Tudor-SN蛋白一级结构间断的SN5结构域质粒的拼接构建

目的 实现Tudor-SN蛋白TSN结构域内间断的SN5基因片段（SN5α、SN5β）的拼接以及与绿色荧光蛋白在HeLa细胞中的融合表达.方法 利用Geno 3D对拼接的SN5进行结构预测.以重组质粒pSG5-Tudor-SN-flag为模板,PCR分别扩增出SN5α和SN5β的基因,双酶切并纯化后,先将SN5β引入pEGFP-C2,完成重组质粒pEGFP-C2-SN5β,再将SN5α引入pEGFP-C2-SN5β,完成重组质粒pEGFP-C2-SN5.将pEGFP-C2-SN5β/ SN5脂质体法转染HeLa细胞,荧光显微镜下观察融合蛋白的荧光表达情况,Western印迹检测融合蛋白的表达.结果 ① 拼接的SN5结构预测显示与TSN完整结构中的SN5高度重合;②对重组质粒进行双酶切鉴定可见SN5α、SN5β、SN5的cDNA片段;③ 转染重组质粒后可观察到绿色荧光蛋白的表达;④ Western印迹后可在相应位置检测到融合蛋白.结论 pEGFP-C2-SN5/SN5β重组质粒构建成功,SN5α和SN5β在pEGFP-C2中实现了顺序拼接;目的片段可与绿色荧光蛋白在HeLa细胞中融合表达,融合蛋白可与抗GFP抗体结合用于蛋白检测.     

重组pEGFP—C2-p100-TSN点突变质粒构建及表达

目的将6个不同的p100-TSN．Mutants基因片段分别定向连入PEGFP—C2质粒中,使P100-TSN突变蛋白能够与绿色荧光蛋白在COS7细胞中融合表达,从而为进一步研究p100蛋白TSN结构域的功能奠定实验基础。方法利用EcoR I和Xho I双酶切方法从6个pcDNA3．1（＋）-p100-TSN．Mutants重组质粒中分别获得p100-TSN．Mutants的cDNA片段,将其连人pEGFP—C2质粒载体中,再将成功构建的6个pEGFP—C2-p100-TSN．Mutants质粒分别转染COS7细胞中,荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达。结果①将重组质粒进行双酶切鉴定可见p100-TSN．Mutants的cDNA片段;②转染重组质粒后可观察到绿色荧光蛋白的表达。结论①6个pEGFP—C2-p100-TSN．Mutants重组质粒构建成功;②p100-TSN突变蛋白可与绿色荧光蛋白在COS7细胞中融合表达。     

沙眼衣原体真核表达质粒pcDNA4/CT703的构建及其表达

目的：构建含沙眼衣原体（Chlamydia trachomatis, Ct）基因CT703的真核重组表达质粒pcDNA4/CT703,并检测其在HeLa细胞中的表达.方法：利用RT-PCR扩增CT703基因,然后将其亚克隆到真核表达载体pcDNA4,PCR、双酶切和测序检测重组质粒.将正确的重组质粒瞬时转染HeLa细胞,免疫荧光和Western Blot实验检测重组质粒目的蛋白表达. 结果：经PCR、双酶切和测序鉴定后,成功构建了真核重组表达质粒pcDNA4/CT703,将其转染HeLa细胞后,免疫荧光和Western Blot实验能检测到目的蛋白的表达.结论：成功构建了重组质粒pcDNA4/CT703,并能在HeLa细胞中表达,为进一步研究CT703的功能奠定了基础.     

人Tudor-SN基因启动子荧光素酶报告基因表达质粒的构建及活性检测

目的 将人类Tudor-SN基因的启动子序列片段定向连入pGL3-Basic质粒载体,并进行鉴定和启动子活性检测.方法 以HeLa细胞全基因组DNA为模板,PCR法扩增出目的基因,利用XhoⅠ和HindⅢ双酶切法将目的片段连接到pGL3-Basic载体上.再将构建成功的pGL3-Basic-Tudor-SN-promoter重组质粒和内参质粒β-gal瞬时共转染入宫颈癌HeLa细胞,培养48 h后检测萤火虫荧光素酶活性.结果 双酶切和基因测序法鉴定构建的重组质粒无误,转染重组质粒后可检测到萤火虫荧光素酶活性.结论 成功构建了人类Tudor-SN基因启动子重组质粒,为Tudor-SN蛋白基因调控机制的研究奠定基础.     

PRRS病毒主要受体蛋白CD151和CD163真核表达载体的构建

为了进一步研究PRRSV与细胞受体之间的相互作用机理,通过基因工程方法从PAM细胞中克隆获得了CD151和CD163全长编码片段,利用Sal I和Kpn I内切酶对回收得到的CD151(762 bp)和CD163(3 333 bp)DNA片段进行酶切,构建了p IRES2-EGFP-CD151和p IRES2-EGFP-CD163真核表达载体。经PCR和酶切鉴定后,分别提取重组质粒进行细胞转染。荧光显微镜下可见单独转染CD151和CD163基因或CD151/CD163共转染的Marc 145细胞表达强烈的绿色荧光,Western blot分析结果进一步证实,CD151和CD163蛋白在转染后的细胞中获得超表达。猪CD151和CD163真核表达载体的成功构建为进一步探索CD151和CD163在PRRSV感染细胞过程中的协同作用提供了物质基础,特别是对深入研究PRRS病毒的入侵及宿主识别具有重要意义。     

大鼠大麻素Ⅰ型受体绿色荧光融合蛋白真核表达载体的构建与鉴定

目的:构建大鼠大麻素型Ⅰ受体绿色荧光融合蛋白真核表达载体并观察其在细胞中的表达。方法:大鼠CB1基因序列设计引物,以大鼠脑组织为模板扩增CB1基因编码区片段,克隆至增强型绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-N3中,构建重组融合蛋白表达载体pCB1-EGFP。将pCB1-EGFP质粒转染HeLa细胞,通过观察EGFP报告基因的表达以及免疫荧光,Western Blot方法鉴定CB1可在真核细胞中过表达情况。结果:构建重组融合蛋白表达载体pCB1-EGFP,单双酶切和测序验证正确。将pCB1-EGFP质粒转染HeLa细胞,荧光显微镜下观察到融合表达的绿色荧光蛋白,且呈胞膜表达。免疫荧光试验也证明重组载体转染后,CB1基因和GFP共同定位于胞膜部分。Western Blot实验证明表达CB1蛋白。结论:成功构建了高表达的CB1-EGFP融合蛋白真核表达载体。     

USP22基因克隆及其融合蛋白真核表达载体的构建

目的克隆人类泛素水解酶22（ubiquitin—specific processing enzyme22,USP22）基因,构建与绿色荧光蛋白融合表达的真核载体。方法利用RT—PCR技术以HeLa细胞总RNA为模板分别扩增USP22基因cDNA序列两片段,依次插入真核表达载体pEGFP—N1;重组质粒转染HEK293T细胞,观察融合蛋白表达及绿色荧光的分布。结果测序结果显示USP22序列与GenBank收录数据一致,酶切显示重组质粒pEG—FP—USP22构建无误,质粒转染后有80％左右HEK293T细胞表达绿色荧光,且在胞质与胞核中广泛分布。结论成功克隆USP22基因并构建与GFP融合表达的真核载体,为进一步深入研究USP22基因的生物学功能奠定了基础。     

PSF不同功能片段融合蛋白的构建及其在细胞内的分布

目的将人类PSF基因的不同功能片段定向连入pEGFP—C2质粒,使PSF蛋白的各功能片段与绿色荧光蛋白在HeLa细胞内融合表达,观察其在HeLa细胞中的表达及定位。方法以重组质粒pEGFP—C2-PSF为模板,PCR法扩增出目的基因,将扩增片段双酶切后连接到质粒pEGFP—C2上,构建重组质粒pEGFP—C2-PSF（I—V）。将构建成功的pEGFP—C2-PSF（I—V）质粒脂质体法转染HeLa细胞,Western印迹检测融合蛋白的表达,并在荧光显微镜下观察融合蛋白的定位与分布。结果成功构建质粒pEGFP—C2-PSF（I～V）,并在HeLa细胞中实现表达;Western印迹检测到融合蛋白GFP—PSF（I～V）;在激光共聚焦显微镜下观察到绿色的融合蛋白表达和定位。结论人类PSF基因的不同功能片段的重组质粒pEG—FP—C2-PSF（I～V）构建成功,可用于标记PSF蛋白的不同功能片段,为进一步研究PSF在信号转导中的作用机制以及其生物学功能奠定基础。     

肺炎支原体P1蛋白羧基端基因片段在大肠杆菌中克隆的研究

在大肠杆菌中克隆肺炎支原体P1蛋白羧基端基因片段,为P1蛋白基因片段的扩增、表达及探讨羧基端基因片段功能打基础.采用PCR扩增方法获取P1结构基因.扩增产物用SalI和EcoRI酶切消化,回收1kb大小的DNA片段并与pUC19DNA连接,转入大肠杆菌JM109菌株.用X-gal平板及质粒图谱分析方法筛选重组克隆株,再用限制性核酸内切酶酶切图谱分析鉴定.经PCR扩增MPDNA获得1条5.0kbDNA片段.重组质粒限制性内切酶指纹图谱显示出2条带,1条为pUC19载体DNA带,另1条是1kb的插入片段.实验获得肺炎支原体P1蛋白结构基因及含P1蛋白羧基端DNA片段的重组克隆株.     

真核表达载体pcDNA3.1(-)+KG的构建及在HeLa细胞中的表达

为了将绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)引入细胞核内,采用两轮PCR方法从原先克隆在pcD-NA3.1(-)+GFP载体中将GFP编码序列扩增出来并引入Kozak序列和核定位信号,使用常规酶切和连接方法将其重组至pUCm-T克隆载体中,再将目的片段重组至pcDNA3.1(-)中,对阳性克隆进行酶切、PCR和测序鉴定后,构建了带有Kozak序列和核定位信号的绿色荧光蛋白(GFP)真核表达载体pcDNA3.1(-)+KG。真核表达载体pcDNA3.1(-)+KG被转染试剂Su-perfect转染至HeLa细胞中,绿色荧光蛋白基因在HeLa细胞中得到表达而且在细胞核中观察到绿色荧光。该研究以绿色荧光蛋白为标记初步建立了活体观察真核细胞核动态变化的研究体系。     

TRIM25及其缺失突变体真核表达载体的构建及表达

目的:扩增先天性免疫中具有重要功能的泛素连接酶TRIM25及其不同结构域的cDNA,构建带有不同标签的融合蛋白载体并进行细胞表达。方法:以TRIM25 cDNA为模板,PCR扩增不同结构域cDNA,扩增产物及载体经酶切、连接后,转化大肠杆菌DH5α,挑克隆,提取重组质粒后酶切鉴定、测序,将测序正确的重组质粒转染293细胞,用Western印迹对融合蛋白的表达进行鉴定。结果:TRIM25、Two-BOX结构域、SPRY结构域以正确读框插入Flag-pcDNA3.0,TRIM25以正确读框插入pCMV-Myc,RING结构域、CDD结构域、Two-BOX结构域以正确读框插入pEGFP-c1,上述重组质粒能够在293细胞中表达。结论:构建了TRIM25及其突变体的重组表达质粒并获得表达,为研究不同RNA病毒通过与TRIM25作用抑制宿主功能提供了基础。     

大鼠p75NTR荧光真核表达载体的构建及其在HEK293细胞中的表达

目的:构建大鼠p75神经营养素受体(p75 neurotrophin receptor,p75NTR)cDNA序列的绿色荧光真核表达载体并鉴定其在人胚肾293(human embryo kidney 293,HEK293)细胞中的表达.方法:采用PCR方法从含野生型大鼠p75NTR的pDC316-RP75质粒中扩增目的片段,经EcoRⅠ和SaⅡ双酶切,定向克隆于pEGFP-N1质粒中,构建绿色荧光真核表达栽体pEGFP-N1-RP75,经酶切及测序鉴定后,通过脂质体转染HEK293细胞,激光共聚焦及免疫组织化学法鉴定大鼠p75NTR的表达.结果:重组质粒经酶切鉴定和序列分析证实含有大鼠p75NTR的编码序列,转染后经激光共聚焦显微镜及免疫组织化学染色观察表明重组质粒能够在HEK293细胞中表达出具有活性的大鼠p75NTR片段.结论:大鼠p75NTR绿色荧光真核表达栽体构建成功并可在HEK293细胞中表达,为进一步研究奠定了基础.     

近红外荧光蛋白标记乳腺癌细胞外泌体的构建及鉴定

外泌体(Exosomes)是一种大小为30~100 nm的细胞外膜囊泡,与细胞的生物学功能及细胞间的信号传递有着密切的关系,尤其在癌症的诊断及治疗等领域发挥重要作用。为将外泌体更好地应用于乳腺癌肿瘤传递机制的研究,本文首先通过分子克隆手段将近红外荧光蛋白iRFP682基因和外泌体标记蛋白CD63基因克隆到含腺相关病毒(Adeno-associated virus,AAV)末端倒置重复序列(Inverted repeat terminal,ITR)的质粒载体上,构建融合表达近红外荧光蛋白和CD63蛋白的重组真核表达载体。然后再与辅助质粒共转染AAV-293细胞,包装重组腺相关病毒、纯化测量滴度后用于感染乳腺癌细胞,最后通过荧光筛选出稳定表达近红外荧光蛋白的乳腺癌细胞株。通过对乳腺癌稳定株的分离、纯化及鉴定,最终得到一个新型生物标记物：iRFP682标记的乳腺癌细胞来源的外泌体,为后续研究外泌体在乳腺癌肿瘤微环境中的分布及信号传递提供保障。     

人类杀菌肽基因cDNA片段的克隆

采用RT－PCR方法,从慢性粒细胞白血病患者的外周血白细胞中扩增得到长度约为1.5kb的有类杀菌肽cDNA进一步得到长度约为600bp的该多肽的氨基端部分cDNA扩增产物,将上述两种长度的扩增产物分别克隆至pUCm-T载体中,为进一步开展该重组抗菌肽的表达和活性研究奠定了基础。     

2A肽介导猪PID1与CuZnSOD双基因真核共表达载体的构建与细胞表达

构建PID1基因与CuZnSOD基因的真核共表达载体,在PK15细胞中鉴定基因的表达。PCR扩增的PID1与CuZnSOD两基因分别经双酶切后定向插入pIRES2-AcGFP1空载体,构建pIRES2-CuZnSOD-PID1真核双表达载体并进行测序与酶切鉴定。采用脂质体转染法将重组质粒转染至PK15细胞,细胞内荧光显微镜下观察其荧光的表达,RT-PCR、Westernblot技术分别检测PID1基因与CuZnSOD基因mRNA和蛋白表达情况。重组克隆载体插入目的片段序列与PID1基因与CuZnSOD基因序列完全一致。PIRES2-CuZnSOD-PID1真核双表达载体测序、酶切鉴定结果与预期结果一致。荧光显微镜下观察转染后的PK15细胞出现绿色荧光。RT-PCR检测结果显示,转染细胞中PID1基因与CuZnSOD基因表达量明显高于对照组（P〈0.05）。Westernblot检测结果表明pIRES2-CuZnSODPID1真核双表达载体稳定有效表达。成功构建pIRES2-CuZnSOD-PID1真核共表达载体,且双基因在真核细胞独立稳定表达,为转基因猪等育种新材料的制备奠定基础。     

重组原核质粒GST-hTudor-SN-SN（1～4）的构建及表达

目的 将人类Tudor-SN（tudor staphylococcal nuelease）蛋白SN（1～4）基因片段分别定向连入pGEX-4T-1质粒,使Tudor-SN蛋白sN各功能片段与（;＂蛋白在大肠埃希菌BL21细胞内融合表达.方法 以重组质粒pSG5-Tudor-SN-flag为模板,PCR法扩增出目的 基因,利用EcoR Ⅰ和Sal Ⅰ双酶切法将目的 片段连接纠pGEX-4T-1载体卜,再将构建成功的GST-hTudor-SN-SN（1～4）重组质粒转化人大肠埃希菌BL-21内,IPTG诱导表达后再以考马斯亮蓝染色法检测GST融合蛋白的表达.结果 以单/双酶切和基因测序法鉴定构建的重组质粒均无误,考马斯亮监染色法观察到GST融合蛋白的正确表达.结论 重组原核GST.hTudor-SN-SN（1-4）质粒成功构建和表达.     

人Ⅱ型囊泡单胺转运体基因的克隆

目的 为获得人Ⅱ型囊泡单胞转运体（vesicular monomine transporter-2VMAT2)以治疗帕金森病,克隆添加Kozak序列的VMAT2cDNA,用于真核细胞表达。方法 从人胎脑中提取总RNA,逆转录成cDNA,设计一对引物用PCR方法扩增目的cDNA片段并将其重级一起pGEM-Easy-T载体中,酶切鉴定插入片段后,进行全序列测定。结果 RT-PCR扩增到1637bp的带有Kozak序列的cDNA片段。结论 克隆人VMAT2cDNA片断,可用于真核细胞表达。