一株培菌白蚁后肠木聚糖降解细菌的分离与鉴定

【目的】从培菌白蚁——黄翅大白蚁肠道微生物菌群中分离能降解木聚糖的细菌。【方法】以木聚糖为唯一碳源,利用刚果红染色,根据透明圈大小进行筛选。通过显微形态,革兰氏染色及16S r RNA基因序列分析进行菌株鉴定。二硝基水杨酸(DNS)法测定细菌生长过程中木聚糖酶酶活变化,比较酶活与菌株生长状况的关系。【结果】从黄翅大白蚁肠道中筛选到一株具有较高木聚糖降解活性的革兰氏阳性菌Mb1,16S r RNA基因序列分析表明为类芽孢杆菌属细菌,命名为Paenibacillus sp.Mb1。该菌培养72 h后菌体浓度达到最高,木聚糖酶酶活主要存在于培养液上清中,酶活在对数期增长快,在培养96 h时达到最高值,之后趋于稳定。【结论】从黄翅大白蚁肠道中分离出一株具有较高木聚糖酶活的类芽孢杆菌,可作为产细菌木聚糖酶的潜在优良菌株。     

嗜碱细菌Cellulomonas bogoriensis 69B4T木聚糖酶的表达纯化及性质研究

【目的】对嗜碱细菌Cellulomonas bogoriensis 69B4~T产碱性木聚糖酶进行研究,克隆来源于该菌株的木聚糖酶基因,并对其进行异源表达、纯化及酶学性质的表征,为后续研究碱性木聚糖酶的耐碱机制及应用奠定基础。【方法】采用单因素分析法对菌株产碱性木聚糖酶情况进行研究;通过基因组分析,锚定5个内切木聚糖酶基因,利用同源扩增的方法进行克隆,并在大肠杆菌中重组表达,利用亲和层析对重组酶进行纯化,以木聚糖为底物表征木聚糖酶的酶学性质。【结果】来源于C. bogoriensis 69B4~T的5种木聚糖酶Xyn370、Xyn393、Xyn425、Xyn466和Xyn486均在大肠杆菌内实现了异源表达,并经亲和层析获得纯酶组分,其最适反应温度分别为60、50、40、40、60°C,在50°C范围内保温2h,残余酶活均在90%以上;最适反应p H分别为7.0、8.0、8.0、8.0、9.0,在p H5.0–9.0时具有较好的稳定性;5种重组木聚糖酶对部分金属离子和高浓度盐表现出较好的耐受性,对榉木木聚糖的酶活性最高,均为内切型木聚糖酶。【结论】本研究表达纯化的5种重组木聚糖酶具有耐盐碱的优良特性,且对温度、某些金属离子和化学试剂耐受,为研究木聚糖酶的耐碱机制及工业应用提供了酶源。     

一株碱性纤维素酶产生菌的分离、鉴定及酶谱分析

目的:从土样中分离株碱性纤维素酶高产菌株.方法:利用CMC平板初筛,然后利用摇瓶复筛,筛选酶活力高的菌株,对分离出的一株高产菌株进行了鉴定并对其所产酶进行了酶谱分析.结果:获得一株碱性纤维素酶高产菌株H12,酶活力达到1.96U/ml.结论:该菌株呈长杆状、革兰氏染色为阳性、产芽孢;16S rDNA基因序列为1 419bp,与短小芽孢杆菌16S rDNA基因序列具有最高的同源性,基于16S rDNA基因序列的同源性分析以及系统发育分析等方面的多相分类研究,鉴定菌株H12为为短小芽孢杆菌;碱性纤维素酶的酶谱分析只有一条水解条带,酶分子量在75kD左右.     

同步分泌高效纤维素酶和木聚糖酶菌株YB的鉴定及其酶学性质研究

筛选和鉴定可降解木质纤维素的真菌,并研究其产酶特征。采用刚果红平板涂布法,从荔枝腐叶中筛选具有木质纤维素降解能力的真菌,结合ITS-rDNA序列分析进行鉴定,初步测定其产酶条件,然后采用DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换层析与Sephadex G-100凝胶层析对硫酸铵沉淀的粗酶液进行分离纯化,对其开展酶学性质研究。结果显示,筛选出一株可降解木质纤维素降解的菌株YB,鉴定为绿木霉(Trichoderma virens)。在发酵过程中,纤维素酶和木聚糖酶的最大活力分别为313.53±26.78 U/mL和18 120.87±500.37 U/mL。分离纯化得到纤维素酶(CMC酶)Ⅰb、Ⅳ和木聚糖酶Ⅰa;通过SDS-PAGE检测,其分子量分别为58.5 kD、22.8 kD和44.5 kD。3种酶的最适酶促反应条件均为:50℃,pH 5.0。其中,木聚糖酶能有效降解玉米芯木聚糖为木糖和多种木寡糖。菌株Trichoderma virens YB可分泌高效木质纤维素降解酶,具有应用于木聚糖酶和木寡糖生产的潜力。     

我国南北大豆产区慢生大豆根瘤菌的遗传多样性和系统发育研究

利用16S rRNA基因RFLP、16S rRNA基因序列分析以及16S-23S rRNA IGS PCR RFLP技术对分离自我国南北大豆产区的慢生大豆根瘤菌进行了群体遗传多样性和系统发育研究。16S rRNA基因PCR RFLP分析以及16S rRNA基因序列分析结果表明:所有供试慢生大豆根瘤菌可分为B.japonicum和B.elkanii两个类群,其中属于B.japonicum的为优势种群,占供试菌株的91%,属于B.elkanii的仅占9%,多样性水平较低。16S-23S rRNA IGS PCRRFLP研究结果表明:属于B.japonicum的慢生根瘤菌具有较丰富的遗传多样性,在69%的相似性水平上可分为群Ⅰ和群Ⅱ两大类群。群I的菌株以分离自黑龙江和河北等北部区域的菌株为代表,群Ⅱ的菌株以分离自广西和江苏等南部地域的菌株为代表,反映出明显的地域特征。两群菌株在系统发育上均与USDA6、USDA110和USDA122等B.japonicum的模式或代表菌株有差异。     

川中丘陵地区大豆根瘤菌遗传多样性与系统发育关系

【目的】研究分离自川中丘陵地区大豆根瘤菌的遗传多样性和系统发育。【方法】采用16S rDNA PCR-RFLP和16S rRNA基因、glnII、共生基因(nodC)系统发育分析的方法进行研究。【结果】供试未知菌的16S rDNA用4种限制性内切酶(HaeⅢ、HinfⅠ、MspⅠ及TaqⅠ)酶切后获得5种16S遗传图谱类型。16S rDNA PCR-RFLP结果表明,所有供试菌株在83%水平分为慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium)和中华根瘤菌属(Sinonrhizobium)两大类群,而75%的菌株为中华根瘤菌。6个代表菌株的16S rDNA、glnII和nodC三个位点基因的系统发育结果基本一致,4株与S.fredii USDA205T相似度最高;有2株分别与B.yuanmingense CCBAU10071T、B.diazoefficiens USDA110T相似度最高。4个Sinonrhizobium代表菌株16S rDNA、glnII序列相似度分别为98.3%-99.9%、98.2%-100%,但它们的nodC基因序列完全相同。【结论】川中丘陵地区大豆根瘤菌具有较丰富的遗传多样性,S.fredii为优势种。     

我国亚热带地区豌豆根瘤菌遗传多样性的研究

利用16S rRNA PCR-RFLP,16S rRNA基因序列分析以及16S-23S rRNA IGS PCR-RFLP技术对分离自我国江苏盐城、浙江温州、湖北仙桃及重庆等亚热带地区的42株豌豆根瘤菌（Rhizobium leguminosarum）进行了群体遗传多样性的研究．16S rRNA PCR-RFLP分析以及16S rRNA基因序列分析结果表明：所有供试豌豆根瘤菌可分为两个类群,类群1包括XtP1在内的40株豌豆根瘤菌和尺．leguminosarum USDA2370,为优势种群,占供试菌株的97％;类群2由WzP3和WzP15组成,与Rhizobium etli CFN42相近．16S-23S rRNA IGS PCR-RFLP研究结果表明：所有供试菌株分为18个基因型,在91％的相似性上分为4个类群．其中群Ⅰ与R．leguminosarum USDA2370聚在一起．群Ⅱ仅包括菌株YcP2,YcP3和CqP7等3个菌株．群Ⅲ的菌株分布较广,占供试菌株的优势．群Ⅳ由WzP3和WzP15两个菌株及R．etli CFN42组成．RAPD将供试菌株分为9个群,其中类群Ⅳ仅包括菌株YcP2,群Ⅴ和Ⅸ分别来自温州和仙桃．该结果表明,供试菌株的分类具有明显的地域特征．     

黑曲霉糖化酶和木聚糖酶基因在工业用酿酒酵母中的共表达

构建了黑曲霉糖化酶、木聚糖酶基因双表达的酵母YIp型载体pNEW4,通过与G418抗性质粒共转化,将糖化酶和木聚糖酶基因表达元件整合到多倍体酒精生产用酵母S. cerevisiae2.346染色体上,获得了整合型分泌表达这两种酶的工业酿酒酵母工程菌株GX11,研究了重组糖化酶和木聚糖酶在酵母工程菌中的表达及性质。     

黑曲霉原生质体诱变选育β-葡萄糖苷酶高产菌株

本研究报道了以原生质体诱变技术选育高产β-葡萄糖苷酶的黑曲霉菌株,并研究了其发酵特性。以黑曲霉CGMCC3.316为出发菌株,通过紫外诱变得到突变株3-3M。然后以3-3M为供试菌株,研究了其原生质体制备与再生的条件。最后通过原生质体诱变,选育得到一株β-葡萄糖苷酶活力较高的突变株60B-3D。该菌株具有良好的遗传稳定性,酶活力平均达到23IU/mL,与出发菌株CGMCC3.316相比提高39%。此外,该菌株的木聚糖酶活力也有所增加。同时考察了黑曲霉60B-3D的发酵特性,并与3-3M和出发菌株进行比较,结果表明该菌株有较高的蛋白分泌能力。本研究为发酵生产β-葡萄糖苷酶提供了一株良好的供试菌株。     

木聚糖酶生产菌株的筛选及产酶条件的优化

以甘蔗渣半纤维素为碳源,从垃圾场土壤中分离到6株分解半纤维素的菌株。通过固态发酵的木聚糖酶活力比较筛选到1株木聚糖酶活力较高的菌株。该菌株18S rDNA序列与曲霉（Aspergillus sp.）的同源性达97%,根据对菌株形态学分析和18S rDNA序列分析的结果,将该菌株鉴定为曲霉HQ3。HQ3的最佳产酶条件为：甘蔗渣:麸皮为7:3（W/W）,固液比为1:4（W/W）,尿素0.4 %,pH7.0,温度30℃,发酵产酶时间4 d。在最佳产酶条件下,其木聚糖酶活最高可达3421U/g干曲。     

不同紫花苜蓿品种根瘤菌遗传多样性的PCR-SSCP分析

用PCR-SSCP方法对分离自23个紫花苜蓿品种的42株供试根瘤菌和2株苜蓿根瘤菌参比菌株Sinorhi-zobium meliloti、Sinorhizobium medica进行遗传多样性分析.结果表明,供试的紫花苜蓿根瘤菌存在丰富的遗传多样性,在16S rDNA的V2~V3区段中有12种不同的等位基因,V4~V5区段有13种不同的等位基因,基因型27个;大部分供试菌株的基因型各不相同,来自同一品种菌株之间表现出不同的基因型,来自不同品种的菌株却表现出相同的基因型;9株供试菌株在V2~V3区段的基因型与参比菌株S.meliloti相同,所有供试菌株的基因型与参比菌株S.medica都不同.     

牦牛源木聚糖酶产生菌的筛选和鉴定

目的以牦牛粪便为样本,筛选并鉴定产木聚糖酶菌株。方法利用碱提取法从玉米芯中提取木聚糖,以自制木聚糖为唯一碳源,从牦牛牛粪中筛选产木聚糖酶细菌,利用16S rDNA基因序列分析鉴定菌种,3,5-二硝基水杨酸法(DNS)测定其产酶能力并分析所产酶的酶学特性。结果筛选获得牦牛源产木聚糖酶类芽胞杆菌,所产木聚糖酶的最适反应条件为50℃、pH 8.0,在pH值为7.0或8.0以及温度50℃条件下,表现出较好的稳定性,Mn~(2+)对酶活力具有显著抑制作用,该菌最佳发酵时间为12 h,酶活最高达到1.2 U/mL。结论该菌所产木聚糖酶能够针对性地降解玉米芯木聚糖,在畜牧业和工业上有一定的应用价值。     

耐碱性木聚糖酶基因在短小芽孢杆菌中高效分泌表达的研究

从木聚糖酶高产短小芽孢杆菌 (Bacilluspumilus)BP5 1中克隆得到木聚糖酶基因xynA ,将其构建在芽孢杆菌表达载体pWH1 5 2 0中得到重组质粒pWSX1 1。xynA由木糖诱导xylA启动子调控xynA表达。采用同源高效表达策略 ,以原生质体转化方法将pWSX1 1转回原始菌株BP5 1中 ,获得重组菌株BPX1 1。通过木糖诱导重组菌株中的xy nA基因高效分泌表达 ,使木聚糖酶产酶活力比原菌株BP5 1提高了 87% ,同时对重组表达的木聚糖酶的酶学性质进行了初步研究     

大豆根瘤菌SCAUs8的接种效果、促生性及系统发育研究

【目的】大豆是我国重要的农作物,利用大豆-根瘤菌共生体系能有效减少化学氮肥的用量。将初筛的大豆根瘤菌SCAUs8在四川两个重要的大豆种植生态区进行田间接种验证试验,同时对该菌株进行分类地位研究。【方法】在四川丘陵区和攀西地区,采用大田试验调查接种大豆根瘤菌SCAUs8对大豆的增产效果。采用点接种法研究SCAUs8的抗逆性,用Salkowski比色法检测供试菌分泌吲哚乙酸(IAA)的能力。用多位点基因(16S r RNA,atp D,rec A,glnⅡ,nod C,nif H)序列分析对供试菌株SCAUs8进行分类地位的确定。【结果】大田试验表明,接种大豆根瘤菌SCAUs8后,大豆植株的产量、鲜重、干重等指标明显高于不接种对照(CK)处理,其中大豆植株产量比不接种CK增产21.4%-29.7%,其差异达显著水平。对供试菌株SCAUs8进行的耐酸碱性、耐盐性、生长温度范围以及分泌IAA能力测定的结果表明,供试菌株SCAUs8能在p H5.0-10.0正常生长,可耐受Na Cl浓度为0.5%,生长温度范围是10-40°C,能分泌IAA。综合16S r RNA、atp D、rec A、glnⅡ、nod C、nif H基因的序列分析,发现供试菌株SCAUs8与Bradyrhizobium diazoefficiens USDA110T相似性高达100%。【结论】供试菌株SCAUs8是与四川主栽大豆品种共生匹配性较好的广谱菌株。该菌株耐盐性较差,但具有较强的耐酸碱性、较宽的生长温度范围及分泌IAA的能力。系统发育研究将供试菌株SCAUs8确定为B.diazoeffciens。     

一株产琼胶酶细菌的分离、鉴定及其琼胶酶基本性质

【目的】分离海洋来源的琼胶酶产生菌,对其进行分类鉴定,并研究其所产琼胶酶的基本酶学性质,为琼胶酶的应用研究及开发利用奠定基础。【方法】通过以琼脂为唯一碳源的选择培养基分离产琼胶酶的菌株;利用16S rRNA基因序列分析、表型和生理生化特征对菌株进行鉴定;通过DNS-还原糖法测定琼胶酶活性;利用显色底物法测定琼胶酶的类型;对菌株所产琼胶酶粗酶的酶学性质进行初步研究。【结果】分离到一株产琼胶酶的菌株NTa,16S rRNA基因序列分析显示该菌株属于寡养单胞菌属(Stenotrophomonas sp.);该菌株主要产胞外琼胶酶,可分泌α-琼胶酶和β-琼胶酶;琼胶酶粗酶的最适反应温度和pH分别为40℃和7.0,并且琼胶酶在温度低于30℃,pH为7.0-9.0时稳定;Ca2+对琼胶酶粗酶具有促进作用,Ag+、Fe2+、Ba2+、Mn2+、Cu2+、Zn2+和Fe3+均可不同程度地抑制酶的活性;EDTA对琼胶酶粗酶活性具有抑制作用;琼胶酶粗酶对检测的抑制剂、去垢剂及变性剂有较好的抗性。【结论】海洋细菌Stenotrophomonas sp.NTa是一种新型的产琼胶酶菌株,可同时分泌α-琼胶酶和β-琼胶酶,具有潜在开发利用价值。     

温郁金内生拮抗细菌B-11的分离及其抑菌活性

【背景】植物内生菌广泛分布在自然界中,具有巨大的潜在开发与应用价值。【目的】对温郁金内生细菌进行分离鉴定,并从中筛选出具有生防潜能的菌株。【方法】采用常规组织分离法对温郁金根茎内生细菌进行分离并利用16S rRNA基因序列分析进行初步鉴定;采用平板对峙法以铁皮石斛炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioides)为供试菌株对温郁金内生细菌进行拮抗菌的筛选;通过形态学鉴定、生理生化鉴定以及16S rRNA基因序列分析,确定拮抗菌株B-11的分类地位;以6个不同属的植物病原真菌为供试菌株对拮抗菌株B-11的抑菌谱进行测定,并研究其对病原菌菌丝的影响;利用特异性平板和MALDI-TOF-MS检测技术对拮抗菌株B-11产生的抑菌物质进行检测;采用离体叶片接种法研究拮抗菌株B-11对铁皮石斛炭疽病菌的防治效果。【结果】从温郁金根茎中分离得到25株内生细菌菌株,这些细菌菌株分属于12个属,其中芽孢杆菌属为优势菌属,占分离菌株的28%;通过初筛获得8株对C.gloeosporioides有抑菌活性的菌株,其中菌株B-11的抑菌活性最强,经鉴定该菌为贝莱斯芽孢杆菌(Baclliusvelezensis);抑菌谱测定发现菌株B-11能够对供试的属于不同属的6种植物病原真菌的菌丝生长具有抑制作用,显微观察发现经对峙培养6 d后这6种病原菌的菌丝体出现畸形膨大、分枝增多等现象;特异性平板检测结果表明拮抗菌株B-11能够产生蛋白酶、β-葡聚糖酶和嗜铁素,但不产生几丁质酶;MALDI-TOF-MS检测结果表明拮抗菌株B-11能够产生伊枯草素、丰源素和表面活性素3种脂肽类抗生素,其中伊枯草素的产量最高;离体叶片接种实验表明,拮抗菌B-11的离心去菌发酵液对铁皮石斛炭疽病的防治效率可达64%。【结论】温郁金根茎含有丰富的内生细菌资源,其内生细菌菌株B-11有潜力作为开发抗真菌代谢物和新药物的重要微生物资源。     

一株高产琼胶酶海洋细菌的筛选与鉴定

从广东省南澳岛采集龙须菜(Gracilaria lemaneiformis),分离海洋来源的琼胶酶产生菌,并对其进行分类鉴定,为琼胶酶的开发利用奠定基础。利用4种不同的筛选培养基分离产琼胶酶的菌株,通过形态、生理生化特征和16S rRNA基因序列分析对菌株进行鉴定并构建系统发育树,通过DNS法测定琼胶酶活力,研究菌株所产琼胶酶的类型,对菌株的生长曲线及发酵产酶曲线进行初步测定。结果显示,分离得到一株高产琼胶酶的菌株ZQM2017,该菌株为革兰氏阴性短杆菌,16S rRNA基因序列分析显示该菌株属于弧菌属(Vibrio sp.),结合形态特征和生理生化实验结果鉴定为溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus);可同时产α-琼胶酶与β-琼胶酶;该菌株在液体培养基中28℃,180 r/min振荡培养时,其对数期出现在3-9 h,发酵5 h即有明显产酶,当发酵至46 h,所产琼胶酶活力达到最高109.87 U/mL发酵液。从南澳岛龙须菜上自主分离筛选得到的海洋细菌ZQM2017,经鉴定命名为Vibrio alginolyticus ZQM2017,可同时分泌α-琼胶酶和β-琼胶酶,所产琼胶酶初始活力高达109.87 U/mL。     

甲醇利用型吡咯喹啉醌产生菌的筛选及鉴定

从虎杖内生细菌和黏细菌中筛选吡咯喹啉醌(PQQ)产生菌。采用3种以甲醇为唯一碳源的培养基对160株供试菌株进行摇瓶培养发酵,发酵产物采用光谱学分析法及HPLC法筛选。结果显示,通过初筛和复筛共得到甲醇利用型菌134株,PQQ产生菌4株,其中菌株083114的PQQ产量为64.34 mg/L。菌株083114的16S rRNA基因序列分析结果显示,其序列与酸快生芽孢杆菌(Bacillus acidiceler)的系统发育关系最近。虎杖内生细菌及黏细菌中存在PQQ产生菌。     

采用PCR-RFLP技术在不同水平上鉴定大豆根瘤菌

采用16S rRNA基因PCR扩增与限制性酶切片段多态性分析(RFLP)技术对选自弗氏中华根瘤菌(S.fredii)、大豆慢生根瘤菌(B.japonicum)和埃氏慢生根瘤菌(B.elkanii)的19株代表菌进行了比较分析,根据用3种限制性内切酶的RFLP分析结果,可将供试菌株分为S.fredii,B.japonicum, B.elkanii Ⅱ和B.elkanii Ⅱa等4种基因型。各类菌株之间没有交叉,因此本研究采用的PCR-RFLP技术不失为一种快速鉴别大豆根瘤菌的新方法。采用本技术已将分离自中国的22株快生菌和19株慢生菌分别鉴定为S.fredii和B.japonicum。对供试参比菌株和野生型菌株进行的16S～23S基因间隔DNA(IGS)的PCR-RFLP分析结果表明：S.fredii和B.japonicum菌株的IGS长度不同,所有供试S.fredii菌株的IGS为2.1 kb,而供试B.japonicum菌株则为2.0 kb。依据RFLP的差异,可将来自中国两个不同地区的S.fredii株区分为2个基因型,而来自中国东北黑龙江地区的19株B.japonicum菌株则可分为11个基因型。对上述野生型菌株还进行了REP-PCR和ERIC-PCR分析并确定其具有菌株水平的特异性。     

链霉菌产木聚糖酶条件和酶学性质以及重离子诱变对产酶的影响研究

以一株由青藏高原牦牛粪中分离出的链霉菌为出发菌株,对其培养特性、产酶条件和酶学性质进行初步研究.通过重离子诱变,筛选出遗传稳定的高产菌株.结果表明,该菌以玉米芯和麸皮(1∶1)为碳源能高效地诱导木聚糖酶的胞外分泌,其最适培养基和培养条件氮源为酵母膏、初始pH7、培养温度为25℃,在此条件下,第4天酶活力达到峰值3480.25 U/mL.说明该酶能够利用农业废弃物高效生产木聚糖酶.该菌株所产木聚糖酶的最适反应温度为15℃、pH4,属低温酸性木聚糖酶.经重离子诱变后,筛选出一株高产菌株SZ10-7,其酶活力可达5 338.42 U/mL.