小鼠T-bet逆转录病毒载体的构建与功能验证

为在小鼠细胞中表达并研究T-bet功能,首先构建了含有报告基因Thy1.1的小鼠T-bet逆转录病毒载体,并将构建的载体质粒转染病毒包装细胞系包装成重组病毒,再利用重组病毒分别感染NIH-3T3和D9细胞系检测其感染能力。之后,使用该重组病毒感染T-bet敲除小鼠的CD4+T淋巴细胞,流式细胞术检测T-bet及其下游靶基因Ifng的表达情况。经验证,重组的逆转录病毒感染T-bet敲除小鼠T淋巴细胞后可以在细胞中表达T-bet,并进一步引起下游靶基因Ifng的表达上调,证明本研究中外源表达的转录因子T-bet具有正常功能。综上所述,本实验成功构建了含有报告基因的小鼠T-bet重组逆转录病毒载体,为进一步在小鼠细胞中研究T-bet功能奠定了基础。     

组织特异性启动子介导的反义FGF8b RNA对前列腺癌细胞生长增殖能力的影响

利用启动子的组织特异性和治疗基因组织特异表达的特点 ,设计出前列腺癌靶向基因治疗的新方案 .利用DNA重组技术将前列腺组织特异性启动子 (probasin基因启动子 )和在前列腺癌细胞中高表达成纤维细胞生长因子 (FGF) 8b反义cDNA克隆到逆转录病毒载体pSIR中构建成重组体PB 反义FGF8b pSIR .经转染包装细胞PT 6 7后将产生的复制缺陷型逆转录病毒体外感染前列腺癌细胞系PC 3M ,体外检测其生长增殖和侵袭转移能力的变化 .结果表明 ,与对照组相比 ,前列腺癌细胞感染产生反义FGF8bRNA的逆转录病毒后生长速度减慢 ,集落形成能力下降 ,体外侵袭转移能力降低 (P <0 0 1) .体外试验表明 ,前列腺组织特异性启动子介导的反义FGF8bRNA可有效降低前列腺癌细胞的体外生长增殖和转移能力 ,这为体内靶向前列腺癌基因治疗奠定了可靠的基础 .     

高通量筛选孤儿受体和膜结合配体的MACS/FACS方法的建立

本文报道了一种用于分离、筛选孤儿受体和膜结合配体的高通量的表达克隆系统(expression cloning system).该系统是以高效表达的逆转录病毒载体为核心,以高通量的磁力分离法（magnetic cell sorter,MACS）和高精确度分选型流式细胞仪（FACS）相结合的独特的筛选方法.具体方法是将配体通过生物反应对固定在磁粒上 （如biotin/streptavidin, Fc/protein A等）.该磁粒的特点是非常微小,相当一个病毒颗粒.当配体蛋白结合到表达受体的BaF3细胞上时,该细胞将停留在MACS磁场中,从而与非受体表达细胞分开.MACS的优点是效率高,可同时操作上亿细胞.这些细胞是无法直接在分选型流式细胞仪上操作的.当这些阳性细胞增殖后,再次用同一配体染色,用更精确的分选型流式细胞仪分离,直至完全纯化.受体基因将用PCR方法,用载体引物克隆.利用该系统可以从1000 000个细胞中筛选出低至2个表达配体/受体的阳性细胞.为验证该系统的可行性,应用该系统在相应的cDNA文库中筛选到2个已知基因的细胞受体.应用诱饵B7-1从人T淋巴细胞cDNA文库中筛选其功能受体CD28.应用B7-H2作为诱饵,从活化的人T淋巴细胞cDNA文库中筛选到ICOS.最终,从纯化的受体表达细胞中分离出受体的cDNA编码序列.这些结果表明,改进的表达克隆系统适合于大规模分离孤儿受体和膜结合配体,以及在后基因组时代用于研究新蛋白的功能.     

免疫检查点分子在慢性HBV感染中对T细胞功能影响的研究进展

阻断免疫检查点分子的信号通路可以增强免疫系统功能,这在肿瘤治疗中获得了显著效果。乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)慢性感染的原因之一为HBV在体内通过一系列方式来减弱、抑制免疫系统的功能,从而逃避免疫识别和杀伤。HBV可以通过上调病毒特异性T细胞表面的抑制性受体来抑制T细胞活化、增殖和效应。本文总结了HBV导致的人体内T细胞上免疫检查点程序性死亡受体1(Programmed cell death protein 1,PD-1)、细胞毒T淋巴细胞相关抗原4(Cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4,CTLA-4)、T细胞免疫球蛋白黏蛋白3(T-cell immunoglobulin domain and mucin domain-containing molecule-3,Tim-3)、淋巴细胞活化基因3(Lymphocyte-activation gene 3,LAG-3)、T细胞免疫球蛋白和免疫受体酪氨酸抑制基序(T cell immunoglobulin and immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif domain,TIGIT)的异常表达以及它们影响T细胞功能的机制,揭示了免疫检查点在治疗慢性乙肝中的良好应用前景。     

肿瘤细胞混合肽诱导特异性抗肿瘤免疫应答

采用细胞冻融、加热沉淀及酸处理等基本生化技术, 从肿瘤细胞中获取混合 肽; 将热休克蛋白70与肽体外结合, 观察热休克蛋白70-肽复合物对小鼠脾淋巴细胞的激活增殖作用以及增殖的淋巴细胞对瘤细胞的特异性杀伤作用, 并运用流式细胞仪分析增殖的淋巴细胞类型; 分别通过对腹腔和腿部肌肉接种了H22肝癌细胞的BALB/c小鼠进行热休克蛋白70-H22抗原肽复合物免疫注射, 观察小鼠肿瘤的抑制和荷瘤小鼠的生存期情况. 另外, 对免疫的小鼠采血进行肝、肾功能检测. 结果显示, 获取的混合肽中含有肿瘤特异的抗原肽, 其经热休克蛋白提呈后, 体外可刺激淋巴细胞活化增殖, 增殖的淋巴细胞为T淋巴细胞, 对肿瘤细胞有特异性细胞毒效应, 体内对腹水型和实体瘤型肿瘤的生长均可产生显著抑制作用, 同时延长荷瘤小鼠的生存期, 并且这种体内免疫对小鼠肝肾功能不产生影响, 不会引发自身免疫反应.     

利用B细胞培养和RT-PCR技术从我国HIV-1感染者中筛选膜蛋白特异性单克隆抗体的初步研究

本研究通过采集1型人类免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus-1,HIV-1)感染者抗凝全血,分离出外周血单个核细胞,然后用磁珠分选纯化记忆性B细胞和体外活化记忆性B细胞,促使其分泌抗体,用ELISA法识别阳性B细胞克隆,并提取阳性B细胞的RNA,从中扩增抗体重链和轻链基因并克隆到表达载体中,再用携带重链基因的质粒和携带轻链基因的质粒共转染293T细胞,获得HIV-1特异性人单克隆抗体,进行抗体特性的鉴定。结果从1例HIV-1感染者的记忆性B细胞中筛选出了4株HIV-1包膜糖蛋白(Envelope glycoprotein,Env)特异性人单克隆抗体,其中2株具有较好的抗体依赖细胞介导的细胞毒作用活性,另有1株对HIV-1假病毒有较弱的中和活性。说明我们成功地引进了利用B细胞培养和RT-PCR技术从人体淋巴细胞中筛选特异性抗体基因的人单克隆抗体技术平台。用该技术可以成功获得HIV-1Env特异性单克隆抗体,为将来从能产生高滴度广谱中和抗体的感染者体内筛选广谱中和抗体打下了基础。     

CCR7和B7-2在抗原负载树突状细胞诱导特异性CTL抗肿瘤效应中的表达和意义

目的:研究CCR7(趋化因子受体7)和B7-2(白细胞分化抗原86)与抗原负载树突状细胞(dentritic cell,DC)诱导特异性CTL(细胞毒性T淋巴细胞)抗肿瘤效应的关系.方法:分离和培养DC,制备B16黑色素瘤细胞抗原,进行共培养,即为抗原负载的DC,建立B16黑色素瘤小鼠模型,于肿瘤周围皮下注射抗原负载的DC.应用原位杂交和免疫组织化学方法检测CCR7和B7-2的表达情况.结果:原位杂交和免疫组织化学染色显示,CCR7和B7-2阳性细胞主要分布于肿瘤周围组织,随着注射抗原负载DC时间的进展,CCR7和B7-2呈强阳性表达.结论:CCR7和B7-2的表达与抗原负载树突状细胞诱导特异性CTL抗肿瘤效应有关.     

多聚免疫球蛋白受体（pIgR）在粘膜免疫中的重要功能

多聚免疫球蛋白受体（pIgR）属于Ⅰ型跨膜糖蛋白,可与多聚免疫球蛋白A和多聚免疫球蛋白M特异性结合,通过穿胞转运,将它们从上皮细胞基底侧膜转运到顶膜,并最终分泌到外分泌液中去. 在此过程中,多聚免疫球蛋白受体的细胞外段被水解,释放出与多聚免疫球蛋白A或多聚免疫球蛋白M相结合的细胞外段（又称为分泌成分）. 分泌成分是sIgA分子的重要组成部分,直接参与sIgA的粘膜防御功能,而且在被动粘膜免疫中也有重要作用. 多聚免疫球蛋白受体通过介导细胞内多聚免疫球蛋白的转运,可以在粘膜的腔面阻止病原体粘附,在上皮细胞内中和病毒,也可以将固有层内的抗原分泌出去. 因此,多聚免疫球蛋白受体的有效分泌是多聚免疫球蛋白发挥粘膜防御功能的必要条件. 但在某些情况下,该受体也可以介导微生物对上皮屏障的入侵. 多聚免疫球蛋白受体是高度 N -糖基化的,其分子中独特的糖链结构,可能与受体的穿胞转运、sIgA在粘膜的正确定位,以及抗原对上皮细胞的粘附有关. 多聚免疫球蛋白受体和分泌成分参与的多重分子机制,使它们在粘膜免疫中起着举足轻重的作用.     

B细胞免疫球蛋白与T细胞抗原受体基因的种系结构及其体细胞重排

免疫现象的第一步是免疫活性细胞对抗原的识 别。脊椎动物和人体有两类免疫活性细胞与抗原发生 特异性结合反应：B淋巴细胞表面的抗原受体与可溶 性抗原反应,T淋巴细胞表面的抗原受体与细胞表面 抗原反应。这些受体分子的基本结构单位是类似的异 型二聚体（heterodimer) ; B细胞抗原受体（B cell rece ptor, BCR）由轻链（L）和重链(H)构成,T细胞抗原 受体（T cell receptor, TCR）由,链和0链构成。抗原 分子多种多样。一个抗原分子还往往会有一个以上的 表位（e pi tope）或称抗原决定基（antigenic determinant) 均应有与它互补的对位（paratope）即抗原受体可与它 发生特异性结合反应。一个脊推动物或人体的B细胞 和T细胞必需而且事实上具备极为丰富的抗原受体贮 备库。在抗原刺激下,带有特异性抗原受体的B细胞 或T细胞发生克隆扩增（clonal multiplication),每个克 险只具有一种抗原结合特异性。这里有两个矛盾。一 个是淋巴细胞基因组内基因有限,与为如此众多受体 蛋白质分子编码需要大量遗传信息之间的矛盾;另一 个是淋巴细胞基因组的全能性与一个成熟淋巴细胞只 表现一种抗原受体特异性之间的矛盾。探究这些矛盾 的奥秘是近三十年来免疫遗传学中一个吸引人而又使 人烦恼的课题。     

前列腺素受体HA标签小鼠的鉴定

前列腺素是一类有重要生理活性的不饱和脂肪酸衍生物,其通过结合特异性的受体发挥生理功能。前列腺素受体缺乏特异性的抗体,这极大制约着前列腺素信号直接的深入解析。本文旨在鉴定及验证"人造精子"和CRISPR-Cas9联合应用构建的氨基端(-NH2,-N)带HA标签的9种前列腺素受体小鼠。通过将向导RNA表达质粒和带标签的打靶载体质粒转入"人造精子细胞",筛选出含HA标签的"人造精子细胞"。进一步将标签细胞注射到小鼠卵母细胞中并移植入假孕母鼠体内,获得标签小鼠。提取前列腺素受体HA标签小鼠的基因组DNA,利用PCR技术检测小鼠的基因型。分离小鼠腹腔巨噬细胞,通过Western blot方法验证带HA标签的前列腺素受体的蛋白表达情况。结果显示,前列腺素受体HA标签小鼠能扩增出特异性的DNA条带,并且巨噬细胞蛋白中可检测出特定HA蛋白条带的表达,野生型小鼠则没有相应条带。综上可知,我们成功制备了9种前列腺素受体-N-HA标签小鼠,为进一步研究前列腺素信号在体内及体外的病理生理功能提供强有力的工具。     

FATE/BJ-HCC-2基因表达促进细胞增殖及肿瘤形成

FATE/BJ-HCC-2是本实验室鉴定的一个新的肿瘤-睾丸抗原基因,定位于Xq28染色体.为探讨FATE/BJ-HCC-2 对细胞生物学行为的影响及裸鼠体内肿瘤形成能力的改变,分别采用脂质体转染真核表达载体及逆转录病毒感染两种方式,获得了FATE/BJ-HCC-2 表达的Bel-7402单克隆细胞株及NIH-3T3细胞克隆,并通过RT-PCR和Western 印迹在基因和蛋白水平鉴定了FATE/BJ-HCC-2 表达情况.通过3H-TdR参入法,检测细胞的增殖能力;通过稀释铺板克隆形成率测定和soft agar克隆形成实验,检测细胞的克隆形成能力;通过裸鼠体内细胞注射成瘤,检测细胞成瘤性和肿瘤生长速度.结果表明,FATE/BJ-HCC-2基因表达能明显提高细胞体外增殖、克隆形成能力和成瘤性.提示其对肿瘤的发生发展起到促进作用.     

B 细胞膜CD20 抗原的分布与单分子力谱探测

CD20抗原分子在B细胞上表达下降是慢性B淋巴细胞白血病 (B-CLL) 的标志性特征。采用激光扫描共聚焦显微镜 (LSCM) 和量子点标记相结合的方法对正常和B-CLL外周血CD20+B淋巴细胞膜表面CD20抗原分子的表达及分布进行了荧光成像。同时,采用原子力显微镜 (AFM) 对CD20+B细胞的形貌及超微结构特征进行了表征,并且将AFM针尖用生物素化的单克隆抗体进行修饰,对CD20+B细胞表面的CD20抗原-抗体之间的单分子力谱进行了探测。LSCM荧光图像显示,B-CLL CD20+B淋巴细胞上CD20分子的表达量比正常CD20+B淋巴细胞显著降低。AFM结果显示,B-CLL CD20+B淋巴细胞超微结构比正常的粗糙。力谱结果显示,CD20抗原-抗体的相互作用力大约是非特异性黏附力的5倍,CD20分子在正常CD20+B淋巴细胞膜上分布比较均匀,小部分有聚集现象,反之,在B-CLL CD20+B淋巴细胞膜表面分布稀疏。利用以上两种方法能进一步观察到B-CLL外周血B淋巴细胞的异常,并在一定程度上解释临床上B-CLL病人对利妥昔的低反应现象,为针对抗原CD20的治疗用药选择提供参考。     

基于4-1BBL和CD3双信号的融合蛋白协同抗肿瘤作用研究

旨在研究4-1BBL/CD20融合蛋白增强抗CD3/抗CD20 diabody介导的特异性靶向杀伤活性。采用亲和层析法纯化本室构建的抗-CD3/抗-CD20 diabody和4-1BBL/CD20融合蛋白可溶性表达产物;采用calcein释放试验测定其介导的体外靶向杀伤活性;采用人B淋巴瘤细胞系Raji裸鼠移植瘤模型测定其介导的体内靶向杀伤活性。纯化4-1BBL/CD20融合蛋白在体外能增强抗-CD3/抗-CD20 diabody介导激活的T细胞杀伤Raji细胞;在人B淋巴瘤细胞系Raji裸鼠移植瘤模型联合人T淋巴细胞4-1BBL/CD20融合蛋白增强抗-CD3/抗-CD20 diabody高效抑制Raji细胞裸鼠移植瘤的生长,明显延长荷瘤裸鼠的生存时间。在体外和体内4-1BBL/CD20融合蛋白均能增强抗-CD3/抗-CD20 diabody介导激活的T细胞杀伤表达CD20抗原的肿增细胞,是一个有望用于B细胞恶性肿瘤临床治疗的特异性融合蛋白。     

黑龙江立克次体重组外膜蛋白B激活树突状细胞诱导C3H/HeN小鼠特异性免疫应答

专性胞内寄生的黑龙江立克次体是远东斑点热的病原体,外膜蛋白B(OmpB)是其最主要的表面蛋白抗原.本研究将黑龙江立克次体ompB基因分成4段插入原核表达载体,制备出4个重组OmpB抗原(OmpB-P1,OmpB-P2,OmpB-P3和OmpB-P4).将4个重组OmpB抗原分别刺激体外培养的C3H/HeN小鼠树突状细胞,再将这些抗原激活树突状细胞分别腹腔接种正常C3H/HeN小鼠.接种第14天用黑龙江立克次体攻击小鼠,7天后活杀小鼠并用实时定量PCR检测小鼠主要脏器的立克次体的载量.结果显示,OmpB-P2,OmpB-P3或OmpB-P4激活树突状细胞受体小鼠的立克次体载量显著低于OmpB-P1激活树突状细胞受体小鼠.将不同抗原激活小鼠树突状细胞分别与同源抗原激活小鼠树突状细胞受体小鼠的CD4+和CD8+T细胞体外共培养.用流式细胞仪分析共培养后CD4+和CD8+T细胞的表面分子和细胞因子表达,结果显示,OmpB-P2,OmpB-P3或OmpB-P4抗原激活树突状细胞共培养的CD4+或CD8+T细胞的CD69表达水平高于OmpB-P1激活树突状细胞共培养的T细胞.此外,OmpB-P2,OmpB-P3或OmpB-P4激活树突状细胞共培养的CD4+或CD8+T细胞的TNF-?和IFN-?水平均显著高于OmpB-P1激活树突状细胞共培养的T细胞.本研究结果表明,OmpB-P2,OmpB-P3或OmpB-P4为保护性抗原,其激活的树突状细胞可以有效地诱导T淋巴细胞活化,使CD4+T细胞和CD8+T细胞分别向Th1细胞和Tc1细胞分化,产生高水平TNF-?和IFN-?共同对抗立克次体感染.     

Ⅰ型单纯疱疹病毒(HSV—Ⅰ)体外抗体应答及IFNr的调节

以纯化、灭活的HSV-I为抗原,体外致敏洗涤过的健康成人外周血淋巴细胞,37℃孵育12天,细胞培养上清中的特异性抗体用ELISA法测定。11例血清HSV-I抗体阳性成人的淋巴细胞接受灭活HSV-I抗原致敏后,培养上清中均能检出特异性抗体,抗体类型为IgG(26.6土23ng/m1),体外产生的特异抗体水平与原血清抗体水平无相关性(R=0.45,P>0.05)。同法刺激新生儿淋巴细胞;不能诱生任何类型的HSV-I抗体。在本实验系统中,特异性抗体应答是一个蛋白质的全新(de novo)合成过程,应答水平和体外致敏用的病毒抗原量有明显剂量依赖关系,最适刺激抗原量为108ng/ml。HSV-I抗体应答需要T、B细胞的相互作用,两类细胞单独均不能诱导特异性HSV-I抗体应答。在本实验系统中加入适量重组人γ干扰素,能增强抗体应答水平,过高剂量起抑制作用。     

关于淋巴细胞特异性的问题

淋巴细胞的膜表面存在抗原识别受体,抗原识别受体具有多样性,机体能够预先形成多种淋巴细胞。使免疫系统能够特异性识别环境中各种抗原。不同淋巴细胞在特异性识别抗原方面存在明显差异。     

双顺反子质粒DNA疫苗的研究

肿瘤疫苗是转移性癌化疗的有希望的替代品。为达到有效而安全,治疗性癌苗应特异性靶向转移性肿瘤细胞上表达的抗原。抗非何杰金氏B细胞淋巴瘤表达的特异性表面免疫球蛋白或其独特型的疫苗,它符合这些标难,因为原发的或转移的肿瘤细胞皆表达肿瘤特异性免疫球蛋白。使用小鼠38C13B细胞淋巴瘤作为一种模型系统设计了一种质粒DNA疫苗,它表达编码38C13肿瘤表面轻链和重链两种肿瘤免疫球蛋白(独特型)的双顺反子mRNA。为提高该质粒DNA疫苗的免疫原性,将小鼠轻重链的可变区与其人免疫球蛋白相应的稳定区相融合。另外,构建的真核类表达盒在体内得产生鼠／人嵌合型免疫球蛋白的高水平表达,及引起保护性免疫应答。用特有的SfiI限制位点快速克隆任一肿瘤特异的免疫球蛋白独特型区,产生的系列质粒构建物用以试验J区和／或人C区插入SfiI限制位点的差异,发现这样的差异对表达和免疫原性都有显影响。原型独特型疫苗免疫小鼠产生了抗38C13肿瘤的保护性免疫应答。研究表明,双顺反子质粒DNA为基础的新疫苗可用于开发抗B细胞淋巴瘤的肿瘤特异性疫苗。     

免疫球蛋白的基因和基因工程

免疫球蛋白具有抗体活性、能与相应的抗原专一地结合,为生物体内普遍存在的最主要的一类抗体蛋白质。免疫球旦白不仅存在于血液中与其它体液中,同时也分布在淋巴细胞膜表面上,所以称前者为分泌型抗体,而称后者为膜结合型抗体。     

鼠源抗B型肉毒毒素Fab抗体库的构建及初步筛选

目的:应用重组噬菌体抗体库技术制备抗B型肉毒毒素Fab抗体。方法:用重组B型肉毒毒素重链C端片段(BoNTB/Hc)免疫BALB/c小鼠,从其脾淋巴细胞扩增免疫球蛋白Fd段和κ链基因,克隆至表达载体pComb3中,并将抗体Fab段表达于噬菌体表面,建立容量为5.96×106cfu的噬菌体抗体库。以BoNTB/Hc为抗原对所建抗体库进行4轮亲和筛选,获得与B型肉毒毒素特异性结合的克隆,并进行序列测定。结果:构建了抗B型肉毒毒素Fab抗体库,筛选出特异性克隆1个。结论:从鼠源噬菌体免疫抗体库中初步获得了特异性抗B型肉毒毒素的Fab抗体。     

水稻LRR型类受体蛋白激酶胞外区的原核表达及多克隆抗体制备

前期研究表明,水稻根尖细胞质膜类受体蛋白激酶OsRLK的表达受盐胁迫诱导.为了进一步研究该激酶的生理功能,通过反转录PCR得到OsRLK胞外区cDNA片段,将其亚克隆至pET29a原核表达载体并在大肠杆菌中实现了高表达,表达量约为细胞总蛋白的30%.重组蛋白经SDS-PAGE分离,染色切胶收集后,作为抗原免疫新西兰家兔,分离抗血清,经纯化得到1:20 000效价的多克隆抗体.Wescem blot结果显示,该抗体能特异识别在原核表达系统内表达的抗原,以及水稻根尖细胞质膜组分中的LRR型类受体蛋白激酶,并且在蛋白质水平证实该激酶为盐胁迫响应蛋白.