iTRAQ结合2D LC-MS/MS技术在草菇不同生长发育时期蛋白质组分析中的应用

【目的】旨在采用iTRAQ标记结合二维液相色谱串联质谱技术对草菇不同生长发育阶段的差异蛋白质组进行研究。【方法】首先将提取的草菇不同生长阶段蛋白样品进行SDS-PAGE分析,其次将经二维液相色谱串联质谱技术获取的串联质谱数据通过MASCOT软件搜库,之后对鉴定蛋白质数据进行了主成分分析(Principal componentanalysis,PCA)、层次聚类(Hierarchy clustering)分析、K-均值(K-means)聚类和GeneOntology(GO)注释分析。【结果】试验结果显示,共计获得2 335个不同肽段,鉴定到1 039个蛋白质,其中1 030个蛋白质具有定量信息。在子实体阶段中显著上调蛋白质64个,下调蛋白质150个。生物信息学分析表明,iTRAQ标记技术结合二维液相色谱串联质谱可对不同生长发育时期的草菇蛋白样品进行有效地分离和鉴定。【结论】这一研究结果为深入研究草菇乃至其他大型担子菌子实体形成和发育的分子机制提供借鉴。     

草菇子实体不同成熟阶段的比较蛋白质组学分析

采用iTRAQ标记结合二维液相色谱串联质谱技术对草菇不同成熟阶段的差异蛋白质组进行研究。首先将提取的草菇不同成熟阶段蛋白样品进行SDS-PAGE分析,其次将经二维液相色谱串联质谱技术获取的串联质谱数据通过MASCOT软件搜库,之后对鉴定蛋白质数据进行了KEGG代谢通路分析。试验共计获得2 335个不同肽段, 鉴定到1 039个蛋白质,其中1 030个蛋白质具有定量信息。与蛋形期相比,在伸长期和成熟期阶段显著上调蛋白质85个,下调蛋白质103个。KEGG代谢通路分析结果显示,草菇不同成熟阶段中的68个差异蛋白质可定位于4种伞菌目模式真菌（灰盖鬼伞、双色蜡蘑、可可丛枝病菌和裂褶菌）的45个不同生物代谢途径,全景展示出草菇成熟阶段差异表达蛋白质定位的代谢网络。结果表明,iTRAQ标记技术结合二维液相色谱串联质谱可对不同生长发育时期的草菇蛋白样品进行有效地分离和鉴定。     

厌氧产氢颗粒污泥蛋白质组分析样品的高效制备方法

【背景】厌氧产氢颗粒污泥比絮状产氢污泥具有更高的生物量、沉降性与反应效率,对颗粒污泥进行蛋白质组学研究,有助于揭示其代谢调控的分子机制,从而对厌氧代谢过程进行优化调控。目前关于产氢颗粒污泥蛋白质组分析样品制备方法的研究尚未见文献报道。革兰氏阳性菌Ethanoligenens harbinense YUAN-3是自凝集产氢发酵细菌,在间歇和连续流培养中可形成自聚集的厌氧颗粒,由于其全基因组信息清楚,可作为模式研究材料对制备方法进行评估。【目的】针对厌氧产氢颗粒污泥的蛋白质组学研究,比较不同蛋白质提取方法进行优化。【方法】分别利用液氮研磨、超声破碎、匀浆破碎对产氢颗粒污泥破碎,比较这3种方法对总蛋白提取量的影响;通过双向电泳比较三氯乙酸(Trichloroacetic acid,TCA)-丙酮沉淀法与苯酚抽提法对总蛋白提取效果的影响;对总蛋白样品分别进行同位素标记相对和绝对定量标记(Isobarictagsforrelativeandabsolutequantification,i TRAQ)、串联质谱标签(Tandemmasstag,TMT)标记以及质谱鉴定。【结果】液氮研磨、超声破碎、匀浆破碎3种破碎方法下总蛋白的提取量分别是对照样品的2.0、3.9与5.2倍。与TCA-丙酮沉淀法相比,苯酚抽提法总蛋白样品在双向电泳图谱上的蛋白质点明显增多,分布均匀,同时其在碱性蛋白端与小分子量蛋白端的蛋白质点也明显增多。质谱分析发现,iTRAQ标记样品与TMT标记样品中分别鉴定到1797个与1644个蛋白,在分子量、等电点、亚细胞定位的各个分布范围内,这些蛋白良好地覆盖了E.harbinenseYUAN-3中各个类型的蛋白。【结论】匀浆破碎与苯酚抽提法联用的总蛋白制备方法更适用于厌氧产氢颗粒污泥,该方法有利于后续的蛋白质双向电泳和定量蛋白质组质谱分析,可作为产氢颗粒污泥以及革兰氏阳性菌总蛋白制备的方法参考。     

利用TMT标记结合2DLC-MS/MS技术对水牛卵母细胞体外成熟前后差异蛋白质组的分析

本试验利用TMT标记并结合二维高效液相色谱/串联质谱联用的研究策略对水牛卵母细胞成熟前后差异蛋白质组进行分析。试验首先收集水牛成熟前卵母细胞和成熟后卵母细胞,分别提取卵母细胞这两个时期的蛋白质,酶解蛋白后进行TMT标记,其中TMT-126标记成熟后的肽段,TMT-129标记成熟前的肽段,标记后采用强阳离子交换柱对酶解得到的肽段进行分离,接着进行nano LC分离,质谱分析采用在线连接电喷雾串联Orbitrap的方法,最后使用SEQUEST软件进行数据库搜索,采用生物信息学方法对鉴定得到的差异蛋白质进行初步分析。根据定量差异倍数≥2即认为蛋白表达存在差异,鉴定出卵母细胞成熟前高表达的蛋白有18种,成熟后高表达的蛋白有26种。对这些差异蛋白进行生物信息学分析表明,利用TMT标记并结合二维高效液相色谱/串联质谱联用的研究策略可以有效地分离和鉴定水牛卵母细胞成熟前后的蛋白质。本试验发现可能与水牛卵母细胞成熟相关的标志性蛋白:调控细胞凋亡蛋白(BCL2L10)、胎球蛋白(AHSG)、伴侣蛋白(Erp29),这可能为今后研究水牛卵母细胞成熟前后的蛋白质表达变化规律提供了试验依据。     

iTRAQ技术在真菌研究中的应用进展

iTRAQ技术是一种新的、功能强大的、可以最多同时比较8种不同样品中蛋白质相对或绝对含量的蛋白质组学方法,结合多维液相色谱和串联质谱分析,iTRAQ技术已成为差异蛋白质组学定量研究的主要工具之一。而真菌的致病作用是多种蛋白质共同参与的真菌?宿主相互作用的复杂过程,因此整体、定量地分析真菌致病过程中的差异表达蛋白质谱,对于研究真菌的致病机制具有重要作用。该文重点就iTRAQ技术在真菌研究中的应用进展进行综述。     

iTRAQ标记技术与差异蛋白质组学的生物标志物研究

结合多维液相色谱和串联质谱分析,iTRAQ技术已成为差异蛋白质组学定量研究的主要工具之一。而寻找和发现区别于正常生理状态下的疾病特异表达蛋白质,有利于阐明疾病的发病机理,对疾病的预防、诊断、预后和疗效监测具有重要作用,并有助于用作新靶点来开发临床治疗药物。本文重点就该技术在医学领域中进行差异蛋白质组分析并寻找标记蛋白质的研究进行综述。     

液质联用多反应监测法定量目标多肽或蛋白质

为建立优化的血浆内源性多肽提取方法,并且构建目标多肽和蛋白质的质谱定量方 法,本研究考察了超滤法、有机溶剂沉淀法和固相萃取法对血浆内源性多肽的提取效果 ,并通过Tricine-SDS-PAGE对提取效果进行比较.通过液相色谱串联质谱多反应监测 （MRM）分析,建立了多肽标准品ESAT-6定量方法,并将ESAT-6定量建立的液相色谱和质谱条件应用于蛋白质的定量,对多肽和蛋白质MRM定量的标准曲线进行了考 察.Tricine-SDS-PAGE结果表明,乙腈沉淀法是最佳的血浆内源性多肽提取方法,低分子量的多肽可以得到很好的富集,且能有效地去除高分子蛋白质的污染.液相色谱串联 质谱MRM法检测血浆内提取的多肽,标准曲线的线性较好,相关系数为0.999.另外,采 用MRM法对胶内分离的蛋白质进行定量,标准曲线的线性相关系数为0.995.综上所述, 本研究构建了一种简单有效的血浆多肽提取方法,通过液质联用MRM法成功地实现了目标多肽和蛋白质定量测定.该定量方法可以推广应用于复杂样品中的多肽和蛋白质的定 量分析.     

一种适合针刺活检样品的蛋白质组学分析方法

针刺活检样品是一种重要的临床组织样品,其蕴涵的蛋白质信息,对了解人类疾病极为重要.然而,由于该样品的体积极小,其研究受到很大限制.本文建立和优化了适合针刺活检样品的基于双向电泳的蛋白质组学分析平台：通过直接抽提获得针刺活检组织的蛋白质样品;用24 cm 固定梯度干胶条(pH 3-10NL)等电聚焦及12.5% SDS-PAGE分离获得蛋白质样品;感兴趣的蛋白质点经过胰酶酶解后用MALDI TOF/TOF质谱分析.运用所建立的平台对3例来自3只不同大鼠的肝脏针刺活检样品进行分析,获得了多于2500个蛋白质点的高重复性的二维凝胶银染图谱.应用该方法分析人前列腺针刺活检样品的蛋白质组,同样获得了高质量、高重复性的结果.其中随机选取的包括低丰度点在内的57个蛋白质点,经胰酶酶解后进行MALDI串联质谱分析,均获得了高确定性的鉴定结果.通过建立针刺活检样品的蛋白质组学分析方法,为研究人类疾病的分子机制提供了必要的前提保障.     

串联质谱数据的从头解析与蛋白质的数据库搜索鉴定

蛋白质的鉴定是蛋白质组学研究中必不可少的一步。用串联质谱 (tandemmassspectrometry ,MS/MS)可以进行多肽的从头测序 (denovosequencing) ,并搜索数据库以鉴定蛋白质。用图论以及真实谱 理论谱联配 (alignment)的方法对串联质谱得到的多肽图谱进行从头解析 ,得到了可靠的多肽序列 ,并应用到数据库搜索中鉴定了相应的蛋白质。同时 ,还用统计的方法对SwissProt以及TrEMBL蛋白质数据库进行了详细的分析。结果表明 ,3个四肽或者 2个五肽或者 1个八肽一般可以唯一地确定一个蛋白质     

蛋白质组学研究中的无标记定量方法

蛋白质定量是探索疾病发生发展状况和寻找新药靶标的重要手段.该领域最常用的技术是比较染色后的二维凝胶上蛋白点的光密度值或综合同位素标记后的质谱峰强度方法.但此二者的样品处理方法都比较麻烦,不利于进行大规模蛋白质组的定量研究.最近几年出现了利用质谱数据进行无标记定量的方法, 根据数据类型这些方法可以分为2类：基于鉴定蛋白的肽段数的方法和基于质谱峰强度的方法,在高通量大规模蛋白组定量研究中有很大优势.本综述主要介绍了这2类无标记定量方法的模型及优缺点,并比较了2类方法的灵敏度和准确度.肽段计数方法在检测蛋白丰度变化时更灵敏,而峰面积强度在评估蛋白比率时更准确.