结合光谱法在DMIs类杀真菌剂筛选中的应用

为建立一种快捷和准确的方法用于新型杀真菌剂的筛选,以外源表达的稻瘟菌羊毛甾醇14α-去甲基化酶为靶酶,以市售烯唑醇、戊唑醇、三唑醇、三唑酮为DMIs类杀真菌剂代表,分析了靶酶活性、靶酶纯度和靶酶浓度对二者结合光谱的影响,并与生物测试结果比较分析其可靠性。结果表明靶酶的高活性、无其他P450干扰和合适的靶酶浓度是获得准确结合光谱的必要条件。烯唑醇、戊唑醇、三唑醇、三唑酮与靶酶结合常数(Kd)分别为0.143μmol/L、0.24μmol/L、0.257μmol/L、0.307μmol/L,该结果与其对稻瘟菌生长抑制能力(120h-EC50)显著相关,证明结合光谱法可作为一种简便可靠的DMIs类杀真菌剂筛选方法。     

病原性曲霉三唑类药物耐药机制的研究进展

近年来随着免疫抑制人群的不断增加,侵袭性曲霉病的发病率不断增高。然而随着三唑类药物在临床上的广泛使用,病原性曲霉对三唑类药物的耐药率逐渐增加,是临床治疗重大挑战。文中综述了病原性曲霉对三唑类药物耐药机制的研究进展。曲霉对三唑类药物的耐药机制主要包括cyp51的突变与过表达、药物外排泵的过表达、应激适应通路的激活、生物膜的形成,以及脂质合成相关基因参与而导致的耐药。     

酵母菌Y12667 ERG11基因删除及验证研究

采用同源重组的方法删除酵母茵Y12667内源ERG11基因.并用PCR、Western、细胞计数和GC-MS的方法分别在基因水平、蛋白水平、细胞水平和功能代谢水平进行验证.结果表明,本研究成功删除了酵母茵Y12667内源ERG11基因,该基因删除茵能稳定表达外源性白念珠茵ERG11基因的同源蛋白.因此,该基因删除茵可作为下一步靶酶蛋白功能研究的基因工程表达操作茵.     

抗真菌药物作用靶酶羊毛甾醇14α去甲基化酶研究

羊毛甾醇14α去甲基化酶是普遍存在于高等植物、真菌和哺乳动物体内的P450蛋白,是氮唑类抗真菌药物作用靶酶.到目前为止已分别确定了高等植物、真菌和哺乳动物体内该酶的氨基酸序列.该酶对底物的催化包括三个单加氧步骤,涉及自由基的生成和消除,血红素辅基在酶催化过程中起重要作用.底物羊毛甾醇只能结合在酶活性位点血红素辅基Nc吡咯环上方,其余血红素吡咯环被氨基酸残基封闭.底物羊毛甾醇的3β羟基、Δ⁸⁽⁹⁾双键和17位侧链是与酶活性位点正确结合的关键官能团.该酶两大类抑制剂(底物类似物和氮唑类抗真菌药物)结构-活性关系研究可为进一步优化和设计新型高效酶抑制剂提供基础.     

新型微生物杀真菌剂诺沃霉素稳定性研究

诺沃霉素是一种新型微生物杀真菌剂,具有广谱抗真菌活性。该产物目前用于农作物杀菌剂的开发。为评价该化合物的开发前景,进行了诺沃霉素在加热、光照、室温贮存等条件下的稳定性测试。结果表明,诺沃霉素在环境pH 5.0~6.0时较为稳定,对紫外线及阳光有较好的稳定性。诺沃霉素水乳剂稳定性较差,但制成可湿性粉剂后,基本满足农药稳定性要求。     

白色念珠菌羊毛甾醇14α-去甲基化酶三维结构分子模型研究

基于四种原核细胞色素Ｐ４５０晶体蛋白Ｐ４５０ＢＭ３、Ｐ４５０ｃａｍ、Ｐ４５０ｔｅｒｐ、Ｐ４５０ｅｒｙＦ模建白色念珠菌羊毛甾醇１４α－去甲基化酶三维结构。序列匹配采用四种晶体结构比较结果基础之上提出的细胞色素Ｐ４５０超家族蛋白基于结构知识的序列匹配方法。以Ｐ４５０ＢＭ３晶体结构坐标模建目标蛋白结构保守区主链结构,结构保守区侧链构象来源于四种晶体蛋白与模建蛋白对应残基同源性得分最高残基构象。模建结果用分子力学和分子动力学进行结构优化,模建结果蛋白采用Ｐｒｏｆｉｌｅ－３Ｄ图、Ｒａｍａｃｈａｎｄｒａｎ图和疏水图分析确证结构的合理性。并根据模型推测与血红素辅基相互作用的残基、与氧化还原偶联蛋白作用和参与电子传递的残基、底物进出通道和活性位点的残基。这些研究结果为定点突变研究、抗多肽抗体结合实验等提供理论依据,为高效低毒抗真菌药物合理设计提供靶标。     

施磷和杀真菌剂对黄顶菊生长及生理代谢的影响

以黄顶菊为供试植物,通过盆栽试验研究土壤真菌在其入侵过程中的作用,揭示黄顶菊入侵的土壤微生物学机制.试验设置5个施磷( KH2PO4)水平(50 mg·kg-1CaSO4,缺磷处理,P0;空白,不加磷处理,P1;20 mg· kg-1,P2;40 mg·kg-1,P3;80 mg· kg-1,P4),并通过施用杀真菌剂苯菌灵控制土壤真菌,研究二者对黄顶菊入侵性的影响.杀真菌剂处理显著降低了黄顶菊的菌根侵染率,抑制了植株光合作用,降低了植株生物量、可溶性糖的积累及抗氧化保护酶系统(SOD、POD和CAT)活性,在较高施磷水平时(P3、P4)增加植株全P含量,而对植株叶绿素、可溶性蛋白、全N含量等无显著影响.施用磷肥引起的植物磷营养状况的改变,对土壤真菌具有一定的调控作用,真菌效应的发挥因施磷量不同而发生变化,在缺磷和低磷处理(P0～P2)时,真菌对N、P吸收贡献率表现为正效应;而当施磷量较高(P3、P4)时,贡献率表现为负效应.土壤真菌和养分状况对黄顶菊的生长和生理代谢均有重要影响.     

水分胁迫和杀真菌剂对黄顶菊生长和抗旱性的影响

利用盆栽试验研究水分胁迫下AM真菌对黄顶菊生长和抗旱性的影响,揭示黄顶菊入侵过程中的微生物学机制。以苯菌灵为杀真菌剂,在土壤相对含水量为120%、80%、40%和20%条件下,分别设灭菌和不灭菌两种处理。结果表明,水分胁迫显著降低了黄顶菊株高、干重和主根长,而对AM真菌侵染率无显著影响。施用苯菌灵显著降低了菌根侵染率、叶片保水力、保护酶活性、可溶性糖和可溶性蛋白含量,提高了MDA含量。不灭菌处理下黄顶菊植株对土壤有效N和有效P的利用率较高,且植株全N、P含量显著高于灭菌处理,菌根贡献率随土壤相对含水量降低而逐渐提高,重度胁迫分别是渍水条件下的1.84和1.88倍。土壤水分状况和AM真菌的交互作用对黄顶菊生物量和生理指标影响显著。AM真菌共生能够促进黄顶菊根系对土壤水分和矿质营养吸收,改善植物代谢活动,提高抗旱性。实验结果为黄顶菊合理防控措施的制定提供了依据,同时作为丛枝菌根的基础性研究也具有重要的意义。     

反向筛选标记基因upp在杀真菌链霉菌遗传改造中的应用

为进一步简化放线菌的遗传操作流程,缩短重组菌株的筛选周期,在对杀真菌链霉菌(Streptomyces fungicidicus ATCC 21013)进行遗传操作的过程中引入了一个反向筛选标记基因——尿嘧啶磷酸核糖转移酶基因(upp)。并通过原始菌株中upp基因的敲除,以及带有upp基因的自杀型基因敲除载体的构建,开发了一套完整的针对杀真菌链霉菌的无痕敲除系统。通过载体的整合、二次交换及反向筛选实现了杀真菌链霉菌基因组中StrR基因的快速无痕敲除。upp反向筛选标记基因的引入使得链霉菌重组菌株的平均筛选周期缩短了2周左右,并进一步减少了假阳性重组菌株出现的概率,可实现放线菌中目的基因的连续无痕敲除,因此值得进一步推广和应用。     

动物模型在HIV-1杀微生物剂有效性和安全性评价中的应用

HIV/AIDS的流行趋势没有减弱的迹象,人们迫切需要新的预防HIV传播的手段。杀微生物剂旨在通过局部用药于阴道或直肠从而阻止HIV的传播。鉴于目前有大量的杀微生物剂候选物,亟待能够有效评价其有效性及安全性的动物模型。通过比较非灵长类小型动物模型与非人灵长类动物模型在评价HIV杀微生物剂的有效性及安全性上的重要作用,本文总结了评价杀微生物剂有效性及安全性的动物模型的优缺点,同时指出了杀微生物剂研究与发展的方向和建议,希望能够对杀微生物剂的研发有所帮助。     

拮抗木霉耐多菌灵菌株的筛选

该文进行了耐多菌灵生防木霉菌株的筛选和生防效果的测定研究。为获得对灰葡萄孢霉等病原菌有显著拮抗能力的耐多菌灵木霉菌株,通过含药平板诱导和紫外线诱变,获得5株耐药性菌株,在多菌灵2.0g/L浓度下生长较好,Ec50值提高了40多倍;抗性菌株在含药培养基上连续继代转移培养10次,抗性程度未见下降;经过平板对峙和活体拮抗性测定,确定T42-2为最佳拮抗性耐多菌灵菌株,其对黄瓜灰霉病的防效达92.13%,并且对多菌灵、速克灵和三唑铜存在交互抗性。     

利用噬菌体表面展示技术筛选转铁蛋白黏附肽的研究

为了筛选转铁蛋白黏附肽,应用噬菌体表面展示技术经过三轮生物淘选,成功地从随机七肽库中得到黏附转铁蛋白的重组噬菌体克隆,经过相对亲和力常数测定和DNA测序得到4个转铁蛋白黏附肽的序列。实验中以回收率和选择比为操作参数,对淘选进行了优化,并发展了一种基于噬菌体滴度的相对亲和力常数测定方法。转铁蛋白受体是一种有效的肿瘤标记物,利用转铁蛋白为载体可以实现药物靶向运输,因此转铁蛋白黏附肽将是重组蛋白质药物连接转铁蛋白的有用标签。     

Application of Biofilm-Forming Bacteria on the Enhancement of Organophosphorus Fungicide Degradation

This study aimed to develop technology enhancing the biodegradation efficacy against organophosphorus fungicide with biofilm-forming bacteria in situ. Using the crystal violet staining method, two bacterial strains having biofilm formation capability were isolated and identified as Pseudomonas sp. C7 and Bacillus sp. E5. Compared with the culture of tolclofos-methyl degrader Sphingomonas sp. 224, biofilm formation was improved by co-inoculation with biofilm-forming bacterium Bacillus sp. E5. Evaluated in liquid culture conditions, this two-species mixed consortium was observed to degrade tolclofos-methyl more effectively than Sphingomonas sp. 224 alone, with an approximately 90% degradation efficiency within 48 h of dosing. The improved effectiveness of the consortium biofilm was reflected using soil in situ with an approximately 7% increased degradation ratio over Sphingomonas sp. 224 alone. This is the first report demonstrating improved bioremediation degradation efficacy against tolclofos-methyl exhibited by a consortium biofilm. This work presents a possible effective bioremediation strategy using a specific biofilm composition against pollutants containing organophosphorus compounds in situ.     

稻瘟菌CYP51蛋白F螺旋区保守氨基酸残基与

【目的】研究稻瘟菌CYP51蛋白F螺旋区保守氨基酸残基与烯唑醇的相互作用机制,为稻瘟病菌新型高效特异杀菌剂的开发提供理论依据。【方法】设计稻瘟菌CYP51蛋白F螺旋区保守氨基酸残基突变体P222C、P222H、I223A、I223W、N224A、N224S,截去N端跨膜区36个氨基酸后,在大肠杆菌BL21(DE3) Rosetta菌株中过量表达,采用结合光谱法分析诱导蛋白对烯唑醇的结合能力。【结果】表达的目标蛋白均保持了对药物的结合能力,呈现出II型的结合光谱曲线。相对于野生型蛋白,突变体I223W和I223A对烯唑醇的结合常数Kd值基本不变,N224S、N224A、P222C的Kd值都略有增大,无显著性差异(P>0.05),但是,P222H的Kd值有了显著的增大(P<0.05),表明突变体P222H对烯唑醇的亲和能力显著降低。【结论】稻瘟菌CYP51 P222位点的疏水性与药物结合密切相关。     

Binding of51Cr to human erythrocytes

Radioactive chromium accumulated in human erythrocytes exists in two forms: one bound to macromolecules, e.g., hemoglobin, and one in a low molecular weight form. Both forms are released from cells either spontaneously or as a result of toxic induction.     

Binding of phytochrome to plasma membranes in vitro

Nicotiana tabacum (cv. Xanthi), N. plumbaginifolia Viviani, N. sylvestris Speg. and Comes and Petunia axillaris × ( P. axillaris × P. hybrida ) (cv. Mitchell) mesophyll protoplast-derived cells were able to grow at low densities in chemically-defined media. Protoplasts of different origins (mesophyll, epidermis, pith, suspension culture) also gave rise to protoplast-derived cells that were able to grow at low densities. When auxin requirements at low densities were compared for different sources of auxins, IAA was found to be efficient in the same range of concentrations as NAA. This was unexpected since tobacco mesophyll protoplasts cannot be induced to divide when plated at high density in the presence of IAA. Optimal 2,4-D concentrations for low density growth were higher and clearly pH-dependent. On the contrary, picloram induced low density growth over a wide range of concentrations suggesting a distinct mechanism of action. These results confirm and extend previous observation on the tobacco mesophyll protoplast and show that the low-density growth technique has a potential use for the study of the action of phytohormones.     

Binding mode of a cationic porphyrin to parallel and antiparallel thrombin binding aptamer G-quadruplex

Abstract

The spectral properties of meso-tetrakis (N-methylpyridinium-4-yl)porphyrin (TMPyP) in the presence of parallel and antiparallel G-quadruplexes formed from a thrombin-binding aptamer G-quadruplex (5′-G₃T₂G₃TGTG₃T₂G₃) were investigated in this study. Red shift and hypochromism in the Soret absorption band of TMPyP were observed after binding to both parallel and antiparallel G-quadruplexes. The extent of changes in the absorption spectra were similar for both conformers. No circular dichroism spectrum was induced in the Soret region for both parallel and antiparallel G-quadruplexes. This is suggest that there is no or very weak interaction between electric transitions of nucleobases and porphyrin molecule. The accessibility of the neutral quencher I₂ to the G-quadruplex-bound TMPyP was similar for both parallel and antiparallel G-quadruplexes. All these observations suggest that TMPyP was bound at the outside of the quadruplexes, and conceivably interacted with the phosphate group via a weak electrostatic interaction.

Communicated by Ramaswamy H. Sarma     

邻苯二甲酸酯类污染物雌激素结合活性筛查

以倏逝波光纤荧光生物传感器为平台,以邻苯二甲酸酯类(PAEs)污染物为靶标,优化了基于受体作用理论的生物传感分析技术,实现了PAEs雌激素结合活性的定性筛查。对7种典型邻苯二甲酸酯的雌激素结合活性测试结果为BBP>DBP>DIPP,其他4种物质几乎无雌激素结合活性,结果与文献广泛报道结论相一致,验证了所建立方法的准确性。在最优测试条件下,光纤传感界面可再生300次以上,为雌激素活性污染物的筛查提供了一种低成本、自动化方法。