黑麦1R染色体特异性PCR引物的分子证据

根据黑麦（ＳｅｃａｌｅｃｅｒａｌｅＬ．）与小麦（ＴｒｉｔｉｃｕｍａｅｓｔｗｕｍＬ．）ｒＲＮＡ基因间隔区序列差异,按Ｋｏｅｂｎｅｒ设计的引物序列,合成了黑麦特异引物ＮＯＲ－Ｒ１。运用该引物对不同植物材料进行ＰＣＲ扩增,观察表明,含有黑麦１Ｒ染色体的植物均扩增出黑麦的特异带,但含有其他黑麦染色体的小麦种质,普通小麦品种及其近缘物种长穗偃麦草（Ａｇｒｏｐｙｒｏｎｅｌｏｎｇａｔｕｍ（Ｈｏｓｔ）Ｂｅａｕｖ）     

黑麦染色体的显微分离与PCR扩增

利用改良的染色体显微分离技术,分离了黑麦（ＳｅｃａｌｅｃｅｒｅａｌｅＬ．）一个完整细胞的１８条染色体（１４Ａ＋４Ｂ）,用人工合成的寡核苷酸为引物,进行单一引物法（ｓｉｎｇｌｅｕｎｉｑｕｅｐｒｉｍｅｒＰＣＲ,ＳＵＰＰＣＲ）扩增,经Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交证明,ＰＣＲ扩增产物与黑麦基因组ＤＮＡ同源。     

水稻条叶枯病毒基因组组分3的克隆与序列分析

利用ＲＴ－ＰＣＲ技术,合成并扩增了水稻条叶枯病毒（ＲＳｔＶ）中国云南分离 物基因组组分３的全长ｃＤＮＡ。将ＰＣＲ产物克隆在载体ｐＣＲⅡ上,进行全序列测定。将所得核苷酸序列及其所推导的氨基酸序列与日本分离物Ｔ进行同源性比较,结果表明,在核苷酸水平上,两分离物的５’端非编码区序列相同,ｖＯＲＦ、ｖｃＯＲＦ及基因间非编码区序列的同源性分别为９７．６％、９６．８％及８７．６％,而３’端非编码区同源性为９８     

黄瓜花叶病毒山东株(CMV-SD)RNA2全长cDNA克隆的构建及全序列分析

分别利用５’ＲＡＣＥ和３’ＲＡＣＥ确定了ＣＭＶＳＤＲＮＡ２的５’和３’末端序列,在此基础上,利用ＲＴＰＣＲ得到了ＲＮＡ２的５’端一半的ｃＤＮＡ克隆ｐＣ２５和３’端一半的ｃＤＮＡ克隆ｐＣ２３,并通过拼接构建了ＲＮＡ２全长ｃＤＮＡ克隆ｐＣ２Ｆ。通过对ｐＣ２５和ｐＣ２３进行序列测定,得到了ＲＮＡ２的全序列。序列分析结果表明ＣＭＶＳＤＲＮＡ２由３０４８ｎｔ组成,其中存在２个部分重叠的阅读框ＯＲＦ１（７９～２６５２ｎｔ）和ＯＲＦ２（２４１４～２７４６ｎｔ）,分别编码８５８ａａ的２ａ蛋白和１１１ａａ的２ｂ蛋白,并在２ａ蛋白的序列中发现了动植物病毒复制酶所特有的两个保守序列。该株系ＲＮＡ２核苷酸序列与分属ＣＭＶＩ亚组的Ｆｎｙ株系和ＩＩ亚组的Ｑ株系ＲＮＡ２的核苷酸序列同源性分别为９１７％和７５６％;２ａ蛋白的氨基酸序列同源性分别为９３８％和６７７％,２ｂ蛋白的氨基酸序列同源性分别为８３０％和５１３％。同源性比较的结果表明ＳＤ株系属于ＣＭＶＩ亚组。     

利用微分离黑麦IR染色体的体外扩增产物进行染色体着染研究

首先对显微分离出的黑麦（Ｓｅｃａｌｅｃｅｒｅａｌｅ．Ｌ．）１Ｒ染色体进行了两轮Ｓａｕ３Ａ连接接头介导的ＰＣＲ扩增（ＬＡＰＣＲ）经Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交证实这些染色体扩增片段来源于基因组ＤＮＡ之后,再利用ＩＲ染色体的第二轮扩增产物,黑麦基因组ＤＮＡ,ｒＤＮＡ基因为探针,与其根尖细胞中期分裂相进行染色体原位杂交,发现微分离的ＩＲ当色体体我扩增产物中包含大量的非该染色体特异性重复序列,而其信息量却较黑麦总     

利用微分离黑麦1R染色体的体外扩增产物进行染色体着染研究

首先对显微分离出的黑麦（ＳｅｃａｌｅｃｅｒｅａｌｅＬ．）１Ｒ染色体进行了两轮Ｓａｕ３Ａ连接接头介导的ＰＣＲ扩增（ＬＡ＿ＰＣＲ）。经Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交证实这些染色体扩增片段来源于基因组ＤＮＡ之后,再利用１Ｒ染色体的第二轮扩增产物、黑麦基因组ＤＮＡ、ｒＤＮＡ基因为探针,与其根尖细胞中期分裂相进行染色体原位杂交,发现微分离的１Ｒ染色体体外扩增产物中包含大量的非该染色体特异性重复序列,而其信息量却较黑麦总基因组少;当以适量的黑麦基因组ＤＮＡ进行封阻时,微分离染色体的体外扩增产物成功地被重新定位在中期分裂相的一对１Ｒ染色体上,说明微分离１Ｒ染色体的ＰＣＲ扩增产物中的确包含了该染色体特异性的片段。此外,以从１Ｒ染色体微克隆文库中筛选出的一单、低拷贝序列和一高度重复序列分别为探针,染色体原位杂交检测发现,这一高度重复序列可能为端粒相关序列;而单、低拷贝序列却未检测到杂交信号。这些结果从不同侧面反映出染色体着染技术是证实微分离、微切割染色体的真实来源及筛选染色体特异性探针的有利工具。建立了可供参考的植物染色体着染实验体系,为染色体微克隆技术在植物中的进一步应用提供了便利。     

用PCR法直接快速筛查重组阳性克隆

应用ＰＣＲ法快速筛查插入有苯丙氨酸脱氨酶ｃＤＮＡ重组阳性克隆。方法：用于ＰＣＲ扩增的引物是位于载体ｐＥＴ２３ｂ启动子处的Ｔ７启动子引物和位于目的基因ＰＡＬｃＤＮＡ３’端终止密码ＴＡＡ处的引物。以灭菌吸头挑一单菌落加入ＰＣＲ体系扩增。结果：在筛查的３个克隆中,有２个阳性克降,并且插入方向正确,经ＤＮＡ序列测定得到进一步证实。结论：以ＰＣＲ方法筛查重组阳性克隆,可以简便快速鉴定插入片段的大小和方面,不     

人血小板生成素（hTPO）的cDNA克隆,序列测定及其在COS—7细胞中的表达

本文利用反转录ＰＣＲ技术从人胎肝ｍＲＮＡ中分别扩增出ｈＴＰＯ　Ｎ－端和Ｃ－端两个ｃＤＮＡ片段,然后经酶切分别连接重组到质粒ｐＵＣ１９中进行序列分析,在确证其序列与国外文献报道完全一致的基础上,酶切、回收、连接其Ｎ－端、Ｃ端ｃＤＮＡ,并以此为模板,用ＰＣＲ法扩增出全长ＴＰＯｃＤＮＡ片段,并将其重组到穿梭质粒ｐＳＶＫ３中,在ＣＯＳ－７中进行了瞬时表达并检测出表达产物的活性     

柯萨奇B3病毒结构和非结构蛋白基因重组质粒的构建及其在体外真核细胞中的

制备ＣＶＢ３结构蛋白和非结构蛋白重组质粒ＤＮＡ疫苗时,采用ＲＴ－ＰＣＲ从ＣＶＢ感染的ＨｅＬａ细胞中扩增ＶＰ１、ＶＰ２、２Ａ和３Ｄ基因,重组入真核表达质粒ｐｃＤＮＡ３中,构建ｐｃＤＮＡ３／ＶＰ２、ｐｃＤＮＡ３／ＶＰ１、ｐｃＤＮＡ３／２Ａ和ｐｃＤＮＡ３／３Ｄ重组质粒,经酶切和测下实扩增的序列并将各重组质粒体外转染真核细胞ＣＯＳ－７,用ＲＴ－ＰＣＲ检测ｍＲＮＡ的转录,用Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ检测表达产物。结果４种重组质粒酶切出相应大小的目的片段,经测序证实为ＣＶＢ３相应序列,Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ证实能够在体外真核细胞中表达。本文成功构建ＣＶＢ３结构与非结构蛋白的重组质粒ＤＮＡ疫苗,为进一步研究其免疫效果奠定了基础。     

猪圆环病毒2型ORF2基因序列分析及真核表达载体的构建

根据ＧｅｎＢａｎｋ中猪圆环病毒２型（ＰＣＶ－２）ＯＲＦ２基因序列,设计一　对引物,应用ＰＣＲ从疑患断奶仔猪多系统消耗综合症（ＰＭＷＳ）的死亡仔猪组织病料中扩增出ＯＲＦ　２全基因（７０２ｂｐ）。将此片段克隆入ｐＧＥＭ－Ｔ　ｅａｓｙ载体,筛选获得重组质粒ｐＴＯＲＦ２,并对此质　粒中的插入序列进行了测序分析,结果表明本试验克隆的ＯＲＦ２与美国ＰＣＶ－２分离株ＡＦ２６４０３９　的核苷酸及氨基酸序列同源性均达到１００％,与其他ＰＣＶ－２毒株同源性分别为９２．３％～９８．　６％和　９２．３％～９６．６％。重组质粒ｐＴＯＲＦ２经　Ｂａｍ　Ｈ　Ｉ、Ｅｃｏ　Ｒ　Ｖ双酶切,回收ＯＲＦ２基因,转　移入真　核表达载体ｐＳｅｃＴａｇ２／ＨｙｇｒｏＢ的相应酶切位点之间,构建成重组质粒ｐＳｅｃＴａｇＯＲＦ２。此重组表　达载体的构建成功为进一步研究ＯＲＦ２编码蛋白的生物学活性及建立ＰＣＶ诊断试剂盒打下基础。     

戊型肝炎病毒（HEV）开读框架2中1.3kb cDNA的克隆与序列分析

以戊型肝炎（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ）病人高热期血清为原材料,设计特定引物,经ＲＴ－ＰＣＲ扩增获得开放阅读框２（ＯＲＦ２）１．３ｋｂ基因片段,用ＥｃｏＲＩ和ＢａｍＨＩ插入克隆载体ｐＵＣ１８,测定了该克隆基因片段的核苷酸序列并进行了比较分析。其片段长度为１３０９ｂｐ,其Ａ＝２４９（１９．２％）,Ｇ＝３１８（２４．２９％）,Ｔ＝３３９（２５．９％）,Ｃ＝４０３（３０．７９％）;与印度株和缅甸株的同源性在９０     

利用PCR技术行反义寡核苷酸体外抗丁型肝炎病毒基因组RNA中核酶的研究

设计一对ＰＣＲ引物,其中上游引物的５’端除目的基因外,还加Ｔ７ＲＮＡ聚合酶启动子序列,以质粒（ｐＳＶＬＤ３）为模板,通过ＰＣＲ扩增出带有Ｔ７ＲＮＡ聚合酶启动子序列的１３９ｂｐ的ｃＤＮＡ片段,它含有丁型肝炎病毒（ＨＤＶ）基因组ＲＮＡ中核酶（Ｒｉｂｏｚｙｍｅ）区的ｃＤＮＡ该核酶具有自身裂解功能,经测序发现该ｃＤＮＡ有２个碱基变异,以此ＰＣＲ产物为模板,通过Ｔ７ＲＮＡ聚合酶,转录出核酶的前体,并观察到其     

孤儿受体TR3与人CNTF受体基因中顺式元件作用机制的研究

应用两对人工合成的寡核苷酸引物,分别通过ＰＣＲ扩增,得到了ＣＮＴＦＲα－Ｉ５ＮＢＲＥ序列两侧的两个扩增片段,将其和在ＥｃｏＲⅤ位点切开的ｐＴ７ｂｌｕｅ一起定向连接,得到了插入在ｐＴ７ｂｌｕｅ的ＥｃｏＲⅤ位点的缺失了ＮＢＲＥ序列的ＣＮＴＦＲα－Ｉ５,然后再将其切下,插入到具有ＳＶ４０起动子的ＣＡＴ基因表达载体的ＢｇｌⅡ位点,构建了ＣＡＴ报道基因．细胞转染和ＣＡＴ实验表明,缺失ＮＢＲＥ后,ＣＮＴＦＲα－Ｉ５仍具有增强子功能,ＴＲ３通过该增强子对ＣＮＴＦＲα的表达具有诱导作用,说明这种诱导作用并不是单一通过ＮＢＲＥ序列进行的．     

人NMT的表达,纯化和活性研究

利用ＰＣＲ技术并进行ＤＮＡ序列测定,从人脑ｃＤＮＡ库中扩增得到人豆蔻酰ＣｏＡ蛋白Ｎ端豆蔻酰转移酶的编码基因,构建其在Ｔ７启动子控制下的成熟型和Ｈｉｓ６融合型的表达质粒ｐＭＦ－ｈＮＭＴ３和ｐＭＦＨＴ－ｈＮＭＴ２。转化大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）,进行ＩＰＴＧ诱导表达研究。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析结果显示,在３７℃条件下表达的各种重组ｈＮＭＲ几乎全是不溶性产物,但在较低温度条件下表达的Ｈｉｓ６－ｈＮＭＲ绝大     

黑麦1R染色体的微切微克隆研究

显微分离出黑麦（ＳｅｃａｌｅｃｅｒｅａｌｅＬ．）１Ｒ染色体,用ＣｏｈｅｓｉｖｅａｄａｐｔｅｒｓｓｉｎｇｌｅｐｒｉｍｅｒＰＣＲ（ＣＡＳＰＰＣＲ）方法进行体外扩增,以ＤＩＧ１１ｄＵＴＰ标记扩增产物为探针,进行Ｓｏｕｔｈｅｒｎ分子杂交,结果表明扩增产物来自黑麦１Ｒ染色体。用１／１０体积的连接物转化Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５α,获得１００００多个重组菌落。经酶切分析,克隆子的插入片段为２５０～５００ｂｐ,为进一步筛选１Ｒ染色体的分子标记打下了基础     

黄瓜花叶病毒山东株（CMV—SD）RNA2全和cDNA克隆的构建及全序列分析

分别利用５’ＲＡＣＥ和３’ＲＡＣＥ确定了ＣＭＶ－ＳＤＲＮＡ２的５’和３’未端序列,在此基础上,利用ＲＴ－ＰＣＲ得到了ＲＮＡ２的５’端一半的ｃＤＮＡＤＱ ＢＴＧ Ｐｃ２５和３’端一半的ｃＤＮＡ克隆ＰＣ２３,并通过拼接构建了ＲＮＡ２全长ｃＤＮＡ克隆ＰＣ２Ｆ。     

BRCA1基因结构及其在乳腺癌中的表达

利用ＭＰＣＲ技术从乳腺组织分离到抑癌基因ＢＲＣＡ１的ｃＤＮＡ片段,将此９１４ｂｐ的片段克隆进质粒ｐＵＣ１１８,并经全序列测定证实。序列分析表明,ＢＲＣＡＩｃＤＮＡ编码的肽链ＮＮ２－末端有一锌指结构,抑癌基因ＢＲＣＡＩ的产物可能是ＤＮＡ结合蛋白,ｃＤＮＡ序列存在两个变异位点：一个是第４０９位的Ｃ→Ａ（Ａｓｐ→Ｇｌｕ）：另一个是第８７９位的Ａ→Ｔ（ＭＩａ同义突变）。以该片段为探针,检测６例乳腺癌组织中ＢＲＣＡＩｍＩＭＡ表达,一例表达明显下降,一例没检测到表达的ｍＩＭＡ产物,说明一些乳腺癌组织的ＢＲＣＡ１基因转录水平降低     

三种鱼类生长激素cDNA基因的结构比较研究

从厦门海区选取３种生长速度不同的鱼类,真鲈、高体Ｓｈｉ、褐菖Ｙｏｕ,由它们的脑下垂体中分别提取出总ＲＮＡ,用逆转录ＰＣＲ方法（ＲＴ－ＰＣＲ）扩增出生长激素ｃＤＮＡ,克隆到ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ载体上的ＥｃｏＲＩ位点,并分别测定了这３种鱼的成熟生长激素ｃＲＮＡ序列。将由这３种序列推导出的氨基酸序列同已知的８种不同科鱼类的生长激素氨基酸序列进行比较,分析它们序列的同源性,结果表明它们间的同源性与这些鱼     

粘虫核型多角体病毒919bp片段的PCR双链直接序列测定

本文发展了ＰＣＲ克隆和亚克隆技术制备ＤＮＡ测序模板。首先,我们用ｐＵＣ／Ｍ１３系列质粒的通用正反向引物ＰＣＲ扩增出质粒ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳＤＮＡ的多克隆位点及其侧翼序列,用ＥｃｏＲＶ和ＸｈｏＩ消化成为左右两个引物多克隆臂,与粘虫核型多角体病毒（ＬｓＮＰＶ）的ＥｃｏＲＶ和ＸｈｏＩ约４００ｂｐ和５００ｂｐ片段分别连接,经ＰＣＲ扩增,得到两端具有上述正反向引物结合位点的测序模板,用ｄｄＮＴＰ链终止法／ＰＣＲ扩增／银染色,从片段两端测定了全部９１９ｂｐ序列,这种ｄｄＮＴＰ／ＰＣＲ／银染测序法简化了操作,大大缩短了测序模板的制备时间,易于实现自动化操作。     

中国人肥胖基因真核表达载体的构建

为研究肥胖（ｏｂｅｓｉｔｙ）的病因及肥胖基因（ｏｂ）的表达与调控,根据文献报道的ｈｏｂ序列设计引物,经ＲＴ－ＰＣＲ扩增中国人的ｏｂ基因（包括信号肽在内的ｃＤＮＡ全长５４０ｂｐ）,ＰＣＲ产物采用Ｔ－Ａ克隆法首先连接到克隆载体ｐＵＣ１１９,然后定向转移到经改造的真核表达载体ｐＳＶ－β－ｌａｃＺ,酶谱分析表达克隆基因为的人肥胖基因。