对象,设置了轻度、中度和重度退化3种类型样地,研究不同程度退化草原的物种组成、地上生物量、土壤理化性状、土壤微生物数量和酶活性,以及微生物生物量的变化.结果表明: 中度退化样地的群落物种丰富度最大,轻度退化样地的地上生物量显著高于重度退化样地.退化样地的土壤水分、养分(有机质、全氮),微生物量碳、氮,以及微生物数量和酶活性显著下降,土壤容重显著增加.退化样地的土壤微生物生物量碳、氮在128～185和5.6～13.6 g·kg^-1,土壤脱氢酶和脲酶活性均与土壤容重呈显著负相关,与土壤全氮、有机质、微生物数量以及微生物生物量碳、氮呈显著正相关,地上生物量与土壤细菌和真菌数量呈不同程度的正相关.     

植被退化对温带典型草原根系-土壤系统碳氮分配的影响

以3种不同退化程度的温带典型草原(大针茅轻度退化、中度退化和重度退化)为研究对象,研究植被退化对温带典型草原土壤及根系碳氮含量及储量的影响。结果显示:(1)植被退化对地下根系碳含量影响不显著(P0.05),而对地下根系氮含量的影响显著(P0.05),中度退化样地根系氮含量显著高于轻度退化和重度退化样地(P0.05)。(2)植被退化对根系碳氮储量影响显著(P0.05),根系碳氮储量随着土层深度增加而减少,总根系碳氮储量随退化程度加剧而降低。(3)土壤有机碳、总碳和总氮含量及储量均受退化程度和采样深度的影响显著(P0.05),其含量随着土壤深度的增加而显著减少,随退化程度加剧而显著降低(P0.05)。(4)土壤是根系-土壤系统碳氮储存的最主要场所,储量占比90%以上。虽然土壤碳氮储量均存在表层聚集现象,但表层储量所占比例在各样地间差异显著(P0.05)。     

江河源区高山嵩草(Kobresia pygmaea)草甸植物和土壤碳、氮储量对覆被变化的响应

以青海省果洛州藏族自治州甘德县青珍乡高山嵩草Kobresia pygmaea草甸轻度退化草地和重度退化草地为研究对象,通过植物地上部分主要功能群(禾草类、杂类草、莎草类)、植物根系和土壤碳、氮浓度及储量动态研究,结果表明:高寒小嵩草草甸轻度退化草地地上部分主要功能群碳、氮浓度和C ∶ N比值明显高于重度退化草地的浓度.同一草地类型主要功能群比较,碳、氮浓度依次为杂类草>禾草类>莎草类;植物地上部分的碳、氮浓度明显高于地下根系的碳、氮浓度.重度退化草地植物根系碳、氮浓度高于轻度退化草地植物根系碳、氮浓度.重度退化草地土壤总有机碳浓度显著低于轻度退化草地土壤总有机碳浓度,随着土层的加深碳、氮浓度有减少的趋势.江河源区高山嵩草草甸的土壤有机碳、氮储量最大,植物根系碳、氮储量居中,植物地上部分碳、氮储量最小.重度退化草地总有机碳储量(13554.3 g/m2)较轻度退化草地储量(14669.2 g/m2)下降7.60%.其中,0～40cm土壤层碳储量下降4.10%,植物根系碳储量下降59.97%,植物地上部分碳储量下降15.39%;重度退化草地总氮储量(3780.6 g/m2)较轻度退化草地储量(3352.7 g/m2)高12.76%,其中,0～40cm土壤中总氮储量高13.07%,植物根系全氮储量下降55.09%,植物地上部分全氮下降16.00%.由于草地退化损失有机碳11149 kg/hm2,而全氮增加4278 kg/hm2.     

不同土壤水分条件下香樟凋落叶覆盖对土壤碳氮循环的影响

凋落物作为森林生态系统碳库的重要组成部分对森林土壤碳、氮循环具有重要作用.为探讨香樟凋落叶对土壤碳、氮循环的影响,室内模拟研究了10%、20%和30% 3种土壤含水量条件下香樟凋落叶覆盖森林土壤中碳、氮元素的变化.结果表明: 3种含水量条件下香樟凋落叶覆盖均显著增加了土壤CO₂排放速率和土壤溶解性有机碳(WSOC)含量,但显著降低了土壤中硝态氮含量,表明香樟凋落叶覆盖能够增强土壤呼吸强度和碳矿化,抑制土壤硝化作用;香樟凋落叶覆盖能够显著增加10%含水量土壤中铵态氮含量,但降低了20%和30%含水量土壤铵态氮含量,表明香樟凋落叶覆盖对土壤铵态氮含量的影响与土壤含水量有关.香樟凋落叶中部分单萜烯浓度在不同土壤含水量条件下分别与土壤CO₂排放速率和铵态氮含量呈显著正相关,而与土壤WSOC和硝态氮含量呈显著负相关,说明香樟凋落叶覆盖对土壤碳、氮循环的影响可能与凋落叶中的单萜烯有关.     

Contribution of chloroplast biogenesis to carbon–nitrogen balance during early leaf development in rice

Chloroplast biogenesis is most significant during the changes in cellular organization associated with leaf development in higher plants. To examine the physiological relationship between developing chloroplasts and host leaf cells during early leaf development, we investigated changes in the carbon and nitrogen contents in leaves at the P4 developmental stage of rice, during which leaf blade structure is established and early events of chloroplast differentiation occur. During the P4 stage, carbon content on a dry mass basis remained constant, whereas the nitrogen content decreased by 30%. Among carbohydrates, sucrose and starch accumulated to high levels early in the P4 stage, and glucose, fructose and cellulose degradation increased during the mid-to-late P4 stage. In the chloroplast-deficient leaves of the virescent-1 mutant of rice, however, the carbon and nitrogen contents, as well as the C/N ratio during the P4 stage, were largely unaffected. These observations suggest that developing rice leaves function as sink organs at the P4 stage, and that chloroplast biogenesis and carbon and nitrogen metabolism in the leaf cell is regulated independently at this stage.