黄瓜膨胀素的重组表达及活性分析

目的:提高纤维素的酶水解效率和开发高效的纤维素酶水解过程。方法:采用RT-PCR方法从黄瓜胚轴细胞中分离了膨胀素S1的cDNA,并使之与毕赤酵母表达质粒pPICZ(A连接,形成重组质粒pPICZ(A-exs1。通过电转化方法,用质粒pPICZ(A-exs1转化巴氏毕赤酵母GS115,得到重组菌株P.pastoris-exs1。在该重组菌株中,膨胀素的基因通过同源重组整合在毕赤酵母的染色体上,并处于毕赤酵母甲醇氧化酶启动子的下游。重组菌株P.pastoris-exs1在甲醇诱导下可合成并分泌膨胀素。结果:培养上清液没有纤维素酶活性,但具有破坏滤纸纤维素结晶结构的能力。培养上清液与里氏木霉纤维素酶等量混合后,可使纤维素酶的滤纸酶活力提高50%。结论:采用巴氏毕赤酵母GS115重组成功表达了黄瓜膨胀素,其表达产物可以促进纤维素酶对滤纸的水解。     

稳定表达MVA途径基因提高番茄红素产量

萜类化合物的直接前体物质异戊烯焦磷酸(IPP)和二甲基烯丙基焦磷酸酯(DMAPP)可以由2-甲基-D-赤藻糖醇-4-磷酸途径(MEP途径)和甲羟戊酸途径(MVA途径)合成。在已经优化MEP合成途径、番茄红素合成途径关键基因表达的重组大肠杆菌LYC101中,引入MVA途径基因,进一步提高重组大肠杆菌合成萜类化合物的能力。质粒pALV23和pALV145是本实验室在研究MVA途径基因协调表达时,用核糖体结合位点(RBS)文库连接MVA途径各基因构建质粒文库,而筛选到的有效提高β-胡萝卜素产量的质粒。首先比较了两个质粒分别在低产和高产番茄红素的菌株中对番茄红素合成的影响。结果表明,两个质粒在高、低产番茄红素的菌株中都可以有效提高番茄红素产量。在高产菌LYC101中pALV23比pALV145使番茄红素产量更高。然后,用CRISPR-Cas9系统辅助同源重组的方法,将MVA途经基因和启动子一共6.7kb的条带整合到LYC101菌株的染色体上,得到遗传稳定的菌株LYC102。LYC102的番茄红素产率达40.9mg/g,是出发菌株LYC101产率的2.19倍,比用质粒表达MVA途径基因的菌株提高了20%。在重组大肠杆菌中同时表达MVA途径和MEP途径,可以有效提高萜类化合物产率;文中构建了不含质粒的、遗传稳定的高产番茄红素菌株,为产业化合成番茄红素提供基础;同时构建平台菌株,可以用于其他萜类化合物合成。     

一株降解纤维素放线菌的产纤维素酶基因克隆与表达

【背景】纤维素在自然界中储量丰富,但天然纤维素的难降解性成为广泛应用纤维素资源的壁垒,近年来利用微生物来降解纤维素成为热点研究。【目的】筛选分离得到一株具有降解纤维素功能的放线菌菌株Lb1,通过全基因组测序确定其产纤维素酶关键基因5676,对基因5676进行克隆转化,使其在大肠杆菌中进行表达。【方法】通过基因工程技术将产纤维素基因连接到表达质粒上并导入表达菌株,对其降解纤维素生成葡萄糖的能力进行探究。【结果】将Lb1菌株的16S rRNA基因进行比对,确定菌株Lb1属于链霉菌属,命名为Streptomyces sp. Lb1。成功构建出纤维素酶表达载体,并且导入表达菌株大肠杆菌BL21(DE3),重组菌株的产纤维素酶能力大于空载菌株。【结论】通过基因工程技术成功克隆出产纤维素酶基因,从而表达纤维素酶,为今后利用微生物降解纤维素的大规模应用提供参考。     

基于一体化生物加工过程的木质纤维素合成生物丁醇的研究进展

一体化生物加工过程 (Consolidated bioprocessing,CBP) 是在一个生物反应器中完成水解酶生产、酶解、微生物发酵等多步生物过程的工艺。因其过程步骤简单、成本低,被认为是生产二代生物燃料最具发展前景的工艺。然而,由于木质纤维素降解与丁醇合成路径的复杂性,鲜有天然微生物可以直接利用木质纤维素合成丁醇。随着合成生物学技术的发展,在纤维素降解梭菌中引入丁醇合成途径,可以使单菌利用木质纤维素直接合成丁醇。但是该策略存在菌株代谢负荷重、丁醇产量低等问题。而混菌策略可以通过不同菌株的劳动分工,使单菌代谢负担得到缓解,因此进一步提高了丁醇合成效率。文中从单菌策略和混菌策略分析了近年来一体化生物加工过程利用木质纤维素合成丁醇的相关研究进展,为生物丁醇以及其他生物燃料的一体化生物加工过程研究提供借鉴。     

居瘤胃解纤维素菌细胞密度与纤维素酶的合成

居瘤胃解纤维素菌(Cellulosilyticum ruminicola)H1是本实验室分离自青海牦牛瘤胃的一株新的纤维素降解细菌。前期研究发现,菌株H1在滤纸纤维素上连续传代数次后无法生长,只有在纤维素降解产物纤维二糖中培养后方能继续在纤维素中生长,并恢复其纤维素降解活性。这与纤维素酶合成受"代谢产物抑制"的传统认识相悖。【目的】证明菌株H1的纤维素酶合成受细胞密度调控。【方法】检测菌株H1的纤维素酶活和转录水平在高和低密度细胞培养物中差异,并检测高密度细胞培养物中的寡肽对低密度细胞纤维素酶活和转录水平的促进作用。【结果】菌株H1的高密度细胞培养物的纤维素酶活和转录水平比低密度细胞的高3-10倍;并且高密度细胞培养液能显著提高低密度细胞纤维素酶活和转录水平。【结论】居瘤胃解纤维素菌(Cellulosilyticum ruminicola)H1纤维素酶的合成受细胞密度调控。     

大肠杆菌holo-ACP的过表达、分离纯化及长链脂酰ACP的合成

[目的]获得高纯度大肠杆菌holo-ACP和多种长链脂酰ACP,为研究细菌脂肪酸、类脂A和N-酯酰高丝氨酸内脂等物质的合成提供底物.[方法和结果]采用PCR方法扩增得到大肠杆菌酰基载体蛋白基因(acpP)和holo-ACP合成酶基因(acpS).使用载体pBAD24、pBAD34和pET28b分别克隆了acpP和acpS,得到pBAD-ACP、pET-ACP和pET-ACP-ACPS 3个ACP表达质粒和一个AcpS表达质粒pBAD-ACPS.分别用3个ACP表达质粒转化大肠杆菌DH5a和BL21(DE3),构建了DH5αpBAD-ACP、BL21(DE3)/pET-ACP和BL21(DE3)/pET-ACP-ACPS 3种ACP生产菌株.与holo-ACP纯化常用菌株DK574相比,虽然三菌株在诱导时均能过量表达ACP,但是holo-ACP所占比例偏低.为了提高ACP生产菌株holo-ACP的产量,用质粒pBAD-ACPS分别转化上述3种ACP生产菌株,获得了3种携带双质粒的ACP生产菌株.表达结果显示携带pBAD-ACP和pBAD-ACPS双质粒的DH5a菌株比DK574菌株能产生更多的holo-ACP,且纯度也得到提高(纯度达99%).同时使用UNOsphere Q阴离子交换层析从这一菌株培养物中分离纯化到了高纯度的holo-ACP,并以纯化到的holo-ACP和多种长链脂肪酸为底物在哈氏弧菌脂酰ACP合成酶的催化下,合成了多种长链脂酰ACP.[结论]通过研究获得一株holo-ACP高产菌株,并证明在大肠杆菌菌株中,同时表达acpP基因和acpS基因,有利于holo-ACP的产生.     

苏芸金杆菌的质粒检测及载晶体蛋白合成基因的质粒在不同菌株间的传递

分析了苏芸金杆菌(Bacillus thuringiensis)7个变种19个野生菌株及无晶体(sp+cr-)和无芽孢(sp-cr+)突变株的质粒图型,证实了苏芸金杆菌的质粒组成既有变种的特异性,亦有菌株的特异性。载有晶体蛋白质合成基因的质粒,B. thuringiensis var．Kurstaki HD-191 菌株可能为42和50Mdal,B．Thuringiensis var. aizawai HD-282菌株为47Mdal, B．Thuringiensis var．Israelensis IPS-82菌株为57Mdal的质粒,而B．Thuringiensis var. wuhanensis 140 菌株的此种基因则可能不在质粒上而在染色体中。HD-191载晶体蛋白合成基因的质粒以很高频率被传递给其无晶体突变株HD-1并在后者细胞中表达。B. thuringiensis var. israelensisIPS-82菌株和 B．Thuringiensis var. kurstaki 无晶体突变株HD—1之间载晶体蛋白合成基因质粒的传递未能成功,提示可能存在着不相容性的障碍。     

提高大肠杆菌通过MVA途径合成异戊二烯

异戊二烯是橡胶合成的重要前体物质。为了提高菌株的异戊二烯产量,本实验室在研究中构建了一株异戊二烯产气的菌株BW-01,基于蛋白质预算理论的指导,理性设计通过改变质粒拷贝数、增加稀有密码子等合成生物学手段调控关键限速酶编码基因表达,从而提高大肠杆菌外源MVA代谢途径的异戊二烯产量。摇瓶发酵实验中我们构建的新产气菌株BW-07比原有的产气菌株BW-01的产量提高了73%,达到了761.1 mg/L。为后续菌株改造及进行发酵罐实验奠定了基础。     

嗜温性乳链球菌质粒的分离及其DNA同源性的研究

分离10株嗜温性乳链球菌的质粒,DNA的电泳图表明,不同菌株中有2至9个质粒,其分子量从 2.8到80k6不等。用”p标记已知的质粒pUCL22(55kb）和pUCL22的1.3kb,4.4kb DNA片段分 子探针,分别与被研究的乳链球菌的质粒杂交,放射自显影结果证明,一些菌株的某些质粒与pUCL22 探针和其DNA片段探针有同源性。质粒pUCL22探针检验出菌株L72, D47中的80kb的质粒,该 质粒在电泳图中没有看到。     

筛选微生物降解木质纤维素的研究进展

木质纤维素资源是自然界中含量丰富的可再生资源,利用微生物降解木质纤维素是一种重要的策略。在综合国内外对木质纤维素降解微生物的筛选方法和研究策略的基础上,从单一菌株、复合微生物菌系和组学技术三个方面对筛选微生物降解木质纤维素进行了总结和分析,阐述了各个策略的优势特点和应用价值,即单一菌株易于培养但降解能力较低,复合菌系降解能力强但传代稳定性较差,组学技术能够更好的解释微生物降解木质纤维素的机理,为筛选木质纤维素降解微生物提供一定的指导。同时提出使用合成生物学的策略进行相应微生物的筛选,旨在为筛选高效降解木质纤维素的微生物提供一定的参考。     

金霉素链霉菌无活性菌株回复突变的研究

近年来,在有关抗菌素合成途径的研究中,报道了由于产生遗传性障碍而不能合成抗菌素,亦即产生了“零”突变菌株。又在次级代谢途径障碍性菌株的回复突变研究中,报道了能使抗菌素产量大幅度提高的回复突变型菌株。我们在对产金霉素链霉菌(Streptomyces aureofaciens)菌株进行诱变试验中,筛选到一些     

我国植物青枯菌的内生质粒及其与致病性的关系

检测了来自我国不同地区的龙葵、苎蔗、芝蔗、木蔬黄、油橄榄、桑、烟草、姜、辣椒、茄、蕃茄、甘薯、花生和马铃薯等14种寄主植物的51株野生型青枯菌的内生质粒(1ndigesPlasmid),并对其中20株野生型菌株及其相应的20株“突变型”菌株进行了质粒的比较研究。14株野生型菌株和10株“突变型”菌株含有1或2个质粒,质粒分子量不一,最小的在5Md以下,最大的为120Md。有些野生型菌株(ssl、Snl、E4、Pc2、Tin9、Z2、P3、PoI、P03、Po¨．)和它们的“突变型”菌株均不含质粒;另一些野生型菌株(MS、M6、El、P9．)和它们相应的“突变型”菌株却具有电泳迁移率相同的质粒;这些菌株的致病性与质粒的存在没有关系。但某些野生型菌株(P7、P8。zl、z3、M2、P041．)不含质粒,而它们的“突变型”菌株中却出现了质粒,这些菌株的致病性的丧失与质粒的形成之间可能有关。     

纤维素酶基因在毕赤酵母中的拷贝数对其表达的影响

将PCR扩增得到的瑞氏木霉纤维素内切酶Ⅲ(Endo--β1,4-glucanaseⅢ,EGⅢ)基因片段插入巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)质粒pPIC9K中,构建了EGⅢ的分泌表达质粒pPIC9K-eg3,然后经线性化后电转化导入P.pastorisGS115受体菌中。获得的阳性克隆经SDS-PAGE和酶活检测,证明工程菌株发酵上清液中含有表达的EGⅢ蛋白并具有纤维素内切酶酶活。通过荧光定量PCR确定了各菌株的拷贝数并对不同拷贝数范围的菌体生长和EGⅢ的表达做了比较。实验结果表明,低拷贝重组菌有着相对较好的EGⅢ表达量。     

甾醇C-24甲基转移酶基因在酿酒酵母中的内源表达及工程菌麦角甾醇的合成

通过高保真PCR克隆到含酿酒酵母甾醇C-24甲基转移酶基因编码序列及终止子序列的DNA片段ERG6, 以大肠杆菌-酿酒酵母穿梭质粒YEp352为载体, 磷酸甘油酸激酶基因PGK1启动子为上游调控元件构建了酵母菌表达质粒pPERG6。通过同源重组, 以铜离子螯合蛋白基因CUP1替换染色体上ERG6基因内部序列获得ERG6破坏菌株YS58-erg6, 其中麦角甾醇的合成被阻断, 同时细胞的生长也受到明显抑制。表达质粒pPERG6转化破坏菌株YS58-erg6后, 不但使细胞恢复了合成麦角甾醇的能力, 细胞生物量也得到明显提高, 这说明表达质粒上的ERG6基因得到了功能性的表达。分别用载体质粒YEp352和表达质粒pPERG6转化酿酒酵母单倍体菌株YS58, 获得对照菌株YS58(YEp352)和重组菌株YS58(pPERG6)。重组菌株YS58(pPERG6) 生物量和麦角甾醇含量分别是对照菌YS58(YEp352)的1.23和1.32倍。可见甾醇C-24甲基转移酶基因的高表达可以增强酵母细胞麦角甾醇的合成能力。     

1株来自瘤胃液菌株RB1在降解秸秆中的作用

木质纤维素中木糖残基大量乙酰化,导致半纤维素的降解受阻。半纤维素支链水解断裂,可以解除其空间位阻效应,利于木质纤维素彻底降解。采用产乙酰酯酶活力较高的菌株RB1降解玉米秸秆和水稻秸秆。研究结果表明,菌株RB1对玉米秸秆和水稻秸秆中半纤维素降解率分别高达53.87%和51.67%。同时该菌株对秸秆中木质素降解率分别达到35.50%和35.01%。该菌株与其他降解纤维素能力较强的菌株共同发酵,会对木质纤维素类物质有更高降解率。该菌株在生物转化木质纤维素类物质方面,具有一定的潜在应用价值。     

一种溶菌酶样蛋白对肺炎链球菌毒力及荚膜多糖合成的影响

摘要：【目的】为了研究肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae, S.pn）的一种假想的溶菌酶样蛋白在细菌生物学性状及其致病中的作用。【方法】利用长臂同源PCR对该基因进行敲出,并同时构建带有拯救质粒的缺失菌株,观察D39野生菌、缺失菌与带有拯救质粒的缺失菌株在相关生物学性状及其致病力改变,从而鉴定这种假想溶菌酶样蛋白的功能。【结果】缺失菌与野生菌相比,细菌生长减缓,毒力下降,荚膜多糖合成明显减少。而将拯救质粒转入缺失菌株后,该溶菌酶样蛋白的mRNA表达水平较野生菌高,其毒力及荚膜合成     

一株产ε-聚赖氨酸的白色链霉菌遗传转化体系

为了更好地研究ε-聚赖氨酸(ε-PL)生物合成的分子机制以及构建ε-PL高产基因工程菌株,拟建立一株ε-PL产生菌株Streptomyces albulus PD-1的遗传转化体系。通过对培养基类型、孢子预萌发处理、培养基中Mg2+浓度等条件进行考察,以Escherichia coli ET12567(p UZ8002)为供体菌,成功地将p IB139质粒导入S.albulus PD-1中。结果表明:质粒转化效率达到(3±0.4)×10-6个接合转化子/受体。接合子传代实验和PCR结果发现,p IB139质粒能够稳定整合在S.albulus PD-1染色体的att B位点上。本研究建立了一株ε-PL生产菌株的遗传转化体系,为从分子水平上研究ε-PL的合成及ε-PL高产菌株的构建奠定了基础。     

甾醇C-22去饱和酶高表达对酵母细胞麦角甾醇合成的影响

通过PCR扩增克隆到酵母菌甾醇C-22去饱和酶基因(ERG5)的编码序列及其终止子序列,以大肠杆菌-酿酒酵母穿梭质粒YEp352为载体,以磷酸甘油酸激酶基因PGK1启动子为上游调控元件构建了酵母菌表达质粒pYPE5。以铜离子螯合蛋白基因CUP1替换ERG5基因内部序列获得ERG5破坏菌株YSE5,其中麦角甾醇的合成被阻断,而积累了甾醇中间体Ergosta-5,7-dien-3β-ol。表达质粒pYPE5转化破坏菌株后使细胞恢复了合成麦角甾醇的能力。说明表达质粒上的ERG5基因得到了功能性的表达。将表达质粒pYPE5转化酿酒酵母单倍体菌株YS58,通过营养缺陷互补筛选到重组菌株YS58(pYPE5)。对重组菌株、破坏菌株和互补菌株细胞甾醇组分和含量进行测定,发现重组菌株和互补菌株的麦角甾醇和总甾醇含量明显低于对照菌YS58(YEp352)。测定不同培养时间细胞的麦角甾醇含量,发现重组菌株的麦角甾醇含量始终低于对照菌YS58(YEp352)。可见,ERG5在酵母中的高表达导致细胞麦角甾醇含量降低。     

整肠生菌株遗传稳定性及质粒研究

目的考察整肠生菌株在传代过程中的遗传稳定性,研究其耐药性与质粒的关系。方法联合使用表型和RAPD测试,对整肠生菌株在传代过程中的遗传稳定性进行分析,对菌株进行抗生素药敏试验和质粒检测,利用溴化乙锭消除质粒,比较消除前后耐药性的改变。结果在传代过程中不同代次的整肠生菌株表型特征和遗传学特性无变化,整肠生菌株无质粒。结论整肠生菌株在25代以内遗传稳定,能安全用于生产,菌株耐药性与质粒无直接相关性。     

过表达tRNA基因tL(CAA)K提高酿酒酵母乙酸耐受性

乙酸是木质纤维素类生物质水解液中的常见毒性抑制物,选育乙酸耐受性好的酿酒酵母菌株,有利于高效利用木质纤维素类生物质,发酵生产生物燃料和生物基化学品。目前对酿酒酵母抗逆性的研究多集中在转录水平,但对转运RNA (Transfer RNA,tRNA) 在耐受性中的作用研究较少。在对酿酒酵母抗逆性研究过程中发现,一些转运RNA基因在耐受性好的酿酒酵母菌株中转录明显上调。本文深入分析了精氨酸tRNA基因tR(ACG)D和亮氨酸tRNA基因tL(CAA)K过表达对酿酒酵母耐受木质纤维素水解液的影响。结果表明,在4.2 g/L乙酸胁迫条件下进行乙醇发酵时,过表达tL(CAA)K的菌株生长和发酵性能均优于对照酵母菌株,乙醇生产强度比对照菌株提高了29.41%,但过表达tR(ACG)D基因的菌株生长和代谢能力较对照菌株明显降低,体现了不同tRNA的不同调控作用。进一步分析发现,过表达tL(CAA)K的重组酵母菌株乙酸耐受性调控相关基因HAA1、MSN2和MSN4等胁迫耐受性相关转录因子编码基因的转录水平上调。本文的研究为选育高效利用木质纤维素资源进行生物炼制的酵母菌株提供了新的改造策略,也为进一步揭示酿酒酵母tRNA基因表达调控对抗逆性的影响提供了基础。