定量荧光原位杂交测定端粒长度

目的:应用定量荧光原位杂交(Q-FISH)方法测定端粒长度。方法:选取4种端粒长度均一的标准细胞株采用Q-FISH的方法做出荧光亮度与端粒长度的标准曲线,从而得出实验细胞株的端粒长度,与DNA印迹法测定末端限制性片段(TRF)长度进行二者之间的相关性分析。结果:检测荧光强度的最佳线性曝光时间为400ms,相对于DNA印迹法,定量荧光原位杂交(Q-FISH)法所需标本量少,实验周期短,端粒长度结果与Southern杂交法具有很好的相关性。结论:采用定量荧光原位杂交方法测端粒长度具有重复性好、精确可靠的特点,适用于对珍贵标本的端粒改变进行分析。     

流式原位荧光杂交——测定端粒长度

端粒是染色体末端ＤＮＡ重复序列与特异结合蛋白的复合体。脊椎动物端粒重复序列是 5′ＴＴＡＧＧＧ3′。端粒长度可以作为细胞的“分裂时钟” ,反映细胞的分裂能力。作为染色体末端的帽状结构 ,端粒还有其他生物学功能 :保证染色体完整性 ,使真正的遗传信息得到完整复制 ;保护染色体末端 ,防止染色体异常重组而影响细胞分裂 ;指导染色体与核膜相接。端粒 端粒酶系统对细胞增殖、细胞衰老、细胞永生化、癌变、发育生物学、ＨＩＶ感染的免疫反应、免疫缺陷等有重要意义[1～ 3] 。因此端粒动力学的研究十分重要。1 .ＤＮＡ印迹杂交端粒长度测…     

端粒长度及端粒酶活性与儿童先天性心脏病发病机制的相关性研究

目的:探讨不同年龄儿童外周血白细胞端粒长度及端粒酶活性与儿童先心病发病机制的相关性.方法:采用实时荧光定量PCR检测先天性心脏病2个年龄组及健康受试者外周血白细胞的端粒长度及hTERT mRNA(端粒酶催化亚基).比较相同年龄的先天性心脏病与健康受试者外周血白细胞的端粒长度及hTERT mRNA差异,并比较不同年龄组间外周血白细胞的端粒长度及hTERT mRNA差异.结果:先天性心脏组3-6岁组的受检者及健康受试者3-6岁组平均外周血白细胞端粒(1.63± 0.61)长于先天性心脏组7-10岁组的受检者及健康受试者7-10岁组(1.36± 0.46)(t=1 1.37,P＜0.05);各组均无端粒酶表达.结论:外周血白细胞的端粒长度随着年龄的增长而缩短.端粒酶活性与先天性心脏病发病并无直接相关性.     

荧光定量PCR 法检测肿瘤细胞端粒酶活性的变化

目的：利用荧光定量PCR法检测端粒酶抑制剂作用于人肝癌细胞SMMC-7721后端粒酶活性的变化,探讨其抑制端粒酶活性的可能机制,为端粒酶抑制剂的临床应用提供理论依据。方法：利用荧光染料SYBR—Green I建立一种新的端粒酶活性检测方法：FQ—TRAP法。利用FQ—TRAP法检测端粒酶抑制剂作用后肿瘤细胞端粒酶活性变化。结果：端粒酶抑制剂作用后,肝癌细胞端粒酶活性都有变化,其中以ASODN,EGCG,AZT抑制效果较明显。结论：端粒酶FQ—TRAP法是一种特异性、灵敏度、重复性都较好,可快速、简便及定量检测人端粒酶活性的方法,端粒酶抑制剂作用后癌细胞端粒酶活性的变化,为端粒酶抑制剂的临床应用提供理论依据。     

端粒结合蛋白与端粒长度调控

真核细胞端粒DNA序列的丢失与细胞的衰老及凋亡有关.端粒酶的激活可维持端粒长度并使细胞获得无限增殖的能力.端粒结合蛋白则可能通过调节端粒酶或其他相关因子的行为参与对端粒长度的调控.近年有关端粒结合蛋白的研究取得了突破性进展并在此基础上建立了端粒长度调控模型.     

荧光定量PCR诊断结核性脑膜炎的临床价值

目的 探讨荧光定量PCR检测脑脊液（CSF）结核分枝杆菌评估其临床意义。方法 应用荧光定量PCR技术检测45例CSF结核分枝杆菌并与抗酸杆菌染色。结核抗体酶联免疫吸附试验（结核抗体ELISA,简称酶联OT）进行比较。结果 荧光定量检测CSF结核杆菌的阳性率为11．1％,酶联OT为13．3％,抗酸杆菌染色为0％。结论 荧光定量PCR用于检测CSF结核分枝杆菌不具有灵敏度,阳性率低,对临床诊断结核性脑膜炎（简称结脑）无多少价值,不值得在临床上推广应用,必须寻找更有价值的诊断方法。     

腐皮镰刀菌SYBR Green实时荧光定量PCR快速检测方法的建立

目的建立一种能够快速、灵敏、特异的鉴定腐皮镰刀菌的SYBR Green实时荧光定量PCR。方法运用SYBR Green实时荧光定量PCR反应体系检测腐皮镰刀菌,并对此方法的特异性、灵敏度和稳定性进行评价。结果通过对45例样品的检测,结果显示SYBR Green实时荧光定量PCR特异性好,其检出率高于普通PCR;灵敏度高,对重组质粒标准品的检测灵敏度为1.0×10~2copies/μL;稳定性好,对质粒为1.0×10~7copies/μL、1.0×10~5copies/μL、1.0×10~3copies/μL的标准品重复检测10次,结果显示扩增反应Ct值的变异系数为0.96%~1.68%。结论SYBR Green实时荧光定量PCR检测腐皮镰刀菌,不仅特异性好,灵敏度高,稳定性好,而且简便、快速、易操作。     

实时定量PCR技术及其应用

实时定量PCR(Real—time Quantitative Polymerase Chain Reaction,RQ—PCR)技术是20世纪90年代中期发展起来的一种新型核酸定量技术。该技术具有实时监测、快速、灵敏、精确等特点,是对原有PCR技术的革新,扩大了PCR的应用范围。本文综述了RQ—PCR技术的原理、RQ—PCR仪、RQ—PCR实时定量检测系统及其应用。     

利用流式荧光原位杂交法测定细胞端粒长度

目的建立利用流式荧光原位杂交法检测细胞端粒长度的技术方法。方法以端粒酶敲除的G3小鼠和同龄野生型小鼠为检测对象,分离其外周血中的单个核细胞后与肽核酸荧光探针杂交,用流式细胞仪采集和分析其端粒长度,分别用荧光原位杂交方法和SYBR Green荧光定量PCR方法验证其准确性。结果流式荧光原位杂交法测定G3小鼠细胞端粒相对长度与C57BJ/6野生型小鼠相比为0.5345,荧光定量PCR测定端粒相对长度为0.5717,结果基本一致。结论流式细胞术与原位杂交方法结合起来检测细胞端粒的平均长度可靠易行,对单个核细胞端粒平均长度的检测有较高的实用性。     

定量PCR的荧光技术

荧光定量PCR是在普通PCR基础上,利用荧光技术对核酸进行绝对定量的一项新兴技术,其灵敏度高、特异性高、操作简便和定量准确,已被广泛应用于临床和科研中。为更好地发挥荧光定量PCR的优点,荧光技术领域的研发工作十分活跃。     

实时荧光定量PCR方法快速检测转基因大豆

针对转基因大豆中普遍含有的35S启动子进行引物设计,以双链DNA染料SYBR GreenⅠ为荧光标记物,利用实时荧光定量PCR方法对大豆样品进行检测。该法检测转基因大豆的检测低限为0.005 nmol/L的35S启动子,线性范围达3个数量级,可快速区分转基因大豆和非转基因大豆,具有快速、简便、灵敏、安全、高通量、低成本等优点,可推广用于转基因植物产品的快速定量检测。     

16S rDNA用作荧光定量PCR靶基因快速检测铜绿假单胞菌

对20余种细菌16SrDNAs进行多序列比对与进化树分析,设计铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa,PA)荧光定量PCR(fluorescencequantitativePCR,FQ-PCR)特异性引物。提取PA基因组DNA,以特异性引物扩增16SrDNA靶片段,并构建重组质粒pMDT-Pfr。将梯度稀释的pMDT-Pfr质粒作为模板,用于建立定量标准曲线。以SYBRGreenI荧光染料建立20μL反应体系,对不同浓度的PADNA样品进行FQ-PCR检测。同时,以金黄色葡萄球菌、伤寒杆菌、福氏志贺菌、变形杆菌、表皮葡萄球菌、大肠杆菌和结核杆菌的基因组DNA作阴性对照,验证FQ-PCR方法检测PA的特异性。结果显示,设计的FQ-PCR引物的靶向序列,仅对PA16SrDNA有高度同源性;FQ-PCR方法检测PA,其灵敏度达3.6pg/μL的基因组DNA或(2.1×103±3.1×102)拷贝/μL的16SrDNA基因,并且具有很强的特异性;从细菌DNA提取到FQ-PCR检测,可在2h左右完成PA鉴定。较传统的培养鉴定法而言,以16SrDNA作为FQ-PCR靶基因快速检测PA,具有很好的研究价值与应用前景。     

Automated Assay of Telomere Length Measurement and Informatics for 100,000 Subjects in the Genetic Epidemiology Research on Adult Health and Aging (GERA) Cohort

The Kaiser Permanente Research Program on Genes, Environment, and Health (RPGEH) Genetic Epidemiology Research on Adult Health and Aging (GERA) cohort includes DNA specimens extracted from saliva samples of 110,266 individuals. Because of its relationship to aging, telomere length measurement was considered an important biomarker to develop on these subjects. To assay relative telomere length (TL) on this large cohort over a short time period, we created a novel high throughput robotic system for TL analysis and informatics. Samples were run in triplicate, along with control samples, in a randomized design. As part of quality control, we determined the within-sample variability and employed thresholds for the elimination of outlying measurements. Of 106,902 samples assayed, 105,539 (98.7%) passed all quality control (QC) measures. As expected, TL in general showed a decline with age and a sex difference. While telomeres showed a negative correlation with age up to 75 years, in those older than 75 years, age positively correlated with longer telomeres, indicative of an association of longer telomeres with more years of survival in those older than 75. Furthermore, while females in general had longer telomeres than males, this difference was significant only for those older than age 50. An additional novel finding was that the variance of TL between individuals increased with age. This study establishes reliable assay and analysis methodologies for measurement of TL in large, population-based human studies. The GERA cohort represents the largest currently available such resource, linked to comprehensive electronic health and genotype data for analysis.     

JEV-DNA实时荧光定量标准品的构建

利用TaqMan荧光定量PCR技术,建立JEV-DNA定量标准品的制备方法。通过处理JEV减毒活疫苗提取病毒RNA,进行RT-PCR扩增目的片段,与T载体连接,转化感受态细胞,T-A克隆,测序鉴定后定量。获得预期的重组质粒,建立的标准曲线有较大的线性范围。此法制备的重组质粒标准品可用于对病毒载量进行测定。     

茶树实时荧光定量PCR分析中内参基因的选择

选择合适的内参基因是提高实时荧光定量PCR分析（qRT-PCR）准确性的先决条件。该文以茶树（Camellia sinensis）芽、叶、幼根、嫩茎、花瓣、种子和愈伤组织为材料,应用实时荧光定量PCR技术,分析了18S rRNA、GAPDH、β-actin和α-tubulin4个常用内参基因在茶树不同器官组织中的表达情况。经GeNorm和NormFinder软件分析发现,当利用荧光定量PCR分析比较茶树不同器官组织中的基因表达差异时,可选择β-actin作为校正内参基因;而比较不同成熟度的叶片和愈伤组织时,可以选择GAPDH作为校正内参基因。     

竞争PCR定量检测免疫小鼠细胞因子表达水平

目的：利用竞争PCR技术定量检测各种细胞因子的表达水平。方法：在机体免疫应答过程中,细胞因子作为免疫调节分子在免疫网络系统中发挥重要的调节功能,T细胞能够通过产生并分泌各种细胞因子来调节机体的免疫反应。本研究采用竞争PCR技术,通过提取的小鼠脾脏组织总RNA,经反转录得到cDNA,利用一种修饰的竞争模板pQRS进行竞争PCR扩增,然后利用琼脂糖凝胶电泳分析并与竞争模板产物比较而定量。结论：结果表明竞争PCR能够初步定量免疫前后小鼠脾脏组织表达的IL-2、IL-4、IL-10、IL-12和IFN-γ的表达量。为深入研究免疫前后小鼠体内各种细胞因子的动态水平和分析细胞免疫水平奠定了基础。     

实时荧光定量PCR及其在传染性疾病检测中的应用

实时荧光定量PCR技术被广泛应用于实验研究、临床检测中。与普通的PCR相比,实时荧光定量PCR技术具有特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快、全封闭反应等优点。我们综述了实时荧光定量PCR技术的原理、定量方法,及其在传染性疾病检测研究中的应用。     

新定量PCR数据处理方法的理论探讨

日新月异的生命科学技术的发展及临床医学科学研究的需求,一般的PCR技术已远远不能满足工作的需要。PE公司在进行了大量的PCR动力学研究的基础上,发现了利用荧光标记探针在PCR循环过程中积累的荧光强度达到仪器捡出阈值时,系统的初始模板数量与循环次数之间有线性关系,据此建立了目前的PE 7700 、PE 5700仪器的定量PCR技术,开创了PCR技术的新局面。但是由于这一技术的误差较大,尚不能满足生命科学及临床医学科学研究的需求,因此需要继续研究新的定量PCR技术。PCR动力学数学模型是根据PCR 技术的原理提出的,能够准确描述PCR反应产物分子数量积累规律的动力学方程,给出了PCR产物数量或者荧光强度与初始模板数量及其他反应条件间的函数关系。利用这一关系,根据PCR反应已积累的产物数量,可以实现准确的定量PCR分析,得到初始模板数量达到定量PCR的目的。使用动力学数学模型做定量PCR分析,其结果的误差仅与使用的荧光强度数值的精确度相关。使用精确到6位数的荧光强度数据,模板数自100~1 000 000区间定量结果的准确性可达99%以上。本文根据模拟实验数据进行了初步的定量PCR分析,结果提示,目前的定量PCR仪器使用PCR动力学模型理论处理分析数据,定量分析的结果会比目前的CT值方法在准确性方面提高几十倍以上,可以满足各方面研究工作误差水平的需要。 Abstract:Today standard PCR can't satisfy the need of biotechnique development and clinical research any more.After numerous dynamic research,PE company found there is a linear relation between initial template number and cycling time when the accumulating fluorescent product is detectable.Therefore,they developed a quantitative PCR technique to be used in PE7700 and PE5700.But the error of this technique is too great to satisfy the need of biotechnique development and clinical research.A better quantitative PCR technique is needed.The mathematical model submitted here is combined with the achievement of relative science,and based on the PCR principle and careful analysis of molecular relationship of main members in PCR reaction system.This model describes the function relation between product quantity or fluorescence intensity and initial template number and other reaction conditions,and can reflect the accumulating rule of PCR product molecule accurately.Accurate quantitative PCR analysis can be made use this function relation.Accumulated PCR product quantity can be obtained from initial template number.Using this model to do quantitative PCR analysis,result error is only related to the accuracy of fluorescence intensity or the instrument used.For an example,when the fluorescence intensity is accurate to 6 digits and the template size is between 100 to 1 000 000,the quantitative result accuracy will be more than 99%.The difference of result error is distinct using same condition,same instrument but different analysis method.Moreover,if the PCR quantitative analysis system is used to process data,it will get result 80 times of accuracy than using CT method.     

新疆棉花黄萎病株内生真菌荧光定量检测及时空动态分析

【背景】棉花黄萎病严重制约新疆棉花持续高产和稳产,内生菌在棉花黄萎病生物防治中潜力巨大。棉花黄萎病发生与内生菌有密切关系,但棉花黄萎病株内生真菌含量的研究鲜见报道。【目的】了解棉花黄萎病株内生真菌数量的时空动态变化及其与黄萎病病原数量的关系。【方法】用TaqMan探针实时荧光定量PCR方法对棉花黄萎病株内生真菌数量进行周年动态测定,分析棉花内生真菌数量与黄萎病原菌数量的关系。【结果】不同生育时期棉花植株根部内生真菌数量表现出不同变化趋势。库尔勒棉花吐絮期根部最大值达1.46×10~9 copies/g FRW,阿拉尔棉花根部内生真菌数量表现为蕾期缓慢上升,花铃期达到最大值,为8.30×10~7 copies/g FRW。棉花根部内生真菌数量以南疆棉区库尔勒的数量最高,吐絮期平均达1.46×10~9 copies/g FRW;其次为阿拉尔,花期平均达8.30×10~7 copies/g FRW;精河最少,苗期平均为1.85×10~4 copies/g FRW。棉花根部内生真菌数量的空间变化趋势是南疆、东疆、北疆依次递减:南疆库尔勒和阿拉尔内生真菌数量较高,库尔勒吐絮期达到最大值1.46×10~9 copies/g FRW,其次为阿拉尔8.30×10~7 copies/g FRW,精河最低1.85×10~4 copies/g FRW。精河棉花内生真菌数量与黄萎病病原菌数量显著正相关,其皮尔逊相关系数高达0.639。石河子和哈密棉花内生真菌与黄萎病病原菌呈负相关,其相关系数分别为-0.180和-0.275。其他内生真菌与黄萎病病原菌之间存在正相关,但相关性不显著。【结论】棉花黄萎病株根部内生真菌含量较高,内生真菌数量均随采样棉花生育时期和采样地点不同而呈现波动性变化,内生真菌数量最大值出现在库尔勒花铃期。