马铃薯种薯生产的研究III．马铃薯Y病毒抗血清制备和诊断方法

用0.1 M Tris-Hcl(内含0.05M EDTA)或0．5M PB作提取液,以含0．5M,尿素的0.01 M PB回溶病毒沉淀,以防止病毒凝聚。通过PEG沉淀和反复两次差速离心,提取了由马铃薯“男爵”分离的阿Y分离物。电镜照片表明为形态均一的弯曲眭线状粒体。产量约为2毫克／100克鲜鼋叶片。以PVY—I抗原免疫家兔,用Frd全佐剂进行肌肉注射的方法,制备出PvY-I抗血清,其妓价在2560—5l 20。抗血清和PVx、rMV分离物,以及正常烟草叶片汁液无明显反应。应用PVY_I抗血清冻干剂,用微量凝聚和微量沉淀的方法鉴定马铃薯幼芽和感Y痫毒叶片汁液中的Y病毒,表明具有一定可靠性。由制备的抗血清提取免疫球蛋白致敏乳胶,可测出提纯的PvY抗原最低含量为L．52—2．2微克／毫升,可测出感染烟草叶片汁液的最高稀释度为I：100。制备的抗血清冻干粉和微量凝聚的血清学方法已用于1978和l 979年内蒙古自冶区乌盟后旗无病毒原种场的种薯田间鉴定。     

用IgG指示试纸同时检测多种马铃薯病毒病

用硝基纤维素膜(NCM)为载体制备的抗体IgG指示试纸,可同时检测马铃薯X病毒(PVX)、马铃薯Y病毒(PVY)、马铃薯S病毒(PVS)和马铃薯卷叶病毒(PLRV)的感染。以pH10.0的1％甘氨酸溶液为PVX、PVY和PVS的研磨缓冲液,比已报道的缓冲液效果好。在提取病毒抗原时加入4％纤维素酶,可提高病毒得率及所制备的抗血清灵敏度。     

四种广普性植物病毒高效mPCR检测方法的建立

本研究建立了能同时检测出烟草花叶病毒(TMV)、黄瓜花叶病毒(CMV)、马铃薯X病毒(PVX)和马铃薯Y病毒(PVY)的多重RT-PCR体系。TMV、CMV、PVX、PVY是四种广普性植物病毒,寄主范围广泛,并且常常发生复合侵染。本研究以上述四种病毒的CP基因部分序列设计引物,以反转录的cDNA为模板,建立多重RT-PCR反应体系,分别扩增出211～417bp的不同长度的基因片断,并通过序列测定来确认扩增序列的特异性。将反转录合成的cDNA进行浓度稀释,来对多重RT-PCR与单重RT-PCR的灵敏度进行比较,结果证明,多重RT-PCR体系能够同时快速检测这四种病毒,并且有很高的灵敏度。     

检测马铃薯S、X和Y病毒的灵敏度及其改进技术

用5.3M的NaOH:乙醇(EtOH)予处理新的聚苯乙烯微皿,以酶联免疫吸附法在病毒的特异吸光率(A405)处测定马铃薯S、X及Y病毒,其平均数增加14.8%,与对照PBS—T相比,在磷酸盐缓冲液中(PBS—T)加入0.01M二乙基二硫代氨基甲酸酯钠则增加了对PVY的特异吸光率37.3%。用0.2M二乙醇胺pH10.5和6～12%亚硫酸钠对PVX进行碱性降解后,比单用PBS—T增加了特异的对PVX的吸光率约2.06%。从logA405和log汁液的稀度之间的相关回归分析得出进一步增强灵敏度的特性。由回归方程来予测病毒的稀释限点,用未稀释的被侵染汁液测定相应增加的病毒特异光吸收值。一个改进的双抗体夹心酶联免疫吸附测定法,提高检测PVS稀释终点约达30～32%,这一数值比曾在其它植物病毒上报道过的要少。血清学测定在植物病理学上的一个主要应用方面,是对马铃薯病毒的大量测定。即检疫证明和抗病育种的鉴定两个方面。酶联免疫吸附测定(ELISA)是测定病毒最灵敏有效的方法之一,它可能对某些植物病毒的检测效率达1μg/ml。本研究的目的是测定和评价改进马铃薯S、X及Y病毒的ELISA灵敏性方法的效果。这些改进方法包括,用於清洗聚苯乙烯微皿以便用作ELISA的洗剂,病毒提取缓冲液的添加剂,以及一个双抗体夹心ELISA(DASELISA)的改进方法。     

脱毒马铃薯与工程马铃薯

马铃薯是仅次于水稻、小麦、玉米的第四大粮食作物,又是粮菜兼用作物及重要工业原料。中国种植面积4000万亩以上,居世界第一位。马铃薯产量高,营养丰富,其蛋白质含量超过玉米、小麦、豌豆等。但因病毒侵染引起马铃薯严重减产与种质退化,薯块逐年变小、产量逐年降低,使我国马铃薯单产远远落后于国际先进水平。在农业生产上马铃薯Y病毒(PVY)、马铃薯X病毒(PVX)、马铃薯卷叶病毒(PLRV)等的侵染造成极大危害,它们的复合侵染后果更加严重,可导致减产80％以上。 病毒是引起马铃薯退化的主要原因,高温等不良条件使退化加速,而病毒危害程度又与栽培条件和管理技术密切相关。解决退化最根     

马铃薯单双三价抗病毒基因表达载体的构建

马铃薯Y病毒(PVY)、X病毒(PVX)和卷叶病毒(PLRV)引起的病害是造成我国马铃薯退化的主要原因,严重危害我国的马铃薯生产。PVY和PVX或PVY和PLRV混合侵染带来的损失远远大于各病毒单独侵染。国外科学家通过在马铃薯植株体内表达病毒外壳蛋白(CP)基因来减缓病毒病害的发生已取得相当的成功。 我们从河北省坝上地区农科所试验田中采集PLRV感病材料Burbank及87-1,参照文献提取病毒RNA并以其为模板,反转录合成cDNA。根据PLRV澳大利亚分离物已发表的序列,设计并     

马铃薯Y病毒蚜传辅助因子促进马铃薯X病毒长距离运输

采用PCR和定点突变法,对马铃薯Y病毒中国株系（Chyinese strain of potato Ypotyvirus,PVY-C)蚜传辅助成分（helper component proteinase,HC-Pro)基因中心区域的CCCT基序和PTK基序进行定点改造,获得了4种突变体。然后将突变体砍降到植物表达载体pBin438中,所得到的重组体通过根癌土壤杆菌（Agrobacterium tumefaciens(Smith et Townsend)Conn）介导法转了烟草（Nicotiana tabacum L.cv.K326).Southern blotting和Western blotting分析表明4种突变体已经成功整合到烟草的基因组中,并在蛋白水平上得到了表达。马铃薯X病毒（potato X potexvirus,PVX)对转基因烟草的攻毒实验表明,4种突变体均使PVY－C HYC－Prog严重丧失了促进PVX病毒粒子在寄主体内积累和提高PVX致病性的功能,说明CCCT、PTK基序为PVY－C HYC－Pro介导PVX／PVY协生作用所必需。同时证明了HC-Pro具有增强PVX在寄主体内长距离运输的功能。     

分泌抗马铃薯Y病毒单克隆抗体的大鼠杂交瘤细胞系的建立及抗体稳定性测定

用大鼠的骨髓瘤细胞系(1R983)与经马铃薯Y病毒(PVY)免疫的大鼠(LOU／c)脾细胞融合,建立了3类分泌抗该病毒株系特异性单克降抗体(McAB)的杂交瘤细胞系。其一对 PVYn具有特异性反应,其二对PVYo。具有特异性反应;其三对PVY n和PVYn。均产生反应。经用ELIAA双抗体夹心法和ELlsA间接法检测,上述(McAb)同TMv、CMV、TEV,AMV、 TuMV、PLRV,PVX七种植物病毒均不产生交叉反应。对上述杂交瘸纲胞系和McAb的生 物学特性及理化特性进行了鉴定。     

马铃薯X病毒湖南分离物的鉴定与分组研究

从湖南石门采集表现重花叶症状的马铃薯叶片中分离纯化到一株线状病毒HN021。经双链RNA(ds—RNA)抽提、寄主反应测定、病毒粒子和内含体的形状观察,初步确定该病毒为马铃薯X病毒(Potato virus X)。以ds—RNA作为模板,用相应引物对HN021分离物的ORF4-UTR-ORF5片段进行RT—PCRP得到1kb左右的双链cDNA片段。对该片段进行克隆和测序,并将测序所得的核苷酸序列与Genbank(登录的11株不同分离物的相应片段的核苷酸序列进行同源性比较和分析。结果表明,HN021与分离自南美洲的三株分离物(COAT,KPA和HB)的同源性为78．4％—79．4％,与其它8株(分离自亚洲、欧洲、大洋洲和北美洲)分离物的同源性为96．4％—97．8％。从氨基酸水平比较,HN021与COAT,KPA和HB三者CP和8kDa蛋白氨基酸序列同源性分别为86．5％—89．0％和74．3％—75．7％,相应地与其它8株分离物的同源性分别为97．1％—98．7％和97．1％—100％。序列分析的结果证实了HN021分离物为马铃薯X病毒,同时表明PVX明显存在两个组(组Ⅰ和组Ⅱ),HN021和其它来自亚洲、欧洲、大洋洲、北美洲分离物的组Ⅱ,3个南美洲分离物属于组Ⅰ。     

应用~3H-胸腺嘧啶核苷测定血淋巴细胞转化的方法

本文介绍了应用微量血液测定DNA合成的方法:0.1毫升肝素抗凝血液灌入3毫升含PHA的Fagle’s生长培养液中,培养54小时后注入~3H-TdR 0.6微居里,再培养16小时,吸弃上清液,沉淀用生理盐水洗涤两次,5％三氯醋酸洗一次。然后沉淀加0.5毫升5％三氯醋酸置90℃水浴15分钟,离心后吸取上清液0.2毫升加到5毫升闪烁液中进行测量。闪烁液配方:PPO 3克,POPOP 0.4萘克、110克、二氧六环1000毫升。10例健康人血平均~3H-TdR掺入率为10.8％。     

应用微量玻片凝胶双扩散技术鉴定马铃薯卷叶病毒

应用常规免疫双扩散不能鉴定马铃薯植株中的卷叶病毒(PLRV)。我们用微量玻片凝胶双扩散技术对马铃薯植株汁液中的PLRV进行了鉴定。试验说明,用这种方法可测出马铃薯茎的汁液最高稀释度为1:4,微量玻片凝胶双扩散与普通免疫双扩散灵敏度的比较试验表明,两者可测出提纯PLRV的最低浓度分别为1μg/ml和6μg/ml,但后者不能测出植物汁液中的PLRV。微量玻片凝胶双扩散是目前能够用于检测感病植物汁液中PLRV的最简便易行和可靠的血清学方法。     

大麦黄矮病毒运动蛋白核定位信号对PVX病毒运动的影响

应用马铃薯X病毒(PVX)载体研究大麦黄矮病毒运动蛋白(BYDV-MP)核定位信号对PVX病毒运动的影响。我们将BYDV-MP克隆到PVX改造载体pGR107中,同时用GFP作为指示蛋白,研究BYDV-MP对异源病毒PVX系统运动的影响。侵染烟草发现BYDV-MP能够在PVX载体中表达并能加强病毒的系统侵染;将PVX编码系统运动蛋白25kD基因进行缺失突变,重复上述试验发现BYDV-MP能够补偿PVX系统运动;将BYDV-MP的N端的第五、六位氨基酸和第七位氨基酸进行替换突变,侵染烟草发现BYDV-MP的N端的第五、六位氨基酸突变不能完全抑制PVX系统运动,但是可以延迟并减弱PVX系统运动;BYDV-MP的N端的第七位氨基酸突变能够完全抑制PVX系统运动。     

双链核糖核酸免疫化学研究 Ⅰ.双链多聚[I]:多聚[C]的抗原性

用国产多聚肌苷酸和多聚胞嘧啶核苷酸(简称多聚[I]:多聚[C])制备成双链核糖核酸特异性抗血清,用环状沉淀和~3H标记的番茄花叶病毒双链核糖核酸测得抗血清效价分别为1:128和1:6400。用免疫琼脂双扩散、对流免疫电泳和放射免疫测定可测定出多聚[I]:多聚[C]的最低浓度分别为391ng、12.2/ng和10pg/ml抗血清和酵母、TMV、PVX 的单链核糖核酸、小牛胸腺DNA不反应。试验证明用国产多聚[I]:多聚[C]制备的抗血清,可有效地用干双链核糖核酸的免疫化学鉴定。由于在免疫双扩散和对流免疫电泳中抗血清能和微量双链核糖核酸反应并产生可见沉淀线,从而有可能利用这两种简便灵敏的方法测定病毒的双链RNA,单链RNA病毒的RF型RNA,以及双链RNA真菌病毒的筛选。     

重组马铃薯X病毒载体介导的烟草γ-微管蛋白基因沉默

用重组马铃薯X病毒(potato virus X,PVX)载体将γ-微管蛋白反义基因导入烟草(Nicotiana tabacum var.Samsun NN),得到了γ-微管蛋白基因沉默的烟草植株。它与侵染PVX空载体的正对照相比有明显的差异:不同形态的叶片分层交替生长;到生殖期所有的花苞都提前脱落;小孢子不能发育到四分体阶段。沉默的形态反应主要起始于顶端幼嫩组织。在沉默过程中除存在基因沉默及恢复现象外还出现靶基因水平的陡然升高,甚至有时会明显反超过正常对照水平。     

依赖于DNA的RNA聚合酶的研究Ⅱ.615小鼠肝细胞核RNA聚合酶A、B、C的提取、分离和鉴定

本文报道了从615小鼠肝细胞核提取和分离A、B、C三种RNA聚合酶的方法。在80mM硫酸铵离子浓度下,B酶能选择性地吸附在DEAE-纤维素DE52上,从而和A、C酶分开,用500mM硫酸铵洗脱,呈现单一的峰。在50mM硫酸铵离子浓度下,将A、C酶吸附在DEAE-SephadexA25上,经50-500mM硫酸铵线性梯度洗脱,得到A酶和c酶两个峰。测定了这三种酶对α-鹅膏蕈碱的敏感性。A酶是抗α-鹅膏蕈碱的(在最高浓度为200微克/毫升时,酶活完全不受抑制);B酶在α-鹅膏蕈碱浓度为0.2微克/毫升时,活性受到50％以上的抑制;C酶在α-鹅膏蕈碱浓度为100微克/毫升时,活性受到50％以上的抑制。用提取的B酶免疫母鸡,获得了抗B酶的抗血清,这种抗血清在双向免疫扩散实验中和B酶之间产生沉淀反应,而和A酶或C酶之间不产生沉淀反应。     

利用RNA干涉技术及微束激光转化法培育抗病毒马铃薯

针对马铃薯生产中危害严重、分布广泛并且具有强烈协生作用的马铃薯X病毒和马铃薯Y病毒,开展了抗病毒病的育种研究。采用RT-PCR技术分别克隆了267 bp的编码马铃薯X病毒外壳蛋白(PVX-cp)基因的相对保守区段X和294 bp的编码马铃薯Y病毒外壳蛋白(PVY-cp)基因的相对保守区段Y两个片段,将其按顺序连接,形成融合基因XY,然后分别将融合基因XY正向和反向插入到载体pHANN IBAL中,得到了载体pH IV,再用NoⅠt对pH IV进行酶切,将产生的大片段插入到载体pART27中,得到同时以PVX-cp基因和PVY-cp基因为靶标的XY的RNA i载体pAR IV。采用微束激光穿刺转化技术转化马铃薯品种Favorita的愈伤组织,得到了14株表型正常的转基因植株,转基因植株的southern b lot分析表明,导入的外源融合基因拷贝数介于2~4之间。攻毒实验表明,其中11株转基因植株对PVX、PVYo以及PVX和PVYo混合侵染均表现免疫,而其它3株的病毒浓度也低于对照。这一结果将为利用RNA i干涉技术开展植物抗多种病毒病的育种提供重要依据,验证了所构建的RNA干涉(RNA interference RNA i)载体具有良好的功能,同时又一次证明微束激光穿刺法是一种有效的遗传转化手段。     

大腸桿菌K12的甲硫氨酸缺陷型在微生物测定中的应用

通过紫外线照射和青霉素处理,从E．Coli K12中获得了一个甲硫氨酸营养缺陷型M-1—10。作为生物测定的材料,这一突变型的特点是遗传性稳定,营养要求专一,特别是对于稚生素B12没有反应。甲硫氨酸的测定范围为1—40γ／5毫升,杯碟法的测定范围为20—80微克／毫升。定量测定的误差都在±5％范围以内。     

马铃薯X病毒湖南分离物的鉴定与分组研究

从湖南石门采集表现重花叶症状的马铃薯叶片中分离纯化到一株线状病毒HN021.经双链RNA(ds-RNA)抽提、寄主反应测定、病毒粒子和内含体的形状观察, 初步确定该病毒为马铃薯X病毒 (Potato virus X).以ds-RNA作为模板,用相应引物对HN021分离物的ORF4-UTR-ORF5片段进行RT-PCR,得到1kb左右的双链cDNA片段.对该片段进行克隆和测序,并将测序所得的核苷酸序列与Genbank登录的11株不同分离物的相应片段的核苷酸序列进行同源性比较和分析.结果表明,HN021与分离自南美洲的三株分离物(COAT,KPA和HB)的同源性为78.4%~79.4%,与其它8株(分离自亚洲、欧洲、大洋州和北美洲)分离物的同源性为96.4%-97.8%.从氨基酸水平比较,HN021与COAT,KPA和HB三者CP和8kDa蛋白氨基酸序列同源性分别为86.5%~89.0%和74.3%~75.7%,相应地与其它8株分离物的同源性分别为97.1%-98.7% 和97.1%-100%.序列分析的结果证实了HN021分离物为马铃薯X病毒,同时表明PVX明显存在两个组(组Ⅰ和组Ⅱ),HN021和其它来自亚洲、欧洲、大洋州、北美洲分离物的组II,3个南美洲分离物属于组I.     

马铃薯卷叶病毒单克隆抗体的制备

采用杂交瘤技术,以马铃薯卷叶病毒(Potato Leafroll Virns,PLRV)为抗原,用直接将病毒注入脾脏和随后尾静脉注射的方法,免疫BALB/C小鼠。将免疫小鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合。用Dot-ELISA和间接血凝试验筛选分泌抗马铃薯卷叶病毒抗体的阳性克隆,建立了分泌抗PLRV单克隆抗体的杂交瘤细胞株。用微量玻片双扩散法测定单克隆抗体亚类为IgG_1和IgG2a,轻链为λ。注射杂交瘤细胞株A_1、A_3、C_3和D_3于小鼠腹腔,制备出含高效价单克隆抗体的腹水。用获得的四种单克隆抗体对马铃薯卷叶病毒15个分离物进行了鉴定。     

用琼脂双扩散法检测马铃薯卷叶病毒(PLRV)

马铃薯卷叶病毒(PLRV)早已在1916年发现,但由于植株体内病毒的浓度极低,提纯十分困难,使得血清学检测的研究进展很慢。1974年日本Murayama等首次制备了高效价的抗血清,也仅能与提纯的病毒制剂起反应。以后瑞士GugerIi、荷兰Maat等、美国Clarke和Hepp等以及张鹤龄等虽也相继制备出抗血清,但均不能用琼脂双扩散法进行检测,必须将病毒进行提纯或半提纯后才能见到反应沉淀线,使得这种