用^32P标记cDNA探针进行核酸斑点杂交检测马铃薯卷叶病毒（PLRV）

利用克隆的马铃薯卷叶病毒（ＰＬＲＶ）外壳蛋白（ＣＰ）基因ｃＤＮＡ,用切口平移法制成＾３２Ｐ标记探针,通过核酸斑点杂交,对马铃薯卷叶病毒ＲＮＡ,提纯的马铃薯卷法病毒和感染ＰＬＲＶ的马铃薯茎、叶、声     

马铃薯卷叶病毒（PLRV）基因组研究进展

马铃薯卷叶病毒（ＰＬＲＶ）基因组研究进展张鹤龄（内蒙古大学生物系,呼和浩特０１００２１）关键词马铃薯卷叶病毒,基因组ＴｈｅＡｄｖａｎｃｅｓｉｎＰＬＲＶＧｅｎｏｍｅＲｅｓｅａｒｃｈＺｈａｎｇＨｅｌｉｎｇ（ＩｎｎｅｒＭｏｎｇｏｌｉａＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ,...     

双价外壳蛋白基因植物表达载体的构建及马铃薯转基因植株的鉴定

在克隆了马铃薯Ｘ病毒（ＰＶＸ）、马铃薯Ｙ 病毒（ＰＶＹ）和马铃薯卷叶病毒（ＰＬＲＶ）的外壳蛋白基因的基础上,构建同时包含ＰＶＸ和ＰＶＹ 与ＰＶＹ 和ＰＬＲＶ 两个外壳蛋白基因植物表达框架的表达载体,通过农杆菌（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）介导转化烟草（Ｎｉｃｏｔｉａｎａｔａｂａｃｕｍ ）和生产上常用的几个马铃薯（Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ ）优良品种：“Ｆａｖｏｒｉｔａ”、“虎头”、“克４”。经ＰＣＲ检测证明外源基因已整合到植物的染色体上,得到批量转基因植株。在转ＰＶＸ＋ＰＶＹ 外壳蛋白基因的烟草上接种ＰＶＸ （５ μｇ／ｍ Ｌ）、ＰＶＹ（２０ μｇ／ｍ Ｌ）病毒,得到有一定抗性的植株     

利用RNA干涉技术及微束激光转化法培育抗病毒马铃薯

针对马铃薯生产中危害严重、分布广泛并且具有强烈协生作用的马铃薯X病毒和马铃薯Y病毒,开展了抗病毒病的育种研究。采用RT-PCR技术分别克隆了267 bp的编码马铃薯X病毒外壳蛋白(PVX-cp)基因的相对保守区段X和294 bp的编码马铃薯Y病毒外壳蛋白(PVY-cp)基因的相对保守区段Y两个片段,将其按顺序连接,形成融合基因XY,然后分别将融合基因XY正向和反向插入到载体pHANN IBAL中,得到了载体pH IV,再用NoⅠt对pH IV进行酶切,将产生的大片段插入到载体pART27中,得到同时以PVX-cp基因和PVY-cp基因为靶标的XY的RNA i载体pAR IV。采用微束激光穿刺转化技术转化马铃薯品种Favorita的愈伤组织,得到了14株表型正常的转基因植株,转基因植株的southern b lot分析表明,导入的外源融合基因拷贝数介于2~4之间。攻毒实验表明,其中11株转基因植株对PVX、PVYo以及PVX和PVYo混合侵染均表现免疫,而其它3株的病毒浓度也低于对照。这一结果将为利用RNA i干涉技术开展植物抗多种病毒病的育种提供重要依据,验证了所构建的RNA干涉(RNA interference RNA i)载体具有良好的功能,同时又一次证明微束激光穿刺法是一种有效的遗传转化手段。     

马铃薯Y病毒外壳蛋白基因的克隆及序列分析

本文报道应用聚合酶链式反应(PCR)技术,在体外扩增马铃薯 Y 病毒外壳蛋白基因及其克隆和序列分析的结果。病毒 RNA 从马铃薯 Y 病毒感染的烟草叶片中提取,用合成的PCR 3引物及 AMV 逆转录酶合成了单链的 cDNA。利用 PCR 技术,经30个循玎的扩增。得到了一特异的0.8kb 片段。克隆后对此片段进行了限制性内切酶物理图谱分析,并测定了其全序列。实验结果证明,我们克隆到的是完整的马铃薯 Y 病毒的外壳蛋白基因。与国外报道的马铃薯 Y 病毒 N 株相比,其核苷酸序列及推测的氨基酸序列的同源率分别为97.8%和97%。将该基因导入马铃薯以期获得抗 Y 病毒马铃薯的工作正在进行。本文还对 PCR 技术用于扩增植物 RNA 病毒的方法以及用基因工程方法培育抗病毒作物新品种的可行性等进行了讨论。     

用基因操作开发抗卷叶病毒马铃薯

北海道绿色生物技术研究所与北海道大学共同开发用基因操作导入马铃薯卷叶病毒的外壳蛋白的马铃薯,在实验室内确认重组马铃薯有抗病毒性。另外,还导入 Y 病毒的外壳蛋白,并用点印迹法成功地检测到基因的重组。该公司在5月26～28日于盛冈市召开的日本植物病理学会发表了这种详细的报告。两种病毒都是使日本马铃薯农户头痛的主要病毒。推进抑制由于病毒感染,而产量减少和省农药化等。无论如何     

中国番茄黄化曲叶病毒——双生病毒的一个新种

用 2 0个单抗对中国番茄黄化曲叶病毒 (TYLCV CHI)和其他双生病毒进行了测定 ,在血清学水平上证实中国番茄黄化曲叶病毒与中国烟草曲叶病毒有较大的亲缘关系 ;同时报道了TYLCV CHI部分共同区、外壳蛋白N端基因和AV1基因的PCR及其克隆和序列分析 ,从分子水平上证实TYLCV CHI与世界各地的其他双生病毒不同 ,是一种新的粉虱传双生病毒     

烟草脉扭病毒基因组部分序列的克隆和分析

烟草脉扭病毒(Tobacco vein distorting virus,TVDV)是引起烟草丛顶病的两种病毒之一.TVDV被归为黄症病毒科的暂定成员.应用黄症病毒科的通用引物和根据马铃薯卷叶病毒属成员核酸序列设计的简并引物,通过RT-PCR从烟草丛顶病烟株总RNA中扩增到了TVDV基因组的部分序列.序列分析获得了长度为1654 bp的序列,编码推测的TVDV复制酶基因的部分序列、外壳蛋白基因及运动蛋白基因的全部序列.根据这三个基因编码的氨基酸序列构建的分子进化树分析表明,TVDV为黄症病毒科的确定成员.根据其基因间隔区的长度特征和各ORF编码的氨基酸的分子进化分析,我们推测TVDV应当是马铃薯卷叶病毒属的一个新成员.这是TVDV的分子生物学特征的首次报道.     

烟草脉扭病毒基因组部分序列的克隆和分析

烟草脉扭病毒（Tobacco vein distorting virus,TVDV）是引起烟草丛顶病的两种病毒之一。TVDV被归为黄症病毒科的暂定成员。应用黄症病毒科的通用引物和根据马铃薯卷叶病毒属成员核酸序列设计的简并引物,通过RT－PCR从烟草丛顶病烟株总RNA中扩增到了TVDV基因的部分序列。序列分析获得了长度为1654bp的序列,编码推测的TVDV复制酶基因的部分序列,外壳蛋白基因及运动蛋白基因的全部序列。根据这三个基因编码的氨基酸序列构建的分子进化树分析表明,TVDV为黄症病毒科的确定成员。根据其基因间隔区的长度特征和各ORF编码的氨基酸的分子进化分析,我们推测TVDV应当是马铃薯卷叶病毒属的一个新成员。这是TVDV的分子生物学特征的首次报道。     

马铃薯卷叶病毒基因间隔区转化的马铃薯抗病性研究

将本室合成、克隆的马铃薯卷叶病毒(Potato Leafroll Virus, PLRV)中国分离株的基因间隔区(intergenic sequence, IS)双链cDNA以正、反向两种方式分别构建于转化载体pROK2中,通过致瘤农杆菌介导,以马铃薯叶圆片为转化材料,转化马铃薯栽培品种Desiree,获得了转基因植株.卡那霉素抗性分析和PCR检测目的基因,证明PLRV IS双链cDNA已经整合到转基因马铃薯的染色体基因组中.将转基因植株移栽网棚用蚜虫接种PLRV,观察症状并用酶联免疫吸附测定(ELISA)检测转基因植株中PLRV含量.结果表明,表达PLRV IS正意和反意RNA的转基因植株,接种病毒后表现无症状或症状轻微,PLRV平均滴度均较未转基因对照植株低.表达正意RNA的转基因植株PLRV滴度降低43%～72%,表达反意RNA的转基因植株PLRV滴度降低72%～86%,由此可见,表达PLRV IS反意RNA的转基因马铃薯对PLRV抗性较强.     

马铃薯卷叶病毒56kD蛋白基因及3‘端非编码区克隆和序列分析

根据已报道的马铃薯卷叶病毒基因组序列,设计合成一对特异性引物,以马铃薯卷叶病毒中国分离株的ＲＮＡ为模板,反转录合成了ｃＤＮＡ第一条链,经ＰＣＲ扩增后克隆于ｐＵＣ１９质粒中,进一步用ＰＣＲ鉴定,限制酶切分析用序列分析。结果表明,ＰＬＲＶ－Ｃｈ５６ｋＤ蛋白基因由１５２７个核苷酸组成,编码５０８个氨基酸,３‘端非编码区由１４１个核苷酸组成,与国外报道的苏格兰ＰＬＲＶ－Ｓ,荷兰ＰＬＲＶ－Ｎ,加拿大ＰＬＲＶ     

马铃薯单双三价抗病毒基因表达载体的构建

马铃薯Y病毒(PVY)、X病毒(PVX)和卷叶病毒(PLRV)引起的病害是造成我国马铃薯退化的主要原因,严重危害我国的马铃薯生产。PVY和PVX或PVY和PLRV混合侵染带来的损失远远大于各病毒单独侵染。国外科学家通过在马铃薯植株体内表达病毒外壳蛋白(CP)基因来减缓病毒病害的发生已取得相当的成功。 我们从河北省坝上地区农科所试验田中采集PLRV感病材料Burbank及87-1,参照文献提取病毒RNA并以其为模板,反转录合成cDNA。根据PLRV澳大利亚分离物已发表的序列,设计并     

马铃薯卷叶病毒外壳蛋白基因的合成,分子克隆和全序列分析

以分离自马铃薯主栽品种“紫花白”的马铃薯卷叶病毒(PLRV)分离物的RNA为模板,用人工合成的引物,用反转录和随后PCR扩增的方法合成了PLRV外壳蛋白(CP)基因的cDNA,并克隆于pUC19中。进一步用限制酶切和核苷酸序列分析表明,合成的cDNA由627个核苷酸组成(包括起始和终止密码),序列中有Hinc Ⅱ和BamH Ⅰ两个酶切位点,与国外报道一致。和国外的4个PLRV分离物CP基因序列对比结果,具有高度同源性,其同源率达99.0—99.7％。     

植物遗传工程

920268抗病毒植物的遗传工程〔英〕/Godoni,F一ZAreh.Virol一2990,115(i一2)一i~22〔译 自DBA,1991,10(9),91一05050] 讨论的主要内容包括:用于交叉保护的外壳蛋 白序列对植物的转化,表达病毒外壳蛋白的转基因植物的田间试验,抗病毒侵染的反义RNA技术,病毒卫星RNA在植物中的表达,ribozyme和锤头RNA机制,作为受体专性抗病毒荆的抗个体基因型的抗体;人干扰素基因在转基因植物中的克隆和表达。构建了抗下列病毒的转基因植物,烟草花叶病毒、首藉花叶病毒、烟草线条病毒、马铃薯X病毒、马铃薯Y病毒等。外壳蛋白介导的保护是最广泛采用的…     

马铃薯卷叶病毒P0蛋白抑制RNA沉默及其与AGO蛋白的相互作用

马铃薯卷叶病毒(Potato leafroll virus,PLRV)P0是由开放阅读框1(ORF1)所编码,利用农杆菌介导的瞬时表达技术渗透注射转绿色荧光蛋白(GFP)基因的16c烟草叶片发现PLRV-P0能够抑制由GFP mRNA引起的基因沉默,结果表明PLRV-P0是马铃薯卷叶病毒编码的一个基因沉默抑制因子。通过序列分析发现PLRV-P0基因序列中含有两个重复的WG基序,我们将PLRV-P0基因序列中第87位和第140位的色氨酸(W)点突变为丙氨酸(A)(命名为P0WA),构建植物表达载体pCAMBIA1300-CE-P0,pCAMBIA1300-CE-P0WA,农杆菌渗透注射本氏(Nicotiana benthamiana)烟草叶片,通过荧光显微镜观察发现PLRV-P0和AGO共同注射后有绿色荧光出现而PLRV-P0WA和AGO共同注射后则没有绿色荧光出现。研究结果初步表明,PLRV-P0能够和AGO蛋白发生相互作用,重复的WG基序是其与AGO蛋白相互作用的关键氨基酸。     

抗病毒性重组马铃薯的非封闭式实验

7月16日召开了科学技术会议生命科学分会重组DNA技术分科会,批准了北海道绿色生物技术研究所申请的卷叶病毒抗性重组马铃薯的非封闭式温室的栽培实验。计划在正式通知后将现在封闭式温室栽培的重组马铃薯移植到非封闭式温室。试验如顺利的话,明年可能在隔离试验田进行野外栽培实验。按今年的预算,将在农林水产省的北海道农业试验场建设的隔离试验田进行首次野外栽培实验。 马铃薯卷叶病毒是马铃薯的大敌。美国Monsanto公司和荷兰Mogen公司分别导入外壳蛋白基因成     

病毒诱导的PVX cp转基因沉默及其DNA甲基化

利用PCR方法获得了马铃薯X病毒(PVX)外壳蛋白(CP)基因(cp),并将其构建到植物表达载体中,利用农杆菌介导的叶盘法转化烟草(Nicotiana tabacum L.)。Northern杂交及Run on实验表明有3株转基因烟草发生了转录后基因沉默。发生沉默的cp基因的甲基化分析结果表明,发生转录后基因沉默的cp基因发生了不同程度的甲基化,说明DNA甲基化并没有完全抑制cp基因的转录。利用PVX病毒对外壳蛋白正常表达的转基因烟草进行接毒,Northern杂交检测结果表明,病毒诱导cp发生了基因沉默。进一步的Run on结果表明,转基因烟草中cp基因在沉默前后转录速率并没有发生变化,说明病毒诱导的沉默是一种转录后沉默。对cp基因沉默前后的甲基化分析表明,病毒的侵染导致了cp基因甲基化程度的增加。     

病毒诱导的PVX cp转基因沉默及其DNA甲基化

利用PCR方法获得了马铃薯X病毒(PVX)外壳蛋白(CP)基因(cp),并将其构建到植物表达载体中,利用农杆菌介导的叶盘法转化烟草(Nicotiana tabacum L.).Northern杂交及Run on实验表明有3株转基因烟草发生了转录后基因沉默.发生沉默的cp基因的甲基化分析结果表明,发生转录后基因沉默的cp基因发生了不同程度的甲基化,说明DNA甲基化并没有完全抑制cp基因的转录.利用PVX病毒对外壳蛋白正常表达的转基因烟草进行接毒,Northern杂交检测结果表明,病毒诱导cp发生了基因沉默.进一步的Run on结果表明,转基因烟草中cp基因在沉默前后转录速率并没有发生变化,说明病毒诱导的沉默是一种转录后沉默.对cp基因沉默前后的甲基化分析表明,病毒的侵染导致了cp基因甲基化程度的增加.     

香蕉花叶病毒外壳蛋白基因克隆及表达载体的构建

从海南大田感染香蕉花叶病的香蕉叶片 ,获得香蕉花叶病毒 ,提纯其 RNA,在 AMV反转录酶作用下合成 c DNA第一链 ,经 PCR扩增 ,获得一约 70 0 bp的 DNA片段 ,测序结果显示所克隆的 DNA片段包含一完整的香蕉花叶病毒株系 ( CMV-BHI)外壳蛋白基因 ,长度为 6 5 7bp,然后将此 DNA片段 ,分别克隆到p BI1 2 1和 p KHG4质粒 ,构成两个含 Ca MV35 s启动子 ( 5 '-端 )、NOS终止子 ( 3'-端 )和分别含 NPT 标记基因和 NPT 及 HPT标记基因的植物表达载体 ( p TBB和 p TBK)。然后用 p AHC1 8中的 UBI promoter换下p BI1 2 1的 Ca MV35 s promoter,构成 p BIAH;再用 CMV-BHI外壳蛋白基因换下 p BIAH中 GUS基因 ,构成一含单子叶植物启动子 UBI和 NPT 标记基因的植物表达载体 ( p TBBU)。从而为 CMV-BHI外壳蛋白基因在香蕉中表达打下了基础     

水稻条纹叶枯病毒分子生物学的研究——Ⅲ.外壳蛋白基因的序列分析

以含有水稻条纹叶枯病毒(RSV)外壳蛋白(CP)基因的重组克隆为材料,将RSV-cDNA酶解后,亚克隆人M13mp18、19,采用双脱氧链终止法测序得到RSV-CP基因的全长序列(共含966bp),同日本已发表的RSV-CP基因序列相比同源率达97％。