皮质酮快速激活PC12细胞中p38丝列原激活的蛋白激酶

实验旨在研究糖皮质激素快速、非基因组作用的细胞内信号传导机制。Western分析研究结果表明,皮质酮可快速激活PC12细胞中p38丝列原激活的蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase,MAPK）,时间、浓度曲线均为钟形,最大激活为10^-9mol/L和15min。糖皮质激素受体阻断剂RU38486不能阻断此作用,而小牛血清白蛋白耦联的皮质酮也能快速激活p38。受体酪氨酸激酶阻断剂genistein对此作用无影响,表明此快速作用不涉及受体酪氨酸激酶活性。此作用能被蛋白激酶C（protein kinase C,PKC）激动剂PMA模拟,而被PKC阻断剂Goe6976所阻断。结果表明,皮质酮可能通过推测的膜受体以PKC依赖的方式快速激活p38 MAPK。     

皮质酮对高钾诱导PC12细胞内钙升高的非基因组调节作用

目的：分析皮质酮快速抑制高钾诱导PC12细胞内钙升高的机制。方法：使用荧光影像系统,实时检测细胞内钙变化。结果：①在预处理PC12细胞5min后,皮质酮可呈量－效关系抑制高钾诱导的PC12细胞内钙升高。②牛血清白蛋白耦联的皮质酮（B－BSA）可模拟皮质酮快速抑制高钾诱导PC12细胞内钙升高的作用,并呈现量－效关系。③糖皮质激素的细胞内受体拮抗剂RU38486对皮质酮快速抑制效应无明显拮抗作用。④蛋白合成抑制剂放线菌酮预处理细胞3h后,皮质酮对高钾诱导PC12内钙升高仍有较强抑制作用。结论：①皮质酮的作用点位于细胞膜上。②皮质酮的快速作用不直接依赖细胞内蛋白合成和不依赖细胞内糖皮质激素受体。③皮质酮对高钾诱导PC12内钙升高的快速抑制作用属非基因组作用。     

皮质酮诱导的PC12细胞梯度应激损伤模型的构建及评价

目的:建立皮质酮诱导的PC12细胞梯度应激损伤模型,为细胞应激水平的评估和细胞应激损伤调控研究提供实验基础和对象。方法:通过检测不同浓度皮质酮(0～1 000μmol/L)在经过不同干预时间(8～48 h)后PC12细胞活力,观察皮质酮对细胞活力的影响,筛选最佳干预条件的细胞模型。分光光度法和微量法检测细胞模型的关键应激指标(MDA、SOD、NADH、LDH),对模型进行评价。结果:当皮质酮浓度在200μmol/L以下且干预时间为12 h时,细胞活力在半数失活率以下,可减少各组由于细胞活力下降而产生的混杂因素。与空白对照组比较,皮质酮浓度依赖性地升高模型组的MDA、NADH和LDH水平,降低SOD水平(P<0.01),符合梯度应激模型的构建要求。结论:成功建立了PC12细胞梯度应激损伤模型,在干预时间为12 h的情况下,干预浓度为0μmol/L、25μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、150μmol/L、200μmol/L,使得细胞模型应激损伤程度梯度增加,可作为开展细胞应激损伤评估及调控实验的基础和对象。     

新霉素抑制PC12细胞烟碱受体介导的反应

新霉素是一种氨基甙类抗生素,在细胞水平可以抑制磷脂酶C介质的信号转导系统,本研究采用全细胞膜片钳技术,以大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞（PC12)为标本,观察了新霉素参考书国酰胆碱诱发电流（IACh)的影响,药理学鉴定表明,PC12细胞上的IACh是通过ACh激动烟碱受体引起的,钳制电压为－80mV时,ACh(30umol/L)诱发一内向电流;细胞外同时给予新霉素（0．01－1mmol/L)和ACh(30μmol/L)可显著抑制IACh峰值,此抑制作用迅速,可逆,呈浓度依赖性,用新霉素预处理细胞3－8min不影响其对IACh的抑制作用,用外源性蛋白激酶C（PKC）激剂激活PKC,同样可抑制IACh,而细胞内透析PKC抑制剂（PKCI19-31,0.1-5μmol/L）不影响新霉素对IACh的抑制作用,以上结果提示,新霉对PC12细胞的IACh的有抑制作用,这是一种与磷脂酶C阻断无关的药理学效应。     

木豆叶醇提物对皮质酮诱导的PC12细胞损伤的保护作用

建立皮质酮诱导的PC12细胞损伤模型并观察木豆叶醇提物及不同组分对皮质酮损伤PC12细胞的保护作用.以100μ mol/L的皮质酮诱导PC12细胞损伤;损伤后的PC12细胞与木豆叶醇提物及不同组分孵育24h,通过形态学观察、MTT检测、LDH测定,研究各组分对皮质酮损伤PC12细胞的保护作用.结果表明,PC12细胞与皮质酮孵育48 h后细胞存活率明显降低,而LDH水平显著升高.而加入木豆叶醇提物及各组分时上述效果明显减轻,且存在明显的剂量依赖关系.从以上结果可知,木豆叶醇提物及不同组分对皮质酮损伤的PC12细胞均有保护作用,且醇提物的效果最好.     

神经生长因子分化后的PC12 细胞对乙酰胆碱的敏感性及其特性

目的和方法：采用全细胞膜片钳技术观察神经生长因子（NGF）分化后的PC12细胞对乙酰胆碱（ACh)的敏感性,并对ACh诱发电流（IACh)的特性进行分析。结果：NGF处理后的PC12乐仅形态上向交感神经元分化,而且具有电学兴奋性,它对ACh敏感性比未分化前显著提高。药理学鉴定表明PC12上的IACh是由烟碱受体（nAChR)引起的,具有明显的失敏特性。宏观IACh呈内向整流和浓度依赖性。结论：PC12细胞培养方便,同源性好,加入NGF后向交感神经元分化,且其具有神经元烟碱受体,可以作为交感神经元烟碱受体研究的很好的模型系统。     

多巴胺对PC12细胞的双重影响

本实验运用PC12细胞,研究不同浓度多巴胺(dopamine,DA)对细胞的影响。同时利用兼具促进多巴胺释放和抑制多巴胺摄取双重作用的安非它命(amphetamine,AMP)观察胞内外多巴胺对细胞的不同作用。结果显示:胞外高浓度DA能引起细胞抗氧化能力下降,胞内游离Ca~(2+)浓度上升,细胞存活率大幅度降低,部分细胞出现凋亡;低浓度DA对细胞存活率无明显影响,而使细胞抗氧化能力有一定提高。长时间安非它命单独作用也可引起细胞存活率下降,并伴随胞内GSH水平降低;安非它命与多巴胺共同作用在一定程度上可导致细胞内抗氧化物质水平低于多巴胺单独作用,表明细胞内一定浓度DA可以维持或提高细胞抗氧化物质水平。结果提示,脑内同样存在的多巴胺神经元对DA重摄取功能下降,胞外氧化应激增强,可能是引起脑内多巴胺神经元退行性病变的重要原因之一。     

低频脉冲电场对PC12细胞突起生长和NGF受体分布的影响

以PC12细胞为实验材料,研究低频脉冲电场(f=50Hz,τ=20ms,Epp=1V／m)对神经细胞突起生长及膜受体聚簇的影响。结果显示,该电场能促进NGF受体的聚簇。电场处理15min使PC12细胞表面的NGF受体发生明显的聚簇,30min组次之,5min组聚簇效果较弱。这表明细胞膜受体可能是电磁场与细胞相互作用的位点之一。运用细胞突起图形处理软件,追踪测定经电场处理后PC12细胞的突起数量和长度,发现该电场能显著促进细胞突起的生长,但对突起数量没有明显的影响。     

NGF诱导PC12细胞分化机制的研究进展

神经生长因子诱导PC12细胞分化是一个复杂的信号调节过程,其中因子和信号传导途径参与,NGF可通过不同信号途径诱导PC12细胞分化。本文在Ras／MAPK途径、PI－3K信号途径及细胞凋期等方面的研究作一叙述。     

糖皮质激素对大鼠肾上腺髓质嗜铬细胞瘤细胞ACh诱发电流的快速抑制作用

本研究采用全细胞膜片箝 技术,以大鼠肾上腺髓质嗜铬细胞瘤细胞为标本,观察了糖皮质激素对乙胆碱诱发电流的快速作用,并初步探讨了其可能机制。     

皮质酮在体外快速抑制精氨酸加压素释放的机制

本实验采用离体孵育脑薄片技术,初步探讨了皮质酮快速抑制大鼠下丘脑薄片释放精氨酸加压素（ＡＶＰ）的机制。结果表明：（１）放线菌素Ｄ（基因转录抑制剂）、嘌呤霉素（蛋白质合成抑制剂）和秋水仙碱（轴浆运输阻滞剂）均不影响皮质酮的快速抑制效应;（２）提高孵育液Ｃａ￣(２＋)浓度,ＡＶＰ释放增加,皮质酮的快速抑制效应明显增强;反之,孵育液中无Ｃａ￣(２＋)则ＡＶＰ释放减少,皮质酮的快速抑制效应也减弱;（３）新霉素（抑制细胞膜磷酸肌醇水解）使皮质酮的快速抑制效应增强。（４）氨茶碱（磷酸二酯酶抑制剂）不影响皮质酮的快速抑制效应。提示,皮质酮对大鼠下丘脑薄片释放ＡＶＰ的快速抑制效应没有通过传统的基因组机制,而由非基因纽机制介导,推测可能是影响Ｃａ￣(２＋)的跨细胞膜流动或／和细胞内Ｃａ￣(２＋)释放的结果。     

神经再生素对PC12细胞分化的影响

目的探索神经再生素(nerve regemration factor．NRF)诱导PCl2细胞神经元性分化的潜在能力。方法以NGF为阳性对照,采用细胞培养方法,观察NRF在低血清的情况下,诱导PCI2细胞发生的形态学改变;同时,使用荧光免疫细胞化学方法,观察神经元标志性物质低分子量神经丝蛋白(NF-L)在NRF诱导分化的PCI2细胞中的表达。采用RT-PCR方法观察NRF对无血清培养的PC12细胞即早基因c—fos的表达变化。结果加药后第14天,NRF、组以及NGF组的PCI2细胞呈现明显的形态学改变：细胞胞体皱缩,且有明显的突起生长。空白对照组、NRI：、组(0．01μg／ml、0.1μg／ml、1μg,／ml)、NGF组(0．05μg／m1)具有明显突起的分化细胞占总细胞的比例分别为5．169％、25．718％、43．325％、73．038％、85．286％。免疫荧光细胞化学结果显示NRF、、NGF组的分化细胞基本都为NF-L标记阳性的细胞;NRF能使c-fos的表达上调,作用2h后达峰值。结论神经再生素具有诱导PCl2细胞的神经元性分化作用,且能使c—fos表达上调。     

甘丙肽对PC12细胞和B104细胞增殖的不同影响

本实验运用PCI2细胞和B104细胞对甘丙肽（GAL）在神经增殖上的作用进行了研究。运用RT-PCR方法检测GAL及其受体在PCI2细胞和B104细胞中的表达：运用MTT法检测GAL及其受体激动剂、拮抗剂对两种细胞增殖的影响。结果显示：PCI2细胞表达所有三种GAL受体（GalRs）．而不表达GAL;B104细胞表达GAL及两种受体GaIR2和GalR3,而不表达GalRl;GAL及其受体激动剂GAL1-11和GAL2-11能够明显地抑制PC12细胞增殖、却会明显促进B104细胞的增殖。这些效应皆可被非特异性GAL受体拮抗剂M35所阻断。结果说明,GAL可以通过其受体影响细胞的增殖．并且不同受体可能介导不同的作用。     

Mg^2＋对豚鼠心室肌细胞ATP敏感钾电流的抑制作用

利用全细胞电压钳方法研究了细胞外高Mg~(2 )对豚鼠心室肌细胞I_(k,ATP)(ATP敏感钾电流)的作用。细胞的I_(k,ATP)是被代谢抑制剂2,4-二硝基酚(DNP)激活的,可被特异性阻断剂优降糖完全阻断。细胞外8mmol/L MgSO_4几乎能完全抑制DNP激活的I_(k,ATP)膜电位0mV水平时抑制率为92±8.6％;4mmol/L MgSO_4可部分抑制I_(k,ATP),抑制率为44±14.6％。Mg~(2 )与ATP联合使用对I_(k,ATP)的作用与Mg~(2 )单独作用无明显差异。结果提示,抑制I_(k,ATP)是Mg~(2 )防止缺氧或缺血状态下心肌细胞动作电位时程缩短的一个重要原因,因而可能也是Mg~(2 )抗缺血性心律失常的重要机制。     

纳米氧化铜对大鼠海马神经元Ik和PC12细胞活性的影响

用全细胞膜片钳方法研究纳米氧化铜(nanoCuO)颗粒对大鼠海马CA1区急性分离神经元延迟整流钾通道电流(Ik)的影响,并用MTT方法研究其对神经生长因子(NGF)诱导分化的PC12细胞活性的影响.结果显示5×10-5g/mL nanoCuO能够显著抑制海马CA1区神经元的Ik,使其失活曲线和对照组相比向左偏移,但对其激活过程无明显影响.MTT方法的实验结果显示不同浓度的nanoCuO(5×10-4、5×10-5、5×10-6g/mL)对NGF诱导分化的PC12细胞均有损伤作用,随着浓度的增加,损伤更加明显,呈量效和时效依赖关系.     

甾体激素对C6细胞摄取甘氨酸的快速作用

目的 :探讨甾体激素对C6细胞摄取甘氨酸快速作用的非基因组织机制。方法 :应用液体闪烁技术 ,通过检测C6细胞在加入了甾体激素和 /或其它试剂后摄入标记甘氨酸量的改变 ,确定甾体激素的作用。结果 :C6细胞高亲合力的甘氨酸依赖于钠离子和氯离子。皮质酮 ,孕酮 ,地塞米松可快速抑制这种摄取 ,雌二醇 ,脱氧皮质酮无显著的抑制作用 ,表明甾体激素作用有特异性。皮质酮的作用在 10 4 -8～ 10 -6 mmol/L范围内效应与浓度成正相关。皮质酮偶联牛血清蛋白后作用依然存在。RU38486 能部分阻断皮质酮的效应。细胞外液钙离子缺乏时皮质酮的作用基本消失。结论 :虽然皮质酮 ,孕酮 ,地塞米松神经胶质细胞和神经元摄取甘氨酸的快速作用不一样 ,但均是非基因组机制。     

L-谷氨酰胺对PC12细胞中grp75的调控作用

条件必需氨基酸谷胺酰胺可上调细胞中热激蛋白（hsp）的表达,为观察谷氨酰胺是否对hsp家族成员grp75的表达具有调控作用,以PC12细胞为模型用免疫组化、蛋白质印迹法和RT—PCR等方法检测谷胺酰胺对grp75基因的表达的影响：并以MTT法观察谷氨酰胺对PC12的细胞和grp75低表达的PC12细胞缺糖损伤的保护作用。结果表明谷氨酰胺可以上调grp75的表达．特别是对缺糖细胞的上调作用更显著;但这种上调作用与谷氨酰胺的作用浓度和作用时间并未显示出有明显的关系。MTT检测显示,谷氨酰胺使细胞在缺糖条件下的存活率明显上升：grp75低表达细胞与未转染的细胞相比这种保护效应明显降低,说明谷氨酰胺通过调节grp75的表达对缺糖损伤起到保护作用。     

L-谷氨酰胺对PC12细胞中grp75的调控作用

条件必需氨基酸谷胺酰胺可上调细胞中热激蛋白(hsp)的表达,为观察谷氨酰胺是否对hsp 家族成员grp75的表达具有调控作用,以PC12细胞为模型用免疫组化、蛋白质印迹法和RT-PCR 等方法检测谷胺酰胺对grp75基因的表达的影响;并以MTT法观察谷氨酰胺对PC12的细胞和grp75低表达的PC12细胞缺糖损伤的保护作用。结果表明谷氨酰胺可以上调grp75的表达,特别是对缺糖细胞的上调作用更显著;但这种上调作用与谷氨酰胺的作用浓度和作用时间并未显示出有明显的关系。MTT检测显示,谷氨酰胺使细胞在缺糖条件下的存活率明显上升;grp75低表达细胞与未转染的细胞相比这种保护效应明显降低,说明谷氨酰胺通过调节grp75的表达对缺糖损伤起到保护作用