DNA探针技术在肠道细菌检定中的应用

<正>随着生物化学和分子生物学的发展,DNA探针技术应运而生。它作为一个有效的检测手段,已广泛应用于分子生物学和遗传工程中的基因检测等工作中。近年来,医学微生物工作者已将探针技术应用于致病性细菌鉴定、分类和流行病学调查等工作。本文拟就DNA探针技术在肠道细菌检定中的应用情况作一综述。     

肽核酸探针在微生物诊断领域的应用进展

肽核酸(Polyamide nucleic acid,PNA)是以中性酰胺键为骨架的脱氧核糖核酸(DNA)结构类似物,它可以特异性地与DNA杂交,且具有极高的生物稳定性.相比较传统的DNA探针技术,肽核酸探针以其特殊的结构和性质在食品、环境及临床等微生物快速诊断领域显示出独特的优势.就肽核酸探针在微生物诊断方面的应用进展做简要综述.     

低温菌启动子探针质粒的构建

为了在宿主菌Acinetobacter sp.DWC6中构建低温菌蛋白表达载体,以pBR322质粒为基础,去除质粒上β-内酰胺酶基因的启动子片段,取而代之为来源于质粒pJRD215的卡那霉素抗性基因片段,并在pBR322中插入Acinetobacter菌属特异性ori的DNA片段,构建了能在Acinetobacter sp.DWC6和E.coli中正常复制的启动子探针质粒pBAP1。通过在质粒pBAP1中的β-内酰胺酶基因上游随机导入Acinetobacter sp.DWC6基因组片段,通过检测宿主细胞的氨苄青霉素抗性和β-内酰胺酶活性,来筛选强启动子片段,并分析了启动子探针质粒载体的功能及启动子的强度。     

基因检测技术为许多工业打开了大门

DNA探针——小段能识别特定基因的DNA片段——使鉴定和分离任何有机体的遗传信息成为可能。它原是作为遗传工程研究的基本工具而发展起来的,现在开始作为传染病和微生物试验用的试剂进入市场。检测探针的新技术为更多的商业研究与开发提供了基础,现已有可能用酶、荧光分子或化学发光催化剂而不用传统的放射性同位素标记DNA。     

多重连接探针扩增技术在临床病原体检测中的应用

真菌等临床病原体的诊断、基因分型和耐药性检测对于临床诊治十分重要。多重连接探针扩增是一个可以同时定量检测多个基因序列的,简单、有效、快速的方法。其步骤包括待测DNA变性、半探针与待测DNA杂交,半探针的连接、PCR法扩增、凝胶电泳或者毛细管电泳鉴定扩增产物。MLPA已经在临床微生物诊断和研究中有了一定的应用,虽然尚处于起步阶段,但因其操作简便,反应快速,高通量,高敏感性和特异性的特点,拥有良好的应用前景。     

肺炎支原体

<正>前言 一般认为,肺炎支原体(Mycoplasma pneumonice,M·P)引起发病及产生临床症状的主要原因在于宿主,而与M·P的致病性程度无关。因此,在M·P感染的DNA诊断中,关键是采用对M·P有高度特异性的DNA探针,而不必对病原性因子进行DNA诊断。以前有关在感染初期起重要作用的细胞粘着蛋白(PI蛋白)等的DNA的特异性探针曾有过报导,但在菌种鉴定时,如果用核糖体RNA(rRNA)的互补DNA作为探针,则可在很短的碱基链上显示出高度的特异性,故甚有实用价值。本文对以M·P 16S rRNA互补的单链DNA作探针,通过RNk-DNA杂交检测M·P的方法作一介绍。     

基因导流杂交法于低密度基因芯片平台上检测乙肝病毒

运用基因导流杂交法在低密度基因芯片平台上检测乙肝病毒DNA（HBV DNA）。设计特异性引物,对HBV基因组DNA中的编码HBV多聚酶蛋白的一段序列进行PCR扩增;根据被扩增片段,设计保守的特异性探针,并将该探针固定在杂交膜上,制备低密度基因芯片：使用导流杂交法将上述扩增产物和低密度基因芯片进行杂交,根据显色反应判断被检测样本有无HBV DNA。基因导流杂交法在低密度基因芯片平台上可以方便、快速、准确地检测乙肝病毒。     

染色体DNA指纹图法——一种用于病原微生物种、株鉴定的新方法

<正>DNA探针技术在临床微生物学诊断中有巨大潜力,它提供了快速、价廉地鉴定在合成培养基上不易生长的病原体的可能性,包括检测携带已知毒力因子和抗生素抗性基因的病原体株,同时可以直接检测临床标本和污染食品中的传染原。目前已有大量有价值的资料,详细综述了此技术在这些方面和微生物学其它方面的应用(Highfield和Dougan,1985;Edberg,1986;Goldmann,1987;Miotti,1987;Tenover,1988;Landegren等,1988)。 在微生物鉴定领域,诊断用探针已可购得,可用于检测各种菌种,包括嗜肺军团菌、结核杆菌、淋球菌、肠道致病性大肠杆菌、肺炎支原体和沙门氏菌某些血清型(Tenover,1988)。另一应用引起了流行病学家的兴趣,即利用探针检测提供的DNA指纹图对医院内和社会的疾病爆发进行研究和控制,因为这些DNA指纹图对核苷序列中较小的基     

RecA蛋白介导的小粒野生稻STK类抗性基因富集文库的构建

利用RecA蛋白的同源重组特性,以生物素标记的STK类抗性基因PCR扩增产物为探针,对小粒野生稻DNA文库进行富集,构建了库容量为1 710个的STK类抗性基因富集文库,通过菌落原位杂交筛选获得21个阳性克隆.其中10个阳性克隆进行了两端测序,生物信息学分析表明:有3个阳性克隆可分别定位于粳稻抗性基因附近和抗性基因内,可能是新的候选抗性基因;有2个阳性克隆可以在粳稻上定位,但周围无抗性基因片段;其它5个阳性克隆由于与栽培稻有多处匹配,不能精确定位。     

分子生物学方法在食品微生物检测中的应用

近年来,食品安全受到广泛关注。及时、准确地检测出食品中的病原微生物是食品安全检测的重要内容,食品病原微生物的分子生物学检测技术因其特异性和灵敏性而备受瞩目。我们主要介绍了基因探针检测法、PCR检测法和基因芯片检测法的原理、开发及其在食品微生物检测中的应用。     

肽核酸探针技术及其在微生物检测中的应用

肽核酸(Peptide Nucleic Acid,PNA)是近十几年发展起来的以中性酰胺键为骨架的脱氧核糖核酸 (Deoxyribonucleic Acid,DNA)类似物,它能够与DNA和RNA特异性地结合从而可以制备PNA探针.与 DNA探针相比,其杂交的稳定性和特异性增加且能在低盐浓度下进行杂交.因此它能够大大提高微生物学检测和医疗诊断的效率和灵敏度.PNA独特的生化属性已逐渐为世人所瞩目,PNA探针技术也得到了迅速发展,尤其是其在微生物检测领域中的应用.     

生物素标记寡核苷酸探针探测扩增的病理性突变珠蛋白基因

用末端转移酶催化生物素核苷酸底物(Biotin-ll-dUTP)共价连接在合成的寡核苷酸3’羟基末端,从而合成了两种寡核苷酸探针(β~T_(41-42)及β~A_(41-42))。用它们分别与克隆化扩增的正常和突变的β—珠蛋白基因片段杂变。结果表明该探针都具有与~(32)P探针相似的特异性,其杂交的灵敏度为2—3pg(特异序列)。进而将探测HbS基因的正常和异常两种寡核苷酸19聚体(β~A_6和β~S_6)用~(32)P和生物素分别标记;将HbS杂合子病人的白细胞DNA经聚合酶链反应(PCR)法扩增,并以含正常β—珠蛋白基因的DNA片段作对照,与两种探针分别进行斑点杂交。所得结果完全一致;Hbs杂合子DNA对正常和异常探针都显出杂交信号,而正常DNA只与β~A探针显杂交信号。     

综述与专论：微生物消毒剂抗性机理

在物体表面和传播介质中,消毒剂能有效抑制或杀死微生物,广泛用于食品、卫生、健康、防疫等领域。在新型冠状病毒肺炎(COVID-19)疫情期间,全球消毒剂的使用量激增,对有效防控病毒传播和防止疫情扩散起到重要作用。但消毒剂的不正确使用会降低其有效性,甚至会诱导微生物产生抗性,从而增加传染性疾病的传播风险。微生物的消毒剂抗性基因还会通过繁殖传代增殖或在不同种属间水平转移而加剧其污染和传播风险,严重威胁到公共卫生安全。目前,抗生素抗性基因(ARG)的广泛出现引起了全球对公共卫生的关注,但对消毒剂的抗性认识非常有限。本文综述了近年来微生物对消毒剂抗性的研究,着重就微生物通过形成生物膜、降低细胞膜通透性、过量表达外排泵、产生消除或减弱消毒剂的特异性酶、改变作用靶点等方式产生抗性的机理进行综述。另外针对微生物消毒剂抗性的获得和传播,对染色体和质粒介导的抗性基因、环境中微生物消毒剂抗性与抗生素抗性的关联进行了论述。消毒剂抗性基因能通过质粒、噬菌体等可移动遗传元件,以转化、转导或接合的方式转移传播,对科学消毒提出新要求。     

ETA基因作为荧光定量PCR靶基因设计TaqMan探针快速检测铜绿假单胞菌的研究

铜绿假单胞菌是临床上常见致病菌, 传统的检测方法有各种弊端。本研究对该细菌的ETA基因用生物信息学方法加以分析, 选取相对保守且高度特异的DNA序列, 设计一对特异性引物和一个TaqMan探针, 建立FQ-PCR (fluorescence quantitative PCR)检测PA的方法。通过对梯度浓度的铜绿假单胞菌基因组DNA样品进行FQ-PCR检测和对多种细菌的DNA进行扩增, 来检测其灵敏度和验证引物和探针的特异性。试验结果表明, 对比现有的检测方法, 以ETA基因为靶基因, 基于TaqMan探针的快速FQ-PCR检测技术有更高的灵敏度和更好的特异性等优点, 具有很好的研究价值和应用前景。     

ETA基因作为荧光定量PCR靶基因设计TaqMan探针快速检测铜绿假单胞菌的研究

铜绿假单胞菌是临床上常见致病菌, 传统的检测方法有各种弊端。本研究对该细菌的ETA基因用生物信息学方法加以分析, 选取相对保守且高度特异的DNA序列, 设计一对特异性引物和一个TaqMan探针, 建立FQ-PCR (fluorescence quantitative PCR)检测PA的方法。通过对梯度浓度的铜绿假单胞菌基因组DNA样品进行FQ-PCR检测和对多种细菌的DNA进行扩增, 来检测其灵敏度和验证引物和探针的特异性。试验结果表明, 对比现有的检测方法, 以ETA基因为靶基因, 基于TaqMan探针的快速FQ-PCR检测技术有更高的灵敏度和更好的特异性等优点, 具有很好的研究价值和应用前景。     

林可链霉菌中的同源重组

为研究链霉菌中的同源整合频率和机制 ,采用不能在链霉菌中复制的大肠杆菌质粒转化链霉菌StreptomyceslincolnensisB48。质粒pYYE0 4a1上携带的被硫链丝菌素抗性基因灭活的林可霉素生物合成基因与染色体DNA上的同源基因发生重组 ,经过低抗筛选 ,得到两个突变子S .lincolnensisYY1和S .lincolnensisYY2。进一步以硫链丝菌素抗性基因为探针杂交染色体DNASmaⅠ片段 ,S .lincolnensisYY1和S .lincolnensisYY2都得到 1 5kb的阳性条带 ;而以缺失的lacZ基因为探针杂交染色体DNAHindⅢ和SmaⅠ联合酶切片段 ,只有S .lincolnensisYY2得到 4 4kb的阳性条带。Southern杂交结果表明S .lincolnensisYY1是由同源交换或二次重组产生的 ,而S .lincolnensisYY2为同源整合的结果。为验证同源整合子上大肠杆菌复制子和氨苄抗性基因的存在 ,用SphⅠ酶切染色体DNA后连接 ,连接液转化E .coliJM83感受态细胞 ,在氨苄抗性板上得到 2个转化子 ,命名为pSLE1。对…     

快速评价肠道微生物的qPCR方法的建立

【背景】近些年,16S rRNA基因测序与宏基因组分析常用于肠道微生物病原体检测。【目的】为了使检测不受限于高成本与耗时长的问题,基于荧光探针的实时荧光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR, qPCR),建立一种评估人类肠道微生物群组成的平台用于检测肠道微生物丰度。【方法】从公共数据库筛选10种肠道中普遍存在的微生物分类群,使用20个粪便样本验证为10种靶标所设计的特异性引物与探针,最后通过比较qPCR方法和16SrRNA基因测序技术的检测结果来评估该平台的有效性。【结果】10对引物及其探针对靶标分类群具有特异性并且在HITdb数据库中靶向菌种的覆盖率超过70%;样本检测结果的变异系数(coefficient of variation,CV)小于10%,证明了该方法具有很高的稳定性;qPCR方法检测样本中物种的相对丰度与16S rRNA基因序列生物信息学分析结果大部分具有显著相关性(P<0.05)。【结论】本研究根据HITdb数据库设计的靶向微生物群的引物和探针检测到的粪便样本中微生物的相对丰度结果与16S rRNA基因测序结...     

应用xMAP液态芯片多重快速检测四种病原微生物的研究

目的：建立一种多重、快速、特异性好、灵敏度高的病原微生物检测方法。方法：根据GenBank数据库中的小肠结肠炎耶尔森氏菌、单核细胞增生性李斯特菌、产气荚膜梭菌、鼠疫耶尔森氏菌基因序列,分别针对ail、hly、cpe、3a基因设计4对引物和4条探针。通过重叠PCR扩增各目的基因并构建重组质粒,以该重组质粒DNA为模板,通过多重PCR同时扩增上述4个基因,建立xMAP液态芯片检测技术,在此基础上对标准菌株基因组DNA进行检测并验证该方法的特异性和敏感性。结果：xMAP液态芯片对质粒DNA和标准菌株基因组DNA的检测结果与多重PCR结果一致。该方法能在3.5 h内同时完成对4种病原菌的检测,特异性好,且敏感性要高于PCR方法,灵敏度最高可达200CFU/ml。结论：xMAP液态芯片技术是病原微生物的多重快速检测的新方法,具有很好的应用价值和前景。     

应用xMAP液念芯片多重快速检测四种病原微生物的研究

目的:建立一种多重、快速、特异性好、灵敏度高的病原微生物检测方法。方法:根据GenBank数据库中的小肠结肠炎耶尔森氏菌、单核细胞增生性李斯特菌、产气荚膜梭菌、鼠疫耶尔森氏菌基因序列,分别针对ail、hly、cpe、3a基因设计4对引物和4条探针。通过重叠PCR扩增各目的基因并构建重组质粒,以该重组质粒DNA为模板,通过多重PCR同时扩增上述4个基因,建立xMAP液态芯片检测技术,在此基础上对标准菌株基因组DNA进行检测并验证该方法的特异性和敏感性。结果:xMAP液态芯片对质粒DNA和标准菌株基因组DNA的检测结果与多重PCR结果一致。该方法能在3.5 h内同时完成对4种病原菌的检测,特异性好,且敏感性要高于PCR方法,灵敏度最高可达200CFU/ml。结论:xMAP液态芯片技术是病原微生物的多重快速检测的新方法,具有很好的应用价值和前景。     

用于探测从环境中分离出的细菌中特殊基因的DNA探针

DNA 基因探针在研究天然细菌群落中的基因转移和适应机制,以及在实验室中,都将极为有用。该技术能够探测细菌种内的特殊基因顺序,并可用以寻找和监测打算释放到自然环境中的微生物重组体 DNA 克隆。它可能为鉴定特殊生物体提供比传统方法优越的更具体的新型测试法。