鸡GnRH对体外培养的鸡卵泡膜细胞合成甾类激素的作用

在建立鸡卵泡膜细胞体外无血清贴壁培养模型基础上,研究了鸡促性腺激素释放激素（ｃＧｎＲＨⅡ）对鸡卵胞膜细胞合成睾酮（Ｔ）和雌二醇（Ｅ２）的直接作用;以及在绵羊促黄体激素（ｏＬＨ）或促卵泡激素（ｏＦＳＨ）存在时,ｃＧｎＨⅡ对膜细胞合成Ｔ或Ｅ２的影响。实验结果如下：①在培养液中单独加入ｃＧｎＲＨⅡ,能促进Ｆ５、Ｆ３卵泡膜细胞合成Ｔ及Ｅ２,并具有剂量依赖关系;而对于Ｆ１卵泡膜细胞的作用效果不明显。②ｃＧｎＲＨⅡ与ｏＬＨ（５０ｎｇ）共同处理,当ｃＧｎＲＨⅡ低剂量（１００ｇ）时,膜细胞Ｔ合成量明显增加,而加大剂量时,Ｔ合成量则显著降低。③ｃＧｎＲＨⅡ（５００ｎｇ）与ｏＦＳＨ（５０ｎｇ）共同处理对膜细胞Ｅ２的合成有抑制作用,降低ｃＧｎＲＨⅡ的含量,可逐渐恢复ｏＦＳＨ对膜细胞Ｅ２合成的刺激作用。     

顺式CA1P对肿瘤细胞增殖和血管生成的影响

目的:研究顺式考布他汀二磷酸四钠(cis-CA1P)对体外培养肿瘤细胞增殖的作用,以及对鸡胚尿囊膜血管和离体培养的大鼠主动脉环血管生成的影响。方法:通过测定MTT评价药物对体外培养肿瘤细胞的作用;建立培养鸡胚尿囊膜模型、离体培养大鼠动脉环,研究顺式CA1P对血管生成的影响。结果:顺式CA1P对MGC-803人胃癌细胞、U937人急性髓系白血病细胞、A375人黑色素瘤细胞、HCT116人结肠癌细胞、MDA-MB-231人乳腺癌细胞、K562人白血病细胞具有显著的生长抑制作用,且呈明显的浓度依赖性;顺式CA1P呈剂量依赖性抑制鸡胚尿囊膜血管及离体培养的大鼠主动脉环血管生成,并可以抑制血管内皮细胞的运动及血管网络状结构形成。结论:顺式CA1P具有抑制肿瘤细胞增殖和抗血管生成的作用。     

催乳素对大鼠前列腺上皮细胞内雄激素受体和5α－还原酶活性的影响

本实验建立了无血清培养的大鼠前列腺上皮细胞内雄激素受体（ＡＲ）的测定方法,并研究了催乳素（ＰＲＬ）对细胞内ＡＲ数量和５α－还原酶活性的影响。结果表明：ＰＲＬ使前列腺上皮细胞内ＡＲ数量显著增加,其中１０ｎｇ／ｍｌＰＲＬ的作用最强,但高剂量的ＰＲＬ则失去对ＡＲ的刺激作用。ＰＲＬ还能拮抗雄激素引起的其自身受体的下调作用,使受体的数量回升至对照组水平。对５α－还原酶的催化产物双氢睾酮（ＤＨＴ）的测定结果显示ＰＲＬ对ＤＨＴ的产生无明显影响,提示ＰＲＬ对５α－还原酶的活性无显著影响。     

Cct6a对鸡卵泡膜细胞Bcl-2和Caspase-3表达的影响

Cct6a基因编码CCT（chaperonin containing tailless complex polypeptide）的ζ亚基,属Ⅱ型伴侣素,是一种广泛存在于细胞浆中的异型寡聚蛋白,在肌动蛋白、微管蛋白的组装和折叠中发挥着重要的作用. Cct6a在鸡性成熟和卵泡发育中发挥重要作用,然而其在卵泡发育中的分子机制尚不十分清楚. 本研究采用qRT-PCR分析了Cct6a在鸡卵泡细胞中的表达,结果表明,Cct6a在鸡卵泡膜细胞中高表达,并与卵泡体积的增大相关. 利用shRNA对鸡卵泡膜细胞中的Cct6a基因进行了敲低分析,转染48 h后鸡卵泡膜细胞中Bcl-2基因的表达量显著降低（P=0.0429）,Caspase-3基因的表达无变化;过表达Cct6a后的鸡卵泡膜细胞中Bcl-2基因的mRNA表达量有增高趋势,Caspase-3基因的mRNA表达量呈下调趋势. 因此,在鸡卵泡膜细胞中Cct6a影响Bcl-2基因表达,是否Cct6a可影响Caspase-3基因表达尚需进一步实验证明.     

促乳素抑制培养的大鼠颗粒细胞中卵泡素介导的组织纤溶酶原激活因子的表达

本文主要是观察促乳素（ＰＲＬ）是否曩体外培养的大鼠颗粒细胞中,组织纤溶酶原激活因子（ｔＰＡ）和Ｉ型纤溶酶原激活因子抑制因子（ＰＡＩ－Ｉ）基因表达间的协调作用。我们采用了多种方法,例如ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、免疫印迹等,来检测ＰＲＬ对ｔＰＡ和ＰＡＩ－Ｉ基因表达的作用。结果证实：（１）在离体条件下促乳素（ＰＲＬ）能刺激颗粒细胞（ＧＣ）中ＰＡＩ－Ｉ ｍＲＮＡ的合成,而ＦＳＨ无此作用。但ＦＳＨ可与ＰＲＬ协同增加     

催乳素对大鼠前腺上皮细胞内雄激素受体和5a—还原酶活性…

一实验建立了无血清培养的大鼠前列腺上皮细胞内雄激素受体（ＡＲ）的测定方法,并研究究了催乳素（ＰＲＬ０对细胞ＡＲ数量和５ａ－还原酶活性的影响。结果表明：ＰＲＬ使前列腺上皮细胞内ＡＲ数量显著增加,其中１０ｎｇ／ｍｌＰＲＬ的作用最强,但高剂量的ＰＲＬ则失去对ＡＲ的刺激作用。ＰＲＬ还能拮抗雄引起的其自身受体的下调作用,使受体的数量回升至对照组水平。对５ａ－还原酶的催化产物双氢睾酮（ＤＨＴ）的测定结果显示Ｐ     

睫状神经营养因子突变体蛋白的活性研究

为了进一步研究我室应用计算机分子模拟设计并表达纯化的睫状神经营养因子突变体蛋白的生物学活性,分别采用鸡胚背根神经节无血清培养法、TF-1细胞增殖法、正常小鼠减重法对其活性进行研究。结果是突变体蛋白能促进鸡胚背根神经节的生长;促进TF-1细胞增殖,MTT测定法表明突变体蛋白与国际参考品相比,比活不低于2.0×106U/mg;使正常小鼠的体重减轻,摄食量减少,脂肪指数下降,并且体重的减轻与突变体蛋白的给药剂量呈现良好的剂量依赖关系,其ED50为：150.986?g/kg/d。以上实验表明CNTF突变体蛋白具有促神经生长、促TF-1细胞增殖和减重的生物学活性。从而为其进一步的应用和开发提供了线索。     

人绒毛膜癌细胞Jar卵泡抑素基因表达的调控

用逆转录-多聚酶链聚合反应(RT-PCR)方法证实, 表皮生长因子(EGF)可刺激人绒癌细胞株Jar卵泡抑素mRNA的表达, 并呈剂量依赖效应, 最大效应剂量为1.0 nmol/L, 半数有效剂量为0.3 nmol/L.GM-CSF虽然单独对人绒癌细胞株Jar卵泡抑素mRNA表达无任何影响, 但却能显著抑制EGF刺激后的人绒癌细胞株Jar卵泡抑素mRNA的表达,并有剂量依赖关系,最大效应剂量为10 nmol/L, 抑制率达62.3%, 半数有效剂量为3.0 nmol/L.提示胎盘组织卵泡抑素基因除受多种激素调控外, 还受一些生长因子内分泌和旁分泌的调控.     

GRP和VIP对E2诱致的垂体催乳素（PRL）瘤细胞PRL基因转录的影响

实验应用雄性ＳＤ大鼠,皮下埋植内置１０ｍｇ雌二醇硅胶管３个月致体催乳素瘤后,取ＰＲＬ瘤细胞进行外原代培养,并应用原位杂交方法,研究不同剂量的胃泌素释放肽（ｇａｓｔｒｉｎ－ｒｅｌｅａｉｎｇｐｅｐｔｉｄｅ,ＧＲＰ）和血活性肠肽（ｖａｓｏａｃｔｉｖｅｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ,ＶＩＰ）以及Ｅ２对 离体培养的垂体ＰＲＬ瘤细胞ＰＲＬ基因转录的,下,ＧＲＰ,ＶＩＰ分别与ＰＲＬ瘤细胞孵育２４ｈ后     

抗真菌药物影响生殖细胞发育机理的研究

目的：探讨抗真菌药物对促性腺激素诱导的卵母细胞成熟的机理。方法：用小鼠卵母细胞体外培养模型,将小鼠卵母细胞培养在含有次黄嘌呤（ＨＸ,卵母细胞成熟抑制物）的培养注中,观察促卵泡生成素（ＦＳＨ）、两性毒素Ｂ、酮康唑对卵母细胞减数分裂恢复的影响。结果：①ＦＳＨ（１０￣２００ＩＵ／Ｌ）显著刺激卵丘－卵母细胞复合体（ＣＥＯ）克服ＨＸ的抑制而恢复减数分裂,该作用具有剂量依赖性（Ｐ〈０．０５）;②两性霉素Ｂ（０     

合欢皮提取物抑制血管生成作用的研究

本文采用体外细胞培养法和体内鸡胚尿囊绒膜模型、荷瘤模型检测合欢皮提取物抑制人微血管内皮细胞(HMEC-1)的增殖、迁移活性,观察合欢皮提取物的抑制血管生成情况。发现合欢皮提取物能显著抑制HMEC-1的增殖(IC50为30μg/mL)和迁移,并且呈明显的剂量依赖性。在体内同时具有抑制鸡胚尿囊膜和肿瘤组织中血管生成的作用。     

不同培养时间对鸡卵泡颗粒细胞孕酮、雌激素分泌水平及FSHR、LHR基因表达的影响

目的：研究培养不同时间鸡卵泡颗粒细胞孕酮和雌激素的分泌水平,促卵泡素受体（FSHR）和促黄体素受体（LHR）的基因表达水平,推断体外培养时间对颗粒细胞激素分泌及相关受体基因表达的影响。方法：通过细胞体外培养的方法,分别于0 h、24 h、48 h、72 h、96 h收集鸡卵泡颗粒细胞上清液,采用ELISA法测定细胞上清液内的孕酮及雌激素分泌水平,并采用荧光定量PCR技术检测颗粒细胞内FSHR和LHR基因表达情况。结果：在培养初期0 h~48 h孕酮和雌激素分泌量显著降低（P < 0.05）,随着培养时间增加到72 h两种激素的分泌量又开始增加,并达到培养初期水平,培养至96 h细胞内孕酮和雌激素分泌量再次降低;颗粒细胞FSHR和LHR mRNA的表达水平则随着培养时间的增加而降低（P < 0.05）。结论：体外培养的卵泡颗粒细胞内孕酮和雌激素的分泌量随体外培养时间的延长呈先降低后升高的趋势,可能与体外培养细胞的生长状态相关,从整体上看随着培养时间的延长,细胞内孕酮和雌激素的分泌量均降低,可能与两种促性腺激素受体FSHR和LHR基因表达量下降相关。     

未成熟树突状细胞防治移植物抗宿主病的实验研究

目的：观察供者未成熟树突状细胞（imDC）刺激自体T细胞增殖的能力,探讨利用imDC防治移植物抗宿主病（GVHD）临床应用的可行性。方法：Ak健康供者外周血分离单核细胞,采用重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（rhGM-CSF）和白细胞介素（IL）4联合培养4d,诱导其分化成imDC;培养7d,分化成mDC。并通过倒置显微镜和HE染色观察细胞形态、流式细胞仪检测细胞表型。采用MLR方法,构建GVHD发生机制的模型,比较供者imDC和mDC刺激自体T细胞增殖的能力。结果：（1）培养4天后细胞具有典型的imDC特征,CDla、CD83和双抗分别表达为55．79％、64、67％和46、67％,成熟标志CD83表达较低;培养7天后具有典型mDC特征,CDla、CD83和双抗表达分别为61．56％、82．40％和64．12％,成熟标志CD83表达较高。（2）MLR法共孵育72小时后,加入CCK-8检测OD值,imDC组与对照组比较无统计学意义（P〉0．05）,不能刺激自体T细胞增殖（SI〈1．00）;mDC组与对照组、imDC组比较均有显著统计学意义（P〈0．01）,能够刺激自体T细胞增殖（SI〉2．00）。结论：供者imDC能够诱导自体T细胞低反应,有望用来防治GVHD。     

藏红花酸对TGF-β1刺激的人肝星状细胞LX-2信号转导通路的影响

目的:研究藏红花酸(crocetin)对转化生长因子-β1(TGF-β1)刺激的人肝星状细胞LX-2信号转导通路的影响。方法:体外培养LX-2细胞,随机设立空白对照组,模型组,藏红花酸低剂量组,藏红花酸中剂量组,藏红花酸高剂量组,用含10%血清的1640培养液培养48 h,MTT法测各组细胞增殖,蛋白免疫印迹测定各组细胞α-SMA蛋白的表达,实时荧光定量PCR法测各组细胞Smad2、Smad3、Smad7mRNA的表达。结果:与对照组比较,TGF-β1刺激后人肝星状细胞LX-2增殖作用明显,且上调α-SMA蛋白、Smad2mRNA、Smad3mRNA表达,下调Smad7mRNA表达(P0.01)与模型组比较,藏红花酸组均能抑制LX-2细胞增殖,并呈剂量依赖性,高、中剂量组作用明显,能够明显下调α-SMA蛋白、Smad2mRNA、Smad3mRNA表达,上调Smad7mRNA表达,差异具有统计学意义(P0.05)。结论:藏红花酸对TGF-β1刺激的LX-2细胞中Smad7mRNA具有上调作用,对Smad2、Smad3mRNA具有下调作用,其抗肝纤维化作用可能与抑制TGF-β1/Smads信号转导通路有关。     

卵巢血纤维蛋白溶酶原激活物受激素调控

卵巢有多种来源的血纤维蛋白溶酶原激活物(PA)。1985年作者发现颗粒细胞和卵泡膜细胞产生不同类型的 PA。刺激颗粒细胞主要产生组织型 PA(t-PA),卵泡膜细胞主要分泌尿激酶型 PA(u-PA)。颗粒细胞的制备和培养按 Crisp 和 Denys(1975)的修改法;实验给大鼠注射孕马血清促性腺激素(PMSG)后,48小时杀死;分离收集卵泡或卵丘-卵母细胞复合物,以 DME 配方新配的培养基液洗涤。卵细胞的细     

外源促性腺激素处理后鸡产蛋及孵化研究

目的：探讨促卵泡素（FSH）对低产期肉用种母鸡在产蛋数量和孵化的影响,寻求较佳的用于提高低产期母鸡产蛋的激素剂量。方法：本试验采用同种激素不同剂量的处理方式,比较实验组和对照组产蛋量和孵化情况。结果：注射不同剂量的激素对鸡的产蛋有一定的影响,实验组一的平均产蛋数与对照组接近,其它四组均显著低于对照组（P〈0．05）,孵化率与健雏率与对照组无显著差异（P〉0．05）。结论：小荆量激素处理对鸡产蛋量没有太大的影响,但大剂量会引起鸡生殖系统萎缩,激素处理对受精卵孵化及雏鸡生长并无负面影响。     

鸡骨骼肌卫星细胞的分离培养、鉴定及生物学特性研究

采用I型胶原酶和胰蛋白酶二步消化,经体外培养获得鸡骨骼肌卫星细胞,并通过检测肌卫星细胞特异基因的表达进行鉴定。结果表明：二步消化法适用于鸡骨骼肌卫星细胞的分离和获取,此方法分离得到的鸡骨骼肌卫星细胞表达卫星细胞特异的标志基因desmin和Pax7,并具有良好的增殖和分化能力,为鸡骨骼肌细胞增殖、分化和再生机制的研究提供技术平台。      

鸡胚胎原始生殖细胞体外培养

以14-15期鸡胚血液为材料,采用Ficoll密度梯度离心方法,提取鸡胚胎原始生殖细胞(primordial germ cells,PGCs),在无基质细胞和基质细胞上分别进行体外培养。从实验结果可以看出：在含有胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)、鸡血清(chicken serum,CS)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、人胰岛素样生长因子(hIGF-1)、小鼠白血病抑制因子(mLIF)和青,链霉素双抗的M199培养液中培养时,鸡PGCs最多能够存活4天：当采用细胞因子和5天鸡胚胎性腺基质细胞共培养时能存活23代且每代细胞增殖可达近10倍。提纯后的PGCs细胞冻存复苏后,经台盼蓝染色鉴定存活率可达80％左右。     

不同剂量L-酪氨酸（L—TYR）对羊驼黑素细胞增殖及酪氨酸酶mRNA表达的影响

目的：探索不同剂量的L-酪氨酸对羊驼黑素细胞增殖以及酪氨酸酶mRNA表达的影响。方法：体外培养正常羊驼皮肤黑素细胞,显微镜下观察不同剂量的L-酪氨酸（100μmol／L、200μmol／L、300μmol／L、400μmol／L）对羊驼皮肤黑素细胞增殖的影响,利用实时荧光定量PCR技术分析不同剂量L-酪氨酸对酪氨酸酶mRNA的表达量的影响。结果：研究结果显示：在培养的黑素细胞中添加了不同剂量L-酪氨酸3d后,镜检观察,黑素细胞数量相比较空白对照组有所减少,酪氨酸酶mRNA表达量增加且显著高于对照组（P〈0．05）,在200μmol／L时,酪氨酸酶mRNA表达量达到最高峰值。结论：L-酪氨酸能诱导羊驼皮肤黑素细胞酪氨酸酶mRNA表达量增高。     

绵羊卵泡成分对卵母细胞体外减数分裂调控的研究

哺乳动物卵巢中的卵母细胞一直处于减数分裂的停滞状态,卵泡内各成分被认为是产生抑制因子的主要来源。本研究以绵羊卵泡各成分为研究对象,用共培养的方法对卵丘细胞、颗粒细胞、膜细胞在卵母细胞体外减数分裂过程中的作用加以探讨。结果表明：1．卵泡整体及卵泡分泌物在体外可以有效地维持减数分裂停滞,经过24h培养,这两个处理组中,处于GV期的卵母细胞分别为69．6％和49．1％。经抑制处理后的卵母细胞脱离抑制环境后可以继发成熟,MⅡ比率可达88．9％。去掉卵丘细胞的裸卵其减数分裂过程不能被卵泡分泌物有效抑制,24h培养后其GV期比例为17．8％。以上结果说明卵泡中的抑制因子主要是通过卵丘细胞束发挥其调控作用的。2．用颗粒细胞与卵母细胞共培养,结果发现具有颗粒细胞卵丘细胞缝隙连接的卵母细胞(COCGs)在培养24小时后47．4％达到MⅡ,与在不具有细胞连接的总浮颗粒细胞中共培养的卵母细胞之间存在无显差异,无论是紧密连接的颗粒细胞层还是悬浮在培养液中的颗粒细胞都不能有效抑制生发泡破裂(GVBD)的发生,只能将卵母细胞抑制在MⅡ以前的各个时期。以上结果说明颗粒细胞在体外分泌抑制图子的活力大大下降。3．卵泡膜细胞具有分泌抑制成熟分裂因子的能力,与膜细胞层共培养的卵母细胞在8h和24h时,其GV期的比例为34．4％和32．7％,显高于没有膜细胞层的对照组(4．5％和1.1％)。综上所述,绵羊卵泡中的抑制因子不仅来自于颗粒细胞,而且膜细胞也参与了成熟分裂的抑制,这些细胞在体外仍具有分泌抑制因子的能力,只是与体内分泌能力有所不同。