黑麦1R染色体微克隆文库的构建与分析

通过玻璃针分离法 ,从黑麦 (SecalecerealeL .)根尖细胞中期分裂相中显微分离出 2条及 5条 1R染色体。经Sau3A接头介导的PCR(LA_PCR)方法对其进行体外扩增 ,得到了 0 .3～ 2 .5kb之间的DNA片段。以DIG标记的探针进行多次Southern杂交 ,证明显微分离出的染色体的体外扩增产物与黑麦基因组DNA同源 ,并且来自 1R染色体。然后利用 5条 1R染色体的第二轮PCR产物构建质粒文库 ,可得到 2 2 0 0 0 0个重组子。随机挑选 172个重组子进行分析 ,发现插入片段主要介于 30 0～ 180 0bp之间。此外 ,根据基因组点杂交结果推算出该文库包含约 42 %的中、高重复序列和 5 8%的单、低拷贝序列 ,而且文库的冗余度较低。研究构建的黑麦 1R染色体微克隆文库为 1R染色体高密度遗传图谱的建立以及位于其上的重要基因的定位与分离提供了便利。     

利用微分离黑麦1R染色体的体外扩增产物进行染色体着染研究

首先对显微分离出的黑麦（ＳｅｃａｌｅｃｅｒｅａｌｅＬ．）１Ｒ染色体进行了两轮Ｓａｕ３Ａ连接接头介导的ＰＣＲ扩增（ＬＡ＿ＰＣＲ）。经Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交证实这些染色体扩增片段来源于基因组ＤＮＡ之后,再利用１Ｒ染色体的第二轮扩增产物、黑麦基因组ＤＮＡ、ｒＤＮＡ基因为探针,与其根尖细胞中期分裂相进行染色体原位杂交,发现微分离的１Ｒ染色体体外扩增产物中包含大量的非该染色体特异性重复序列,而其信息量却较黑麦总基因组少;当以适量的黑麦基因组ＤＮＡ进行封阻时,微分离染色体的体外扩增产物成功地被重新定位在中期分裂相的一对１Ｒ染色体上,说明微分离１Ｒ染色体的ＰＣＲ扩增产物中的确包含了该染色体特异性的片段。此外,以从１Ｒ染色体微克隆文库中筛选出的一单、低拷贝序列和一高度重复序列分别为探针,染色体原位杂交检测发现,这一高度重复序列可能为端粒相关序列;而单、低拷贝序列却未检测到杂交信号。这些结果从不同侧面反映出染色体着染技术是证实微分离、微切割染色体的真实来源及筛选染色体特异性探针的有利工具。建立了可供参考的植物染色体着染实验体系,为染色体微克隆技术在植物中的进一步应用提供了便利。     

利用微分离黑麦IR染色体的体外扩增产物进行染色体着染研究

首先对显微分离出的黑麦（Ｓｅｃａｌｅｃｅｒｅａｌｅ．Ｌ．）１Ｒ染色体进行了两轮Ｓａｕ３Ａ连接接头介导的ＰＣＲ扩增（ＬＡＰＣＲ）经Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交证实这些染色体扩增片段来源于基因组ＤＮＡ之后,再利用ＩＲ染色体的第二轮扩增产物,黑麦基因组ＤＮＡ,ｒＤＮＡ基因为探针,与其根尖细胞中期分裂相进行染色体原位杂交,发现微分离的ＩＲ当色体体我扩增产物中包含大量的非该染色体特异性重复序列,而其信息量却较黑麦总     

黑麦2R染色体的显微分离与回收

建立了利用显微担任技术分离植物单个染色体的方法。以黑麦（Ｓｅｃａｌｅ ｃｅｒｅａｌｅ Ｌ）为材料,以其标准染色体组型图为依据,识别出黑麦含抗病基因的１Ｒ染色体。经显微操作,将单条１Ｒ染色体放入Ｅｐ－ｐｅｎｄｏｆ管中。研究表明,用α－溴萘饱和液对细胞进行预处理,可快速鉴别出黑麦１Ｒ染色体。采用去壁低渗制片技术,可明显地改善显微分离意境染色体的条件。     

黑麦1R染色体的显微分离与回收

建立了利用显微操作技术分离植物单个染色体的方法。以黑麦(Secale cereale L.)为材料,以其标准染色体组型图为依据,识别出黑麦含抗病基因的1R染色体。经显微操作,将单条1R染色体放入Ep-pendorf管中。研究表明,用α-溴奈饱和液对细胞进行预处理,可快速鉴别出黑麦1R染色体。采用去壁低渗制片技术,可明显地改善显微分离单染色体的条件。     

黑麦1R染色体的显微分离、体外扩增及扩增产物的鉴定

借助Leitz显微操作器,在国产倒置显微镜下(400×)用玻璃针对处于有丝分裂中期的黑麦根尖细胞中的1R染色体成功地进行了分离。分离出来的1R染色体转入0.5 ml的Eppendorf管中,用蛋白酶K处理,把DNA释放出来;经Sau3A酶切,再与人工合成的Sau3A连接头连接;以连接头的一条链的核苷酸顺序片段为引物对DNA酶切片段进行了PCR扩增。琼脂糖凝胶电泳显示扩增产物的长度大约为300~1000 bp。以生物素分别标记的黑麦总体DNA和小麦rDNA为探针进行斑点杂交,结果表明PCR扩增产物确实来源于黑麦的1R染色体DNA。这个方法为构建黑麦1R染色体亚基因组文库和筛选1R染色体特异性探针奠定了基础。     

小麦背景中黑麦1R染色体的遗传变异

运用细胞遗传学方法鉴定了来源于中国春×Ｍ２７（１Ｒ／１Ｄ代换系）的花粉植株和Ｆ２单株染色体组成。发现７个花粉植株中出现７种染色体组成变异类型,每株呈现一类变异;而２７个Ｆ２单株中,存在１１种染色体组成变异类型,变异频率仅为３７．０％,低于花粉植株。花粉植株群体中,观察到一个能稳定向后代传递的小麦／１Ｒ小片段易位,但Ｆ２群体中未检测到小麦／黑麦易位。表明常规染色体工程结合花药培养是有计划、有目的实现异源染色体小片段向小麦转移的简便、高效、快速途径。     

黑麦6R染色体在小麦背景中的传递

带有６Ｒ的配子传递率普通显著下降。６Ｒ通过雌配子的传递率为８．８％,通过雄配子的传递率为１０．３％,通过花药培养的传递率较高,为２３．３％,但均低于理论值。进一步分析各种配子经花药离体培养的传递率,发现附加型提高最多,正常型次之,缺失型减少最多,代换型次之,说明离体培养对各种配子具有选择作用。另外,还观察到６Ｒ单体附加,６Ｒ＾Ｌ端体单附加和６Ｒ＾Ｌ等臂单附加自交传递率差异不显著。对于影响传递率的各     

黑麦染色体的显微分离与PCR扩增

利用改良的染色体显微分离技术,分离了黑麦（ＳｅｃａｌｅｃｅｒｅａｌｅＬ．）一个完整细胞的１８条染色体（１４Ａ＋４Ｂ）,用人工合成的寡核苷酸为引物,进行单一引物法（ｓｉｎｇｌｅｕｎｉｑｕｅｐｒｉｍｅｒＰＣＲ,ＳＵＰＰＣＲ）扩增,经Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交证明,ＰＣＲ扩增产物与黑麦基因组ＤＮＡ同源。     

柱穗山羊草2C染色体诱发中国春小麦背景中黑麦1R染色体结构变异的研究

当柱穗山羊草(Aegilops cylindrica Host．)2C染色体单体添加到普通小麦品种中国春和以中国春为背景的派生系时,减数分裂时,不含2C染色体的配子会发生染色体结构变异。为了制备一套黑麦1R染色体缺失系以用于定位黑麦1R染色体上的控制重要农艺性状的基因,把一条2C染色体导人到小黑麦1R二体附加系(21″ 1R″)中,然后让这些个体(21″ 1R″ 2C′,2n=45)自交,以便产生1R染色体结构变异体。实验共检测了345粒F,种子,83粒种子带有结构变异的黑麦1R染色体(24．1％)。通过C分带和原位杂交检测,对来自于23株F2的46个F3植株所带有的异常1R染色体进行了归类：其中1RL端体为39．1％,1RL等臂染色体为2．2％,1RL易位系为32．6％。1RS端体为4．3％,1RS等臂染色体为4．3％,切点在长臂上的缺失体为2．2％。在6．5％的植株中同时含有2种类型的1R染色体结构变异。其余8．7％带有异常1R染色体的个体因为没有原位杂交结果而无法判断是属于哪种类型。已获得的1R结构变异株将有可能进一步发展成为一套可用于定位黑麦1R染色体上重要功能基因的遗传材料。另外,还探讨了综合应用细胞学和分子标记方法鉴定易位染色体中小麦染色体片段的尝试,并对所获结果进行了讨论。     

对微分离的大豆单染色体的克隆及其PCR产物的原位杂交分析

通过玻璃针分离法从大豆（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ Ｌ．）根尖细胞中期分裂相中显微分离出一条染色体,经Ｓａｕ３Ａ人工接头介导的两轮ＰＣＲ后,将其第二轮扩增产物克隆到质粒载体上,构建了单染色体质粒文库,经分析,该微克隆文库包含约２００００个重组子。随机挑选１７８个重组子进行鉴定,证明该文库的插入片室主要介绍于２００－１８００ｂｐ大小８３０ｂｐ;其中,中、高拷贝重复序列占４４％,单、低拷贝序列占５６％。微     

黑麦1R染色体特异性PCR引物的分子证据

根据黑麦（ＳｅｃａｌｅｃｅｒａｌｅＬ．）与小麦（ＴｒｉｔｉｃｕｍａｅｓｔｗｕｍＬ．）ｒＲＮＡ基因间隔区序列差异,按Ｋｏｅｂｎｅｒ设计的引物序列,合成了黑麦特异引物ＮＯＲ－Ｒ１。运用该引物对不同植物材料进行ＰＣＲ扩增,观察表明,含有黑麦１Ｒ染色体的植物均扩增出黑麦的特异带,但含有其他黑麦染色体的小麦种质,普通小麦品种及其近缘物种长穗偃麦草（Ａｇｒｏｐｙｒｏｎｅｌｏｎｇａｔｕｍ（Ｈｏｓｔ）Ｂｅａｕｖ）     

黑麦B染色体端粒相关序列的克隆

利用显微切割技术,分离了黑麦（ＳｅｃａｌｅｃｅｒｅａｌＬ．）１０个Ｂ染色体短臂端部片段,并利用寡核苷酸引物（ＣＣＣＴＡＡＡ）３及新建立的二级单引物序列ＰＣＲ扩增法,扩增了黑麦Ｂ染色体端粒相关序列。染色体原位杂交实验将ＰＣＲ产物定位于Ｂ染色体短臂末端,多数Ａ染色体末端也显示清晰的杂交信号。部分ＰＣＲ产物克隆到ｐＵＣ１９载体中,对其中一个克隆子ｐｐ３的序列分析结果表明,它与玉米亚端部克隆子ｐＢＦ２６６部分区域的同源性为９２％。就目前资料检索,黑麦、玉米端粒相关序列具有高度同源性还未见报道。对这一实验设计在构建高密度ＲＦＬＰ图谱中的应用进行了探讨     

黑麦染色体的银染研究

在对黑麦染色体银染过程的盐酸解离条件进行探索的同时,对黑麦染色体的银染正反应区进行了研究,首次发现经短时间空气干燥(4-24h)的黑麦染色体制片,随着盐酸解离强度的递增,分别出现了核仁组织区(NOR)、NOR和端粒以及NOR和着丝点的银染正反应,就此现象讨论了端粒和着丝点的银染机理。     

染色体微分离和微克隆技术

染色体微分离和微克隆技术是将细胞遗传学和分子遗传学二紧密结合的一项技术,目前已广泛应用于遗传学、医学等研究领域,具有广阔的应用前景。本综述了该技术发展过程中所应用的不同方法,详细介绍了各种方法的步骤及其优缺点,最后探讨了该技术的应用及展望。     

一个1B/1R小麦-黑麦染色体易位的鉴定

本研究对冬小麦品系73(36)9-1的1B/1R易位染色体进行了遗传分析。发现73(36)9-1有一对随体染色体,它的两个亲本矮丰四号及洛夫林10(Lovrin lo)分别有两对和一对随体染色体。观察用矮丰四号回交的F_1,绝大部分花粉母细胞的中期染色体都能正常配对,而用洛夫林10回交的,除了多数产生两个单价体之外,正常配对的情况也能经常看到。同时还发现,73(36)9-1和“中国春”双端体(CSDT)的1BL能很好地配对并形成一个棒状的异形二价体,而它和CSDT 1BS的染色体则主要产生20″+1′+t′的构型,从而证明易位发生在1B染色体的短臂,并且该易位的片段来自黑麦染色体1RL。本文还讨论了该易位发生的可能途径,推断是由于在F_1花粉母细胞中的两个单价体(一个是小麦染色体1B,一个是黑麦染色体1R)同时进行错分裂之后产生的两种端着丝点染色体(1BL和1RL)重新并合形成的,因而冬小麦73(36)9-1可能是一个自发产生的易位系。     

小麦-黑麦染色体代换的研究

本文用八倍体小黑麦,六倍体小黑麦与普通小麦杂交,在杂交后代中选择普通小麦类型带有黑麦性状的品系56个,经C－分带与原位杂交鉴定,选出10个同祖群间的代换系,即1R／1D,1R／1A,5R／5A,6R／6A的代换,这10个代换系表现遗传性稳定,育性正常,具有抗病,抗旱等优良性状,有利于价值。用代换系5R／5A与6R／6A杂交,在杂交后代中获得大量有经济价值的小片段易位系,作者认为可能是同祖染色体间配对与交换产生的。