金属螯合亲和层析法纯化抗乙肝核心抗原单克隆抗体

采用金属螯合亲和层析法,纯化了小鼠腹水来源的抗乙肝核心抗原单克隆抗体,对上样缓冲液的pH和离子强度、洗脱液种类和洗脱方式进行优化。结果表明,采用降低pH分步洗脱时,最佳上样缓冲液为pH8.0,20mmol/LPB+0.5mol/LNaCl,抗体在pH5.0被洗脱下来,抗体回收率80%,纯度85%。采用咪唑浓度梯度洗脱时,最佳的上样缓冲液为pH8.0,20mmol/LPB+5mmol/L咪唑,抗体纯度大于95%,回收率65%;在上样缓冲液中不添加NaCl而添加少量的咪唑,更有利于抗体分离。以上洗脱方式都能较好地保持mAb的生物学活性,为该抗体的应用提供了必要的实验基础。     

金属螯合亲和层析法纯化猪红细胞超氧化物歧化酶

本文报道以Sephadex G-200为基质的金属螯合亲和层析法纯化SOD、其比活为4508U/mg蛋白,收率为90.4％,经酸、碱、SDS-PAGE、考马斯亮兰染色均呈一条带,特异性的SOD活性染色呈阳性。分子量为34,000,氨基酸组成测定表明Tyr含量少,Gly含量高,紫外吸收光谱最大吸收在258nm处,园二色谱结果表明SOD空间结构为β—折迭及无规态,含极少量或几乎不含α—螺旋,等电聚焦电泳测定SOD有微不均一性,等电点分别为5.25,5.35和5.65。     

应用A蛋白亲和层析法纯化单克隆抗体

应用Protein A亲和层析法,从采集的小鼠腹水中纯化出了抗凝血因子Ⅶ单克隆抗体,用SDS-PAGE和ELISA法分别检测了纯化后单克隆抗体的纯度及效价,结果显示,电泳为两条带,分别为免疫球蛋白G(IgG)的重链和轻链,纯化后的单克隆抗体纯度达到电泳纯,应用间接ELISA法测定腹水效价为1×10-7左右,与未纯化前无差异。结果表明,应用A蛋白亲和层析法能够得到纯度较高的单克隆抗体,适用于高纯度单克隆抗体的制备。     

单克隆抗体亲和层析法纯化重组溶葡萄球菌酶

溶葡萄球菌酶能够特异性杀灭金黄色葡萄球菌且不易产生耐药性, 有望成为治疗葡萄球菌属细菌引发感染的特效药物。为获得高纯度的重组溶葡萄球菌酶以达到药用标准, 本研究构建了一种以重组溶葡萄球菌酶单克隆抗体为配体的亲和层析纯化方法。纯化后的重组溶葡萄球菌酶纯度大于95%, 得率大于90%, 即使重复使用30多次, 纯化效率不变。且经比色法鉴定纯化后的重组溶葡萄球菌酶仍具有良好的活性。该方法步骤简单, 纯化效果好, 为生产高纯度重组溶葡萄球菌酶奠定了基础。     

亲和层析法纯化人绒毛膜促性腺激素

本文介绍了一种应用抗hCG β亚单位单克隆抗体亲和层析提纯hCG的方法。结果表明,该法具有简便、快速、经济、产品活性高等优点。hCG回收率为96％,免疫学活性17000IU/mg蛋白,生物学活性(小鼠子宫称重法)达到10 000U/mg蛋白以上。     

两步串联层析法纯化抗TNF-α单克隆抗体北大核心CSCD

旨在建立从重组CHO细胞发酵培养液中纯化抗TNF-α单克隆抗体的两步串联层析法。将含有抗TNF-α单克隆抗体的料液经两次离心、一步过滤的预处理后,用protein A填料捕获,阳离子填料Sourec30精细纯化。精细纯化过程中利用Do E的方法,采用CCF(Central composite face)设计,探讨了洗脱p H值及盐浓度对纯化的影响。纯化后的抗TNF-α单克隆抗体经HPLC以及毛细管电泳,检测其浓度、纯度以及多聚体含量。结果显示,亲和层析的最佳洗脱条件为p H4.0。通过DOE优化,为达到质量目标(回收率90%以上,纯度97%以上,多聚体0.3%),筛选出最佳洗脱范围为0.05-0.13 mol/L Na Cl以及p H5.7-6.0,选定p H6.0与0.10mol/L Na Cl作为Source洗脱条件,此时回收率94.3%,纯度97.3%,多聚体0.3%,其质量与参比制剂接近。     

两步串联层析法纯化抗TNF-α单克隆抗体

旨在建立从重组CHO细胞发酵培养液中纯化抗TNF-α单克隆抗体的两步串联层析法。将含有抗TNF-α单克隆抗体的料液经两次离心、一步过滤的预处理后,用protein A填料捕获,阳离子填料Sourec30精细纯化。精细纯化过程中利用Do E的方法,采用CCF(Central composite face)设计,探讨了洗脱p H值及盐浓度对纯化的影响。纯化后的抗TNF-α单克隆抗体经HPLC以及毛细管电泳,检测其浓度、纯度以及多聚体含量。结果显示,亲和层析的最佳洗脱条件为p H4.0。通过DOE优化,为达到质量目标(回收率90%以上,纯度97%以上,多聚体0.3%),筛选出最佳洗脱范围为0.05-0.13 mol/L Na Cl以及p H5.7-6.0,选定p H6.0与0.10mol/L Na Cl作为Source洗脱条件,此时回收率94.3%,纯度97.3%,多聚体0.3%,其质量与参比制剂接近。     

重组人Fab金属螯合层析法纯化条件的研究

在重组人Fab(rh Fab)表达载体的羧基端插入六个组氨酸, 使其对金属螯合层析介质产生特异性吸附, 可用金属螯合亲和层析法进行分离纯化. 采用自制金属(铜、锌金属离子)螯合层析介质, 以pH和咪唑两种洗脱方法,对rh Fab段的纯化效果进行了探讨. 结果显示: 铜离子螯合层析介质比锌离子螯合层析介质对rh Fab的亲和能力更强; pH洗脱方法的重复性优于咪唑法; 金属铜离子螯合层析法对rh Fab进行一步纯化可得到纯度大于95%的rh Fab产品.     

以壳聚糖为载体金属螯合亲和层析法纯化猪红细胞Cu·Zn—SOD

从虾壳制备所得壳聚糖为基质合成金属螫合亲和吸附剂,用于纯化猪血铜锌超氧化物歧化酶(Cu·Zn-SOD),得到比活为4756U·mg-1的酶蛋白,收率为67%,纯化倍数为6.1.聚丙烯酰胺凝胶电泳及活性染色定位表明,经螯合层析纯化后的酶纯度基本均一.     

用免疫亲和层析法纯化细菌铁蛋白

用细菌铁蛋白免疫家兔,制备抗铁蛋白血清,用进一步纯化的抗铁蛋白抗体作为配基与溴化氰活化的Sepharose4B偶联,得到亲和免疫吸附剂。以此法纯化的铁蛋白为聚丙烯酰胺凝胶电泳纯,相对复合抗体作双向免疫电泳显示单峰,并具有较高的免疫活性。     

固定化金属螯合亲和膜纯化重组抗菌肽研究

用自行制备的固定化金属螯合亲和膜对N端含六个组氨酸标记的重组抗菌肽进行了分离纯化,并较好地解决了金属离子泄露问题.实验表明,固定化金属螯合亲和膜性能优于传统琼脂糖凝胶介质,完全适用于分离纯化含有多组氨酸标记的重组蛋白质.     

单克隆抗体亲合层析法快速提纯乙肝表面抗原

本文报道用乙型肝炎病毒单克隆抗体(抗-HBsMcAb)与活化琼脂糖(Minileak Low)结合制备亲合层析柱,用于提纯乙型肝炎病毒的表面抗原(HBsAg)。对纯化前后的表面抗原活性用RPHA法进行了检测,提纯后的效价比提纯前提高了20多倍。用免疫电镜(IEM)对提纯物观察可见满视野22nm的小圆颗粒。经SDS-PAGE电泳得出一条较清楚的带。对这项工作的意义进行讨论。     

免疫亲和层析法纯化T_4RNA连接酶

本文描述了一种新的、简化了的纯化T_4RNA连接酶的方法——免疫亲和层析法.利用这种纯化方法得到的酶,经SDS-凝胶电泳,得到一条主带。将此酶与~(32)pCp及CpGpGpA(或tRNA)一起进行连接反应,未见到RNase杂酶的降解作用。用此方法制备的酶,可用于确定顺序的核酸的合成。     

纯化小麦α-淀粉酶的亲和层析法

纯化α-淀粉酶有多种方法。Mac Gregor等以及Kruger和Tkachuk分别应用羧甲基纤锥素离子交换层析与丙酮分部、糖元沉淀和离子交换层析,各自从大麦及春小麦分离了α-淀粉酶。Tkachuk又发展了以α-环化糊精为配基的α-淀粉酶分离纯化的亲和层析法。由于亲和层析法简便、快速、高效,因而获得了广泛的应用。我们以β-环化糊精(β-Cyclodextrin)为配基,分离纯化了小麦α-淀粉酶。现介绍如下。     

用亲和层析法制备免疫纯的抗乙型肝炎抗原的抗体

用于检测乙型肝炎抗原(HB Ag)的诊断血清,一般是用初步提纯的HB Ag免疫动物所得到的免疫血清经正常人血清在液相吸收处理后制成。这种诊断血清只能用于灵敏度较低的检测方法,如琼脂扩散、对流电泳等。对灵敏度较高的检测方法如反向被动血     

用免疫亲和层析法纯化萝卜 PHGPx 天然蛋白

萝卜磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶 (RsPHGPx) 是一个定位于线粒体的蛋白质 . 为了阐明该蛋白质线粒体定位信号的准确切割位点,采用了免疫亲和层析方法纯化天然的 RsPHGPx. 用重组 RsPHGPx 蛋白免疫兔子获得了抗 RsPHGPx 的多克隆抗血清,以重组 RsPHGPx 蛋白为配体,采用亲和层析技术对抗血清进行了纯化,得到了单特异性的抗 RsPHGPx 的抗体 . 将纯化好的抗体偶联到一个 N- 羟基琥珀酰亚胺 (NHS) 预先激活的琼脂糖柱子上,装配成一个以单特异性的抗 RsPHGPx 抗体为配体的免疫亲和层析柱 . 经过对纯化条件的摸索和优化,形成了一个简单、特异的一步法纯化方案 . 按照该方案,从萝卜幼苗线粒体总蛋白质提取物中纯化到一个分子质量与预期值相一致的特异蛋白质 . 免疫印迹分析表明,该蛋白质被抗 RsPHGPx 的抗血清特异识别 . 酶活性分析表明,该蛋白质具有显著的 PHGPx 活性 . 这些结果表明,纯化到的特异蛋白质是萝卜的 RsPHGPx 天然蛋白 . 这是首个关于定位于植物细胞器的 PHGPx 蛋白纯化的报道 . 这一结果为准确测定 RsPHGPx 信号肽的切割位点奠定了基础,并将有助于对植物 PHGPx 的亚细胞定位机制及其生理功能的深入研究 .     

用单克隆抗体检测乙肝核心抗原及抗体

<正>HBcAg的纯化 HBcAg的纯化操作时对生物危险要特别注意。根据Takahashi等方法纯化HBcAg。要选择具有高滴度HBsAg的无症状携带者的血浆。2.6升体积之混合血浆样品6000×g4℃20分钟离心。上清37000×g16小时离心。所得沉淀物悬浮在含有10~(-4)M水解蛋白酶的0.01MTris—HCl缓冲液(pH7.2)     

亲和层析法分离纯化猪肺血管紧张素转换酶

亲和胶合成实验以双环氧化合物1,4-丁二醇-2-缩水甘油醚(1,4-butanediol diglycidyl ether)为活化体及连接臂,在硼氢化钠(NaBH)存在的碱性条件下,将载体Sepharose CL―4B与雷诺普利(lisinopril)共价连接在一起,成功合成亲和层析胶,并利用亲和层析胶对猪肺血管紧张素转换酶（angiotensin converting enzyme, ACE）进行分离提纯.猪肺组织匀浆经1.6～2.6 mol/L硫酸铵分级沉淀、透析平衡、亲和柱分离等步骤,从200 g猪肺中提纯得到0.79 mg ACE蛋白,酶活力回收11.9％,比活力38.8 U/mg.与层析前的酶液比较,亲和层析一步提纯可达264倍;与肺匀浆液比较提纯达808倍.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳可见,提纯的猪肺ACE为一条带,分子质量约为180 ku.