T7启动子在哺乳类动物细胞中启动外源基因表达的研究

人低密度脂蛋白（LDL）受体基因cDNA和氯霉素已酞转移酶基因（CAT）及PolyA信号序列被克隆进pGEM4载体的T7噬茵体启动子下游,构建成质粒pT7LDLR和pT7CAT．两个重组质粒转化CHO细胞．PCR和CAT酶实验显示：两个基因被T7噬菌体启动子所启动．结果证实真核生物RNA聚合酶能够识别T7启动子,转录外源基因．常用的含有T7启动子的质粒可同时作为原核生物和真核生物的表达载体．     

噬菌体T7溶菌酶基因的克隆

以Pbr322及含有噬菌体T7 RNA聚合酶强启动子φ10的Pbr322衍生物作为克隆载体,经限制内切酶AvaⅡ+HaeⅢ切割的一段噬菌体T7 DNA片段分别克隆到Pbr322及其衍生质粒的BamHⅠ位点上。插入的DNA片段为632碱基对。该片段包括噬菌体T7基因3．5和T7 RNA聚合酶弱启动子φ3．8的全部编码序列。已知噬菌体T7基因3．5的功能为产生噬菌体T7溶菌酶,利用氯仿处理检测带有重组质粒的转化子胞内溶菌酶活力。证明两种克隆株整体细胞中,均有溶菌酶存在。用10一20％SDS-聚丙烯酰胺凝肢电泳检查噬菌体T7基因3．5蛋白带,结果表明T7基因3．5在Pbr322衍生质粒中的表达优于Pbr322。     

利用重组噬菌体诱导表达的大肠杆菌表达系统

将编码噬菌体T7RNA聚合酶的基因克隆至噬菌体M13mpl8RFDNA中,置于lac启动子的控制之下,得到了可表达T7 RNA聚合酶的重组噬菌体M13HEP。利用该噬菌体感染含T7启动子表达质粒的宿主菌以提供T7RNA聚合酶,可以诱导T7启动子控制下的外源基因的表达。该噬茵体诱导表达系统已成功地表达了多种外源基因,特别是一些表达产物对宿主菌有毒性的基因。同时,通过细菌接合将F',因子从大脑杆菌XL1-blue转至大肠杆菌HMS174,构建了新的大脑杆菌菌株HMSl74F,,使得T7表达质粒构建、表达及单链制备可以在同一菌株中完成,得到了一个完整的T7表达系统。     

原核表达系统的真核化

Ｔ7噬菌体ＲＮＡ聚合酶显著的特点是只识别其自身ＤＮＡ序列中特定的启动子[1] ;而Ｔ7噬菌体启动子属于组成型的启动子 ,又只能被相应的Ｔ7噬菌体的ＲＮＡ聚合酶 (约 10 0ｋＤ的单链蛋白质 )所识别 ,并且被Ｔ7ＲＮＡ聚合酶所启始的转录非常活跃[2 ,3] ,宿主细胞的ＲＮＡ聚合酶所进行的转录根本无法同其竞争 ,这样宿主细胞中几乎所有的转录都被Ｔ7ＲＮＡ聚合酶所操纵。另外 ,Ｔ7ＲＮＡ聚合酶几乎能完整地转录在Ｔ7启动子下游的所有ＤＮＡ序列。基于这些优点 ,1986年Ｓｔｕｄｉｅｒ和Ｍｏｆｆａｔ建立了一套新的原核表达系统———Ｔ7ＲＮＡ聚…     

T7启动子具有真核生物聚合酶Ⅱ顺式作用因子的功能

根据ａ－鹅膏蕈碱（ａ－ａｍａｎｉｔｉｎ）对真核生物ＲＮＡ聚合酶的选择性抑制,以氯霉素乙酰转 移酶基因（ＣＡＴ）作为报道基因进行体内表达实验,证明Ｔ７噬菌体启动子可为真核生物ＲＮＡ 聚合酶Ⅱ所启动。应用建立的竞争性ＤＮＡ－蛋白质凝胶泳动技术,分别以ＴＡＴＡ框、ＣＡＡＴ 框、ＧＣ框和八核苷酸序列（ｏｃｔａｍｅｒ）为竞争性寡核苷酸分子,发现人工合成的Ｔ７启动子可能 与 ＴＦⅡＤ起始转录因子结合,形成 ＤＮＡ－核蛋白质结合物。将 ＴＡＴＡ框和八核苷酸序列分别 接入Ｔ７启动子上游,ＣＡＴ实验显示八核苷酸序列可以增强ＲＮＡ聚合酶Ⅱ对Ｔ７启动子的转录 起始作用。实验结果表明Ｔ７启动子可作为ＲＮＡ聚合酶Ⅱ的顺式作用因子。     

用T7RNA聚合酶体外转录合成大鼠肝tRNA~(Ile)

采用PCR技术从rec M1 3mp1 8中扩增出 1 2 0bp的大鼠肝tRNAIle合成基因片段 ,经限制性内切酶BstNⅠ酶切后作为模板 ,利用T7RNA聚合酶在体外无细胞体系转录由T7启动子带动的大鼠肝tRNAIle基因 ,生成不含修饰碱基的tRNAIle,并对体外转录反应条件进行了优化 ,回收的tRNA产量可达DNA模板量的 4 0倍     

不同来源RNA聚合酶对霍乱弧菌分型噬菌体VP3启动子的作用

目的:研究不同来源的RNA聚合酶对预测的霍乱弧菌分型噬菌体VP3启动子的作用。方法:以含有预测的VP3启动子区的片段取代质粒pRL-null的T7启动子区,以海肾萤光素酶基因Rluc为报告基因,在霍乱弧菌N16961内检测霍乱弧菌RNA聚合酶对克隆的启动子区的作用;将上述重组质粒和表达VP3 RNA聚合酶的质粒共转化大肠杆菌JM109,检测大肠杆菌和VP3的RNA聚合酶对克隆的启动子区的作用。结果:N16961的RNA聚合酶不能识别并作用于启动子P1、P2、P5、P6、P10和P12,JM109的RNA聚合酶可能识别并作用于启动子P7和P11;只有P2、P7、P8、P9、P13、P16和P17在JM109内可以被克隆表达的VP3 RNA聚合酶识别转录。结论:宿主菌N16961与非宿主菌JM109的RNA聚合酶识别转录VP3启动子的能力不同,可能与噬菌体的宿主特异性有关;VP3的RNA聚合酶对大部分有活性的VP3启动子具有直接启动转录作用,但部分启动子可能需要VP3或宿主蛋白的辅助作用才能表现出更强的活性;VP3启动子对VP3 RNA聚合酶的特异性也不同,P1、P2和P12对VP3的RNA聚合酶具有高度特异性,P7和P11的特异性较弱。     

大肠杆菌等受体tRNALeu的T7 RNA聚合酶转录

用化学方法合成编码2个大肠杆菌tRNALeu(tRNALeu1和tRNALeu2)的基因和T7启动子,分别克隆到pUC19载体上,并在纯化的T7 RNA聚合酶的体外转录系统中转录出不含修饰核苷酸的tRNALeu.在T7转录体系中,亚精胺对转录有负影响.在最适转录条件下,可以得到有活力的RNA转录物的量是模板DNA的250倍左右.在大肠杆菌亮氨酰-tRNA合成酶的催化下,2种经体外转录产生的未修饰等受体tRNALeu(tRNALeu1和tRNALeu2)的亮氨酸接受能力基本相同,但只有从体内纯化对应的tRNALeu的四分之一左右,表明修饰核苷酸在tRNALeu氨酰化过程中起着较为重要但非关键的作用.     

原核表达系统T7RNA聚合酶/启动子在真核细胞中表达目的基因的实验研究

将目前高表达水平强大的原核表达系统之一T7RNA聚合酶 启动子表达系统通过一系列改进引入真核细胞。通过转染真核细胞实验表明 ,采用真核启动子CMV调控T7RNA聚合酶的表达和在T7启动子下游插入EMCVIRES序列两种解决方案能使该原核表达系统在真核细胞高效表达目的基因 ,且能适应不同的真核细胞环境 ,是一良好的细胞类型非依赖的表达体系。     

原核表达系统T7RNA聚合酶/启动子在真核细胞中表达目的基因的实验研究

将目前高表达水平强大的原核表达系统之一T7 RNA聚合酶/启动子表达系统通过一系列改进引入真核细胞.通过转染真核细胞实验表明,采用真核启动子CMV调控T7 RNA聚合酶的表达和在T7启动子下游插入EMCV IRES序列两种解决方案能使该原核表达系统在真核细胞高效表达目的基因,且能适应不同的真核细胞环境,是一良好的细胞类型非依赖的表达体系.     

痘苗病毒/T7RNA聚合酶辅助的原核基因在真核细胞中的表达

痘苗病毒/T7RNA聚合酶这一瞬时表达系统由于具有很多优于其他表达系统的特点而被广泛地应用于表达外源蛋白.TB-Chen株轮状病毒的VP6 DNA编码片段插入到原核质粒pETL的噬菌体T7启动子和终止子之间,获得重组表达质粒pET-VP6.构建好的重组表达质粒pET-VP6通过脂质体转染到真核细胞MA104中,用携带噬...     

Broad host range, regulated expression system utilizing bacteriophage T7 RNA polymerase and promoter

An IPTF-regulated broad host range expression system was constructed using compatible broad host range plasmids, the T7 RNA polymerase, and T7 promoter sequences. The system is implemented by the coexistence of two plasmids. The first contains the T7 RNA polymerase gene under the control of lacl or lacl(q) genes and lacUV5 promoter. The second encodes the T7 promoter upstream of a multicloning site. IncP1 or IncP4 T7 promoter plasmids, and IncP1, IncP4 or IncW T7 RNA polymerase plasmids were constructed. The expression from the IncP1 promoter plasmids in the presence of the IncP4 polymerase plasmids was tested by in vivo lacZ fusions and vivo labeling of proteins. In this combination, the use of lac(q) improves the regulation levels in Escherichia coli, whereas, in Pseudomonas phaseolicola, a 28.5-fold regulation was obtained with lacl, Although the level of lacZ expression from the T7 promoter in P. phaseolicola is low compared with E. coli, it is similar to levels obtained with the pm promoter in Pseudomonas putida when the differences in the copy number of the expression vectors are taken into consideration (c) 1993 Wiley & Sons, Inc.     

Electrostatic map of T7 DNA: comparative analysis of functional and electrostatic properties of T7 RNA polymerase-specific promoters

The entire T7 bacteriophage genome contains 39937 base pairs (Database NCBI RefSeq N1001604). Here, electrostatic potential distribution around double helical T7 DNA was calculated by Coulomb method using the computer program of Sorokin A.A. (lptolik@gmail.com). Electrostatic profiles of 17 promoters recognized by T7 phage-specific RNA polymerase were analyzed. It was shown that electrostatic profiles of all T7 RNA polymerase-specific promoters can be characterized by distinctive motifs which are specific for each promoter class. Comparative analysis of electrostatic profiles of native T7 promoters of different classes demonstrates that T7 RNA polymerase can differentiate them due to their electrostatic features.