RFX5调控原钙粘蛋白α基因簇的表达

基因的表达调控与基因组在细胞核内的三维空间架构相辅相成,原钙粘蛋白(protocadherin, Pcdh)基因簇在大脑发育中起到关键作用,可以作为研究基因表达调控机制的模式基因。转录因子RFX5 (regulatory factor x 5)是翼螺旋家族(winged HLH family)的成员,其蛋白由寡聚化结构域、DNA结合域、螺旋结构域和激活域组成,在调控免疫系统的主要组织相容性复合物II类(major histocompatibility complex class II, MHC II)的表达中起着至关重要的作用。本研究发现RFX5与CTCF在全基因组上结合的位点有部分重叠,利用CRISPR/Cas9DNA大片段编辑技术,构建了RFX5基因缺失的HEC-1-B细胞系。通过RNA-seq实验,发现RFX5敲除能够显著升高Pcdhα6、Pcdhα12、Pcdhαc2的表达水平。通过ChIP-nexus实验,发现敲除RFX5导致染色质架构蛋白CTCF和cohesin在原钙粘蛋白α基因簇处的结合增加。最后,染色质构象捕获QHR-4C实验发现Pcdhα6、Pcdhα12启动子与远端增强子HS5-1的染色质远距离相互作用增强。上述研究表明RFX5蛋白可能通过调控染色质高级结构影响原钙粘蛋白α基因簇的表达,为未来进一步探索RFX5的功能提供了参考。     

HOXD基因簇内一系列CTCF位点反转揭示绝缘子功能

CTCF (CCCTC-binding factor)是一种重要的染色质架构蛋白,其与绝缘子的方向性结合在哺乳动物基因组三维空间结构形成和维持中起着至关重要的作用。正向–反向相对方向的CTCF结合位点(简称CTCF位点)可以在染色质黏连蛋白(cohesin)的协助下,形成染色质环,介导远距离DNA元件之间的相互作用;而在染色质拓扑结构域边界区域的CTCF位点呈现反向–正向相背方向分布,发挥绝缘子的功能。为进一步研究CTCF介导染色质环的形成与其绝缘功能之间的关系,本研究采用DNA片段编辑方法通过设计成对sgRNA(dual sgRNA)构建了一系列HOXD基因簇区域CTCF位点反转的单细胞克隆。定量高分辨率染色质构象捕获实验显示边界区域CTCF位点反转会改变原有的染色质环方向,通过环挤出模型(loopextrusion)形成新的染色质环,引起染色质拓扑结构域边界漂移至新形成的一对反向–正向CTCF位点处。此外,串联排列的CTCF位点可以通过阻碍反方向渗透的黏连蛋白继续滑动发挥绝缘子的功能。RNA-seq实验发现CTCF位点反转引起的局部基因组空间结构变化会进一步影响基因的表达。上述研究...     

串联反向CTCF位点的系列删除揭示增强子调控HOXD基因簇表达的平衡

三维基因组染色质架构蛋白CTCF(CCCTC-bindingfactor)能够介导增强子与基因启动子的远距离染色质相互作用,也可以结合调控区域的绝缘子发挥增强子绝缘功能,对发育中的基因表达调控具有重要作用。同源框基因家族(Homeoboxgenefamily,Hox)编码一类控制动物发育的关键转录因子,在发育中主要沿胚胎首尾轴(head-to-tail axis)呈时空线性表达。在哺乳动物中,Hox基因分为HoxA、HoxB、HoxC和HoxD四个基因簇,在中枢神经系统、骨骼和四肢发育中发挥重要功能。HoxD基因簇主要调控四肢发育,受位于其两侧调控域内的增强子调节,沿肢体近远轴(proximal-distal axis)呈时空线性表达。在人类基因组中,HOXD基因簇及其两侧的调控区域分布有串联排列的CTCF结合位点(简称CTCF位点),参与9个HOXD基因的表达调控。本研究以HOXD基因簇为模式基因,探究CTCF对发育基因(developmentalgenes)转录调控的影响。利用CRISPRDNA片段编辑技术在人HEK293T细胞中获得一系列的串联反向CTCF位点删除的单细胞克隆株。...     

CTCF在介导三维基因组形成及调控基因表达中的研究进展

真核细胞间期的染色质在细胞核中经过复杂的盘曲折叠,形成高级拓扑结构,这样的染色质结构空间组织对基因表达有重要影响.CTCF(CCCTC-binding factor)作为关键的染色质高级结构架构蛋白,对三维基因组结构的形成起到了重要作用.CTCF还可以与基因组内大量的绝缘子结合,影响染色质远程交互,实现对增强子和基因转...     

染色质架构蛋白CTCF调控UGT1基因簇的表达

尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶(UDP-glucuronosyltransferase,UGT)是一类重要的Ⅱ相药物代谢酶,通过葡萄糖醛酸接合反应代谢大量内外源小分子化合物,对机体维持内部动态平衡具有重要意义。UGT基因突变或表达异常会造成高胆红素血症等多种疾病、影响药物疗效或减弱代谢药物能力,因此探索UGT表达调控机制将会为人类疾病的预防和个体化医疗以及精准医学提供科学依据。脊椎动物UGT分为UGT1和UGT2两个亚家族,UGT1基因簇结构与原钙粘蛋白(protocadherin,Pcdh)、免疫球蛋白或B细胞受体(immunoglobulinor B-cell receptor)、T细胞受体(T-cell receptor)基因簇类似,但与UGT2结构不同,分为可变区和恒定区,可变区包含成串排列的外显子,任意一个外显子都可以被可变剪接到下游同一套恒定区外显子上,形成9种UGT1信使RNA并翻译成不同UGT1葡醛酸转移酶亚型。本实验室前期工作发现,染色质架构蛋白CTCF结合DNA的方向性在染色质三维结构构建中发挥重要作用。基于此,为了进一步解析UGT1复杂基因簇的三维转录调控机制,本研究分析和比较了人和小鼠UGT1基因簇的CTCF结合位点(CTCF binding site, CBS)的方向性分布,发现人和小鼠的UGT1基因簇中CBS分布差异很大。以人肺癌细胞系A549为模型,通过RNAi敲低细胞中CTCF和SMC3(cohesin亚基),证明了CTCF和cohesin蛋白参与调控人UGT1基因簇的转录表达。进一步采用CRISPR介导的DNA片段编辑技术对hCBS1进行了原位反转(insituinversion)和删除,并通过RNA-seq分析技术发现hCBS1删除能够显著降低UGT1A6、UGT1A7和UGT1A9的表达水平,然而hCBS1反转仅仅显著降低UGT1A7的表达水平。上述研究表明hCBS1参与UGT1A6、UGT1A7和UGT1A9的转录调节,是人UGT1基因簇的潜在转录调控元件。本研究为未来进一步探索UGT1基因簇的三维基因转录调控机制提供了实验基础。     

HOXA5对病理性瘢痕成纤维细胞功能的调控机制研究

该课题旨在研究HOXA5对病理性瘢痕成纤维细胞凋亡和细胞行为的影响,以及HOXA5对细胞内p53通路活化的调控作用。取患者增生性瘢痕和瘢痕疙瘩组织,分离培养成纤维细胞。将HOXA5过表达质粒转染细胞,通过CCK-8检测细胞增殖情况,流式细胞仪检测细胞凋亡情况, Transwell检测细胞迁移能力, Western blot检测细胞内α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、黏着斑蛋白(vinculin)以及I、III型前胶原肽的蛋白含量,并构建含成纤维细胞的胶原网架(FPCL)评价细胞收缩能力。进一步通过p53启动子荧光素酶报告基因检测HOXA5对p53通路的激活作用, ChIP PCR检测HOXA5与p53启动子区含ATTA的HOX核心结合序列的结合情况。Western blot检测p53下游靶点p21和MDm2蛋白含量。结果显示,转染了HOXA5过表达质粒的细胞增殖活性下降,迁移、收缩能力减弱,细胞凋亡情况加重,细胞内α-SMA、vinculin以及I、III型前胶原肽的蛋白含量减少。细胞内进一步的机制研究发现, HOXA5过表达可以促进p53启动子荧光素酶报告基因的表达, ChIP PCR检测发现,过表达HOXA5后, p53启动子区富含ATTA的HOX核心结合序列区域结合的HOXA5增多,并且p53下游靶点p21和MDm2蛋白含量显著增加。综上,该实验证实了HOXA5可以激活病理性瘢痕成纤维细胞内p53凋亡通路,并促进细胞凋亡,抑制细胞的增殖、迁移和收缩能力。     

原钙粘蛋白基因簇调控区域中成簇的CTCF结合位点分析

哺乳动物中原钙粘蛋白(Protocadherin, Pcdh)基因簇包含50多个串联排列的基因,这些基因形成3个紧密相连的基因簇(Pcdhα、Pcdhβ和Pcdhγ),所编码的原钙粘蛋白质群在神经元多样性(Neuronal diversity)和单细胞特异性(Single cell identity)以及神经突触信号转导中发挥重要作用。前期的工作已证实转录因子CTCF(CCCTC-binding factor)与CTCF结合位点(CTCF-binding site, CBS)的方向性结合能够决定增强子和启动子环化的方向以及其远距离交互作用的特异性,并进一步在Pcdh基因座(Locus)形成两个(Pcdhα和Pcdhγ)染色质拓扑结构域(CTCF/cohesin- mediated chromatin domain, CCD),而且染色质拓扑结构域对于控制基因表达调控至关重要。本文通过生物信息学方法对比人类和小鼠序列,发现Pcdhβγ染色质拓扑结构域调控区域中的DNase I超敏位点(DNase I hypersensitive sites, HSs)较为保守。染色质免疫沉淀及大规模测序实验(Chromatin immunoprecipitation and massive parallel sequencing, ChIP-Seq)揭示CBS位点在Pcdhβγ调控区域中成簇分布并且具有相同的方向。凝胶电泳迁移实验(Electrophoresis mobility shift assay, EMSA)确定Pcdhβγ调控区域内具体的42 bp CBS位点并且发现一个CTCF峰包含两个CBS位点。在全基因组范围内,运用计算生物学方法分析CTCF和增强子、启动子等调控元件的关系,发现CBS位点在调控元件附近有较多分布,推测CTCF通过介导增强子和启动子的特异性交互作用,在细胞核三维基因组内形成活性转录枢纽调控基因精准表达。     

Cohesin结构及功能研究进展

Cohesin是一类在真核生物进化过程中保守的蛋白复合体,由4个重要亚基相互作用形成环状结构,在细胞分裂过程中参与维持染色体的有序排布。在动物中研究发现cohesin还可以作为分子间的连结器介导绝缘子/增强子–启动子间长距离交互,导致基因表达增强或者抑制,但在植物中关于cohesin在调控基因表达和维持染色体构象方面的研究却相对滞后。本文介绍了cohesin的结构特点和主要组成亚基,对调控cohesin在染色质上动态变化的相关因子进行了总结,并结合近年来植物中cohesin的功能研究和动物中cohesin在三维基因组及转录调控中的重要作用,展望了植物中cohesin在转录调控中的潜在功能。     

有丝分裂诱导基因6(MIG-6)可诱导人成纤维细胞发生提前衰老

年老细胞许多基因表达发生变化,其中有些基因的表达可以诱导成纤维细胞早衰.癌基因诱导的衰老(oncogene-induced senescence,OIS)是由一些连续癌症基因的信号,以阻止细胞增殖造成的反应.有丝分裂诱导基因6(mitogen-inducible gene-6,MIG-6)是一个抑癌基因,是ErbB RTK通路的负调控因子,抑制肿瘤细胞增殖.本文以人胚肺二倍体成纤维细胞为对象,研究MIG-6蛋白在细胞衰老中的作用.通过Western印迹发现,在老年细胞中MIG-6表达升高.利用逆转录病毒载体将MIG-6基因转入年轻的人胚肺二倍体成纤维细胞中,通过Western印迹方法检测是否过表达MIG-6,然后通过SA-β-gal染色检测其阳性率,发现转染MIG-6基因后的成纤维细胞SA-β-gal染色率明显高于对照组,生长缓慢.实验结果证实,MIG-6蛋白可以诱导人二倍体成纤维细胞提前衰老.     

三种细胞系(人胚肺与小儿包皮成纤维及人胃癌细胞)膜表面ConA受体的再分布和侧向扩散的研究

利用荧光染色和荧光漂白后恢复FRAP技术观察人胚肺成纤维细胞,小儿包皮成纤维细胞和人胃腺癌细胞膜表面Con A受体复合物的分布及其侧向运动.结果表明:它们的分布呈均匀连续性,极为相似.但它们的侧向运动速率各异.两种成纤维细胞差异较小,而人胃癌细胞的侧向扩散系数显著地不同于两种成纤维细胞.因此把凝集素受体的分布与运动行为表达结合起来分析,能更好地认识细胞在生长、分化或恶变过程中膜性状的差异性与共性.     

三种细胞系(人胚肺与小儿包皮成纤维及人胃癌细胞)膜表面ConA受体的再分布和侧向扩散的研究

利用荧光染色和荧光漂白后恢复FRAP技术观察人胚肺成纤维细胞,小儿包皮成纤维细胞和人胃腺癌细胞膜表面Con A受体复合物的分布及其侧向运动.结果表明:它们的分布呈均匀连续性,极为相似.但它们的侧向运动速率各异.两种成纤维细胞差异较小,而人胃癌细胞的侧向扩散系数显著地不同于两种成纤维细胞.因此把凝集素受体的分布与运动行为表达结合起来分析,能更好地认识细胞在生长、分化或恶变过程中膜性状的差异性与共性.     

黏着素与基因表达调控

黏着素(cohesin)是一种多亚基蛋白复合体,在进化上相当保守。在真核生物细胞中,黏着素主要功能是将复制产生的姐妹染色单体连接在一起,直到细胞分裂的后期,黏着素亚基Scc1水解最终导致染色单体的分离。但是最近研究表明,黏着素在基因表达、染色质结构变化和发育调节等方面也起着非常重要的作用,并且发现黏着素对基因的调节作用与其对染色体的黏着功能无关。在酵母中,黏着素最初定位于其装载蛋白Scc2的DNA结合位点上,但是在细胞周期的G2期,黏着素聚集于转录汇集区之间进而调控转录终止。在果蝇染色体上,黏着素与装载蛋白Scc2的同源物Nipped-B共定位,其作用是阻抑增强子和启动子的远距离接触。而在哺乳动物中,黏着素与CTCF隔离子蛋白共定位,并以依赖于CTCF的方式调控转录。本文概述了黏着素在不同真核生物染色体上的定位与分布,并对其在基因表达调控中的功能机制及其研究现状进行了重点阐述。     

染色质互作相关转录因子的挖掘及功能分析

染色质互作是真核生物基因组组装的基础,并且在调控真核基因细胞特异性表达中发挥重要作用.染色质互作的发生与特定的蛋白质有关,目前已经发现CTCF (CCCTC binding facor,转录阻抑物)和黏连蛋白与染色质互作相关,然而并不清楚是否还有其他蛋白质参与染色质互作.我们将整合高通量染色体构象捕获(Hi-C)和染色质免疫沉淀-测序(ChIP-seq)数据,在GM12878和K562细胞系中挖掘与染色质互作相关的转录因子,并对发现的转录因子做功能分析.我们在频繁发生互作的染色质位点中发现RUNX3、SPI1等转录因子也可能参与染色质互作.另外,通过FP-growth的数据挖掘方法还发现多个转录因子可能协同作用参与染色质互作.研究结果将为染色质互作相关实验的开展提供先验知识.     

以点杂交方法对人β型血珠蛋白基因的染色质结构与功能进行的研究

我采用点杂交的方法,对人β型血珠蛋白基因簇的染色质结构与基因转录活性之间的关系进行了研究。以对DNase Ⅰ消化的敏感性作为染色质的结构参数,我将β型血珠蛋白基因簇中11个区域之间以及其与不表达基因区(乳糖白蛋白和免疫球蛋白不变区λ轻链基因)的染色结构进行比较。实验的细胞系统为K 562红白血病细胞与人胚皮肤细胞株(HES)。所获得的结果提示,在细胞核内,表达基因的染色质结构疏松,对DNase Ⅰ消化的敏感性远较不表达基因区的为高。此外,本文还对有关点杂交的方法学问题进行了较为详尽的讨论。     

原代培养过程中壳聚糖衍生物对CTCF/YB-1/C-myc和p53蛋白表达的影响

成功建立了人增生性瘢痕细胞和正常皮肤成纤维细胞的原代培养, 并利用热休克蛋白(HSP47)和成纤维细胞特异蛋白(FSP)标记物进行了鉴定。研究发现, 经过壳聚糖衍生物处理, 人增生性瘢痕成纤维细胞和正常皮肤成纤维细胞在培养中均出现了不同类型的蛋白表达。多功能转录因子蛋白(CTCF)在壳聚糖衍生物处理的增生性瘢痕成纤维细胞中出现表达上调; 在聚糖衍生物处理的正常皮肤成纤维细胞中数量无变化。YB-1结合蛋白在经壳聚糖处理的正常皮肤成纤维细胞与人增生性瘢痕细胞中的表达几乎无异, 但在未经壳聚糖处理的细胞中表达不同。C-MYC和P53蛋白在壳聚糖衍生物处理的增生性瘢痕纤维细胞中表达上调, 但在正常皮肤成纤维细胞中, 无论是否经过壳聚糖衍生物处理, 这两种蛋白都没有表达。上述4种蛋白在人增生性瘢痕细胞和正常皮肤成纤维细胞中表现出不同的表达方式, 这种新型壳聚糖衍生物可能在控制人增生性瘢痕细胞和正常皮肤成纤维细胞生长和增殖过程中起着重要作用。这些蛋白因子的表达机制目前还不是完全清楚, 有待于进一步研究。     

敲低CTCF腺病毒表达载体的构建及效果检测

目的:获得敲低效果较好的CCCTC结合因子(CTCF)的RNA干扰腺病毒载体,以便于研究其在肿瘤发生发展中的作用。方法:从已发表文献中获得CTCF敲低靶序列,合成2对含有小发卡结构的寡核苷酸序列,将其进行退火磷酸化后,分别克隆到腺病毒包装载体上;将重组质粒转染人胚肾293A细胞,收获腺病毒;将收获的腺病毒分别感染人胚肾HEK293细胞和靶细胞人肺腺癌细胞A549,通过RT-PCR和Western印迹鉴定相关基因的表达变化。结果与结论:RT-PCR和Western印迹鉴定显示构建的表达CTCF短发夹RNA(shRNA)的腺病毒载体能够有效抑制CTCF转录和蛋白水平,为后续CTCF的生物学功能和机制研究奠定了基础。     

通过系统分析揭示组蛋白修饰模式与转录因子结合之间的关联

转录因子对顺势调控元件的选择性结合,在哺乳动物细胞类型特异的基因表达中扮演重要的角色.这个过程受到染色质表观遗传状态的潜在调控.近期,染色质免疫共沉淀结合测序的研究提供了大量泛基因组水平的数据,阐述转录因子结合以及组蛋白修饰的位点,这为系统地研究转录因子和表观遗传标记之间的空间及调控关系提供了基础.该研究对公共数据库中的染色质免疫共沉淀结合测序数据进行整合分析,涉及5个细胞系中的85种转录因子、9种组蛋白修饰,目的是研究转录因子结合位点与组蛋白修饰模式以及基因表达在泛基因组水平上的关联.作者发现,不同转录因子与组蛋白修饰的共定位模式高度一致,并且组蛋白修饰在距离转录因子结合位点约500碱基对的位置富集.作者还发现,转录因子结合位点的占有率与活性组蛋白修饰的水平和双峰模式正相关,并且启动子区域组蛋白修饰的双峰和共定位模式和基因的高转录水平相一致.组蛋白修饰模式、转录因子结合位点的占有率与基因转录之间的关联暗示了细胞可能利用的基因表达调控机制.     

巨细胞病毒对人胚成纤维细胞骨架的影响及其凋亡诱导作用

人胚成纤维细胞是人巨细胞病毒(human cytomegalovirus,CMV)的容许细胞,CMV可在该细胞内活化复制[1].CMV感染后对细胞骨架及细胞凋亡有何影响尚不明确.国外有学者在透射电镜下观察感染CMV的人胚成纤维细胞,发现其微丝解聚,细胞骨架破坏[2],但结果尚不完善.我们的研究分别从细胞形态学、核酸水平、细胞超微水平等方面观察了感染CMV后的人胚成纤维细胞形态、肌动蛋白基因(β-actin)mRNA以及微丝的变化,并进一步观察了其对细胞凋亡的影响.     

三维基因组染色质构象捕获及其衍生技术

线性染色质经过多重折叠凝缩到真核生物的细胞核中,染色质的三维构象直接决定了真核生物的基因表达,因此染色质可以在局部或远程空间上发生互作调控基因转录。折叠成环状构象的染色质可以借助染色质构象捕获 (Chromosome conformation capture,3C) 技术来研究,基于3C技术扩展的4C/5C/Hi-C从单个位点延伸到全基因组捕捉三维构象,在此基础上,染色质构象核心技术可以与免疫共沉淀、核酸分子杂交、单细胞、基因组测序等技术偶联而产生新的衍生技术和应用,这极大地推动了染色质构象技术在基因时空特异性表达调控上的研究。文中将以3C和Hi-C等三维基因组核心技术为基础,重点介绍染色质构象捕获及其衍生技术的原理和前沿应用。     

重组腺病毒Ad-HGF体外感染成纤维细胞后转染效率及表达的检测

押检测携带人肝细胞生长因子基因的重组腺病毒Ad-HGF在体外对成纤维细胞的感染效率以及感染细胞对目的蛋白的表达。以不同感染复数(m.o.i.)(25,50,100,200)的Ad-GFP感染NIH3T3细胞,48h时用流式细胞仪检测转染效率;以50m.o.i.感染NIH3T3细胞后48h,用ELISA和Western印迹杂交法分别检测感染上清中HGF的表达。分别以50m.o.i.的Ad-GFP和Ad-HGF感染原代培养人瘢痕成纤维细胞,以检测重组腺病毒对原代培养人瘢痕成纤维细胞的转染效率和其对HGF的表达。结果表明,当m.o.i.为50时,重组腺病毒对NIH3T3细胞的转染效率已达95%以上;HGF的表达量可达每2×106细胞249ng;并可检测到HGF蛋白的一特异杂交带。以50m.o.i.的Ad-GFP感染原代培养人瘢痕成纤维细胞,72h时GFP表达达高峰,此时转染效率可高达36.75%。Ad-HGF感染原代培养人瘢痕成纤维细胞后HGF的表达在72h时达高峰,表达量可达每3.3×105细胞66ng。初步认为重组腺病毒可有效地介导HGF基因转染正常或瘢痕成纤维细胞,且感染细胞可有效表达目的蛋白。