无乳链球菌内化素(Internalin)基因克隆和原核表达优化

内化素(Internalin)作为细菌表面蛋白是细菌侵入上皮细胞、肝细胞等非吞噬细胞并被宿主细胞内化的重要因子.本研究克隆了无乳链球菌Internalin基因(GenBank登录号:MN265365),该基因全长2160bp,编码719个氨基酸,理论分子量为80.38 kDa,等电点为6.73,没有信号肽和跨膜结构域,...     

罗非鱼无乳链球菌Sip基因的克隆、表达及免疫原性分析

表面免疫原性蛋白(Surface Immunogenic Protein,Sip)是B群链球菌(Group B Streptococcus,GBS)的一种表面蛋白,在GBS多种血清型的菌株中均有表达。研究从实验室分离到的罗非鱼无乳链球菌广东株的基因组DNA中扩增出Sip基因,构建原核表达载体pColdII-Sip,转化大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)菌株。经诱导表达、SDS-PAGE电泳检测显示重组蛋白主要以可溶形式表达。重组蛋白用亲和层析的方法纯化,蛋白纯度达98%。纯化后的重组蛋白免疫罗非鱼(Oreochromis niloticus,GIFT strain)以分析其免疫原性。受免鱼免疫14d后进行人工攻毒试验,免疫组的相对保护率为70%—87%。酶联免疫吸附试验(Elisa)显示受免鱼对重组蛋白产生了较好的免疫应答,免疫剂量为3μg/g和5μg/g时受免鱼血清抗体滴度可达1:128000。研究结果显示重组蛋白Sip具有较强的免疫原性和保护作用,Sip基因可作为罗非鱼链球菌基因工程亚单位疫苗候选基因。     

MBP-gldABC融合蛋白基因的原核表达载体的构建

目的：构建可高效生产甘油脱水酶的大肠杆菌工程菌,方法：将编码甘油脱水酶的三个基因gldA、gldB、gldC,分别克隆至克隆载体pMD18-T和pSIM-T中,经测序正确后,再亚克隆至表达融合蛋白的高效表达载体pMAL-c2X上,构建成表达质粒pMAL-gldABC,并转化大肠杆菌E.coli DH5α。结果：成功地将甘油脱水酶基因gldABC以同向串联方式克隆到大肠杆菌融合表达载体pMAL-c2X中,结论：得到了含gldABC基因的MBP融合蛋白表达载体,为研究甘油脱水酶基因（gldABC）的在原核表达载体中的串联表达奠定了基础。     

停乳链球菌isp基因的克隆与原核表达

根据GenBank报道的停乳链球菌(Streptococcus dysgalactiae)isp基因(GenBank:CP002215.1)序列设计引物,PCR扩增得到isp基因。片段大小为1 500 bp,与从GenBank下载的序列进行同源性比对结果为98.57%。将isp基因克隆于表达载体pET-25b,成功构建了重组质粒pET-25b-isp,将重组质粒分别转化BL21(DE3),将BL21(pET-25b-isp)阳性重组菌株经IPTG诱导后,SDS-PAGE结果显示均有蛋白表达,大小分别为53 ku与目的蛋白大小相符;Western blot检测显示,表达的蛋白为目的蛋白。对成功构建的菌株BL21(pET-25b-isp)表达条件经优化后,在温度37℃,诱导时间12 h,IPTG浓度为1 mmol/L时,蛋白有较高的表达量。     

海南罗非鱼无乳链球菌分离鉴定及其特性研究

从海南省患暴发性疾病的罗非鱼(Tilapia)上分离出1株细菌HNLFYL4,对分离菌株进行了鉴定及致病性和药物敏感性研究.通过形态学观察和生理生化鉴定,结果显示,分离菌株为无乳链球菌(Streptococcus agalactiae).对分离菌株的16S rRNA基因进行PCR扩增和测序,所得序列已登录到GenBank,登录号为HQ645983,与GenBank中收录的链球菌16S rRNA 基因进行比对并构建系统进化树,结果表明,分离菌株的16S rRNA基因序列与无乳链球菌同源性高达100%,进一步确定分离菌株为无乳链球菌.人工感染显示分离菌株对小白鼠和罗非鱼均具有致病性,对小白鼠的LD50为1.0×104 CFU/mL,对体重为500g±20g的罗非鱼的LD50为1.729×109CFU/mL.分离菌株对氯霉素、青霉素G、呋喃妥因等敏感,对丁胺卡那、链霉素、卡那霉素等不敏感.     

重叠延伸PCR法构建小鼠IL-35单链融合基因及其真核表达载体

目的:构建小鼠IL-35单链融合基因及其真核表达载体.方法:将10 ug LPS和等体积的完全福氏佐剂乳化后皮下注射C57BL/6小鼠,7天后,取小鼠脾脏,提取脾细胞总RNA,通过RT-PCR克隆小鼠EBI3和IL-12p35 cDNA;采用重叠延伸PCR,通过编码疏水性多肽接头(Gly4Ser)3的DNA序列连接小鼠EBI3全长基因和IL-12p35成熟肽基因,构建小鼠IL-35单链融合基因(Inouse sigle chain IL-35,mscIL-35),并将其克隆至pcDNA3.1/V5-His TOPO TA载体.通过酶切和测序鉴定阳性重组载体.结果:DNA序列分析结果表明:小鼠IL-35单链融合基因中EBI3、IL-12p35和linker的连接顺序、方向及序列完全正确.结论:成功构建了小鼠IL-35单链融合基因及其真核表达载体,为进一步探讨IL-35的生物学功能奠定了基础.     

小鼠OAZ2基因的原核表达及抗体制备

目的:克隆小鼠鸟氨酸脱羧酶抗酶2(OAZ2)功能基因,原核表达、纯化OAZ2蛋白并制备抗OAZ2多克隆抗体.方法:IRT-PCR法从鼠黑色素瘤细胞总RNA中克隆OAZ2 cDNA后,通过重叠延伸PCR技术构建无需移码即可全长翻译的功能基因.将OAZ2功能基因克隆人原核表达载体pET15b并原核表达.表达的蛋白经Ni-NTA亲和层析纯化后,用SDS-PAGE和Western Blot分析鉴定.用纯化的OAZ2蛋白作为抗原免疫Bab/C小鼠以制备多克隆抗体,制备抗体用ELISA和Western Blot检测抗体滴度和特异性.结果:成功获得小鼠OAZ2 cDNA并构建出无需移码翻译的OAZ2功能基因.OAZ2功能基因在大肠杆菌BL21(DE3)中可诱导性高表达并能用Ni-NTA树脂高效纯化.用纯化蛋白免疫Bab/C小鼠制备的抗血清经ELISA检测有较高的多克隆抗体效价(＞1∶64000),经Western blot鉴定可与纯化的OAZ2蛋白质特异性结合.结论:建立了鼠OAZ2蛋白原核表达和纯化技术,制备出高效价和特异性抗OAZ2多克隆抗体,为进一步研究OAZ2基因的功能奠定了基础.     

罗非鱼无乳链球菌α蛋白基因的克隆、鉴定及分子特性分析

本研究克隆了罗非鱼源无乳链球菌HN0101分离株的α蛋白基因,通过生物信息学对其序列分析结果显示:α蛋白基因的ORF由1341个碱基组成,编码一个长度为446个氨基酸的多肽,N-端具有一个保守的YSIRK信号肽序列和一个AlphaC_N超家族结构域,C-末端含有1个保守Gram_pos_anchor超家族结构域,而在中间具有2个重复的Rib结构域;比较不同来源分离株的α蛋白结构,发现主要区别在于Rib结构域重复数目的不同;同源性及系统进化树分析,发现本株菌的α蛋白与已报道的人源A909和鱼源GD201008-001α蛋白聚为一簇,同源性达100%;罗非鱼源无乳链球菌α蛋白为亲水性蛋白,存在一个跨膜区,有37个潜在的磷酸化位点和1个潜在的N-糖基化位点;二级结构分析发现存在较多的无规则卷曲,推测有12个氨基酸区域可能是B细胞抗原表位;当选择大肠杆菌为表达宿主时,该重组蛋白的溶解度高达100%,亚细胞定位显示该蛋白位于细胞壁上。     

无乳链球菌诱导吉富罗非鱼分泌型免疫球蛋白M(sIgM)重链基因的克隆及原核表达

以灭活的无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)诱导后的吉富罗非鱼(Oreochromis niloticus)为材料,构建其头肾SMART cDNA文库,应用同源性克隆和RACE-PCR技术克隆到吉富罗非鱼(O.niloticus)分泌型免疫球蛋白M(sIgM)重链基因的全长cDNA序列并对其进行生物信息学分析。sIgM基因cDNA全长为1 921 bp,开放阅读框(ORF)为1 740 bp,5'端非编码区(5'-UTR)41 bp,3'端非编码区(3'-UTR)140 bp,编码579个氨基酸,N端有信号肽结构。预测分子量(MW)为64.26 kD,理论等电点(pI)为5.36。系统进化树分析显示,吉富罗非鱼(O.niloticus)sIgM与牙鲆(Paralichthys olivaceus)和军曹鱼(Rachycentron canadum)的亲缘关系较近。sIgM基因有4个恒定区。将吉富罗非鱼(O.niloticus)sIgM基因恒定区序列克隆到原核表达载体pET-28a(+)中,构建原核表达质粒pET28-sIgM,诱导表达后确定最优条件为37℃条件下,IPTG浓度为0.05 mmol/L时诱导4 h蛋白表达量最大。纯化蛋白后经Western blot分析,sIgM融合蛋白与鼠抗His-Tag发生特异结合,表明目的蛋白成功表达。     

绿色木霉TvALP-linker-TvRBL融合基因的构建与原核表达

在Tv ALP基因和Tv RBL基因间加入一段柔性链接头(linker)基因序列,构建融合基因。生物信息学分析表明该融合基因含有一段信号肽序列。利用RT-PCR技术从绿色木霉菌丝体总RNA中扩增出Tv RBL基因、Tv ALP基因和去除信号肽的ΔTvALP基因,分别克隆到原核表达载体p ET30a,构建重组质粒p ET30a-Tv ALP-linker-Tv RBL和p ET30a-ΔTv ALP-linker-Tv RBL,转化大肠杆菌BL21(DE3)p Lys S,经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达。SDS-PAGE电泳分析结果表明,去除信号肽的表达质粒p ET30a-ΔTv ALP-linker-Tv RBL在大肠杆菌BL21(DE3)p Lys S中获得了表达,在60 k D处有一条蛋白质特异条带,与预测的目的产物蛋白条带大小一致。     

罗非鱼源无乳链球菌肠道拮抗芽孢杆菌的筛选及其生物学特性

【目的】从健康尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)肠道中筛选一株对罗非鱼源无乳链球菌等病原菌具有拮抗功能的益生菌。【方法】取健康尼罗罗非鱼肠道,匀浆后进行10倍系列梯度稀释,然后涂布BHI平板,培养1–2d,挑取单克隆菌落。采用点种法初步筛选对罗非鱼源无乳链球菌有拮抗作用的菌株,选取其中一株拮抗效果较好的菌株LF01,通过形态学、生理生化特征以及分子生物学分析,对LF01菌株进行鉴定。然后对LF01菌株的生长特性、水解淀粉和酪蛋白能力、药物敏感特性、抗菌谱和生物安全性进行测定和分析。【结果】根据菌落形态和生长时间的差异,从健康尼罗罗非鱼肠道中筛选出64株细菌,通过拮抗试验筛选出6株具有明显拮抗效果的菌株,其中LF01菌株的拮抗效果最好。根据LF01的形态、生理生化特征和gyr A基因的进化分析,确定该菌株为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)。LF01菌株的最适生长温度为30°C,最适p H值为7,最适盐度为5‰,而且该菌株具有水解淀粉和酪蛋白的功能。药敏试验结果显示,LF01菌株对多数抗生素敏感,仅对杆菌肽耐药。拮抗试验结果显示LF01株对无乳链球菌、海豚链球菌、迟缓爱德华氏菌、鮰爱德华氏菌、嗜水气单胞菌、舒氏气单胞菌、维氏气单胞菌、简氏气单胞菌、鰤鱼诺卡氏菌等病原菌均具有拮抗作用,其中对鰤鱼诺卡氏菌的拮抗作用最强,平均抑菌圈直径达28.3 mm。生物安全试验表明,LF01菌株对尼罗罗非鱼、斑马鱼(Danio rerio)和乌鳢(Channa argus)等3种鱼均无致病性,具有良好的安全性。【结论】本研究筛选了一株贝莱斯芽孢杆菌LF01株,该菌的生物安全性良好,而且可拮抗常见的水产病原菌,具有防控多种水产经济动物疾病的潜力,应用前景十分广阔。     

茶树CsCOR1基因的原核表达

将来自茶树的冷诱导基因CsCORI与pGEX-6p-1质粒上的谷胱甘肤-S-转移酶(GST)融合,构建为融合表达载体,最终实现了在0.8 mmol/L IPTC诱导下的原核表达,获得了36 kD的可溶性融合蛋白,为对CsCOR1基因功能的进一步研究奠定基础.     

无乳链球菌表面蛋白的研究进展

无乳链球菌是链球菌属的一个种,按Lancefild血清学分类,划归为B群(B群链球菌)。上世纪90年代以来,无乳链球菌是新生儿严重感染性疾病致病菌之一,在发达国家的感染率是围生儿间接死因的首位。由于该菌是许多妇女阴道的常驻菌群,在阴道和宫颈的定植率也很高,是引起新生儿侵袭性感     

罗非鱼原核表达基因研究进展

罗非鱼作为世界范围广泛养殖的经济鱼类,其营养价值特别高,是当前淡水养殖业的重要鱼类养殖品种之一.原核表达是利用基因克隆技术,把外源基因与特定表达载体结合,然后转入表达菌株,使基因在体外得以表达的一种技术.该技术可将特定基因翻译成蛋白质,为特定基因的蛋白水平研究提供基础材料.目前,随着罗非鱼养殖业的扩大,对罗非鱼的研究也...     

无乳链球菌耐药性及分子分型方法的研究进展

无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)是链球菌属最主要的致病菌之一,又被称为B群链球菌(group B Streptococcus,GBS)。S. agalactiae致病性主要由毒力因子和表面蛋白引起,毒力因子包括荚膜多糖、溶血素、菌毛岛屿、透明质酸酶、磷酸甘油激酶和CAMP因子,表面蛋白是αC蛋白、表面免疫相关蛋白、黏附蛋白、纤维蛋白原结合蛋白、层黏连蛋白结合蛋白和纤溶酶受体蛋白。近8年的S. agalactiae耐药情况统计数据发现,S.agalactiae已对19种抗菌抗药物产生耐药,检出20个耐药基因和12种毒力因子。国内外S. agalactiae分子分型方法主要致力于血清型、多位点序列、脉冲场凝胶电泳、菌毛岛屿和细菌前噬菌体基因分型。本文阐述了S.agalactiae生物学特性、流行性致病信息、耐药性研究现状和分子分型方法研究进展,以期为进一步探明S.agalactiae耐药机制、开发治疗S. agalactiae的新型药物提供参考。     

尼罗罗非鱼Ikaros基因的克隆及表达分析

为揭示尼罗罗非鱼Ikaros基因结构特征及其在抗病原感染中的免疫调控机制, 实验采用RT-PCR和RACE方法克隆了尼罗罗非鱼Ikaros的cDNA序列以及利用PCR和染色体步移技术克隆了Ikaros的基因组DNA序列, 通过荧光定量PCR分析了Ikaros mRNA的组织分布及其对无乳链球菌感染的响应。结果表明, 克隆的尼罗罗非鱼Ikaros基因组DNA为20454 bp, 包括7个内含子和8个外显子, 经可变剪接可形成6种不同的mRNA剪接异构体, 其编码的氨基酸序列均具有Ikaros家族典型的锌指结构域且与硬骨鱼类Ikaros氨基酸序列同源性较高(70.6%—93.7%)。Ikaros基因在尼罗罗非鱼各组织中均有表达, 在血液中的表达量最高, 其次为胸腺、脾脏和头肾。人工感染无乳链球菌后, 血液、胸腺、脾脏、头肾中Ikaros基因的相对表达量均显著上调, 并在48h达到峰值, 这表明Ikaros基因参与调控尼罗罗非鱼抵御无乳链球菌的免疫应答反应。研究可为进一步探索Ikaros基因在罗非鱼抗病原感染中的作用机制奠定理论基础。     

无乳链球菌临床株对四环素类的敏感性研究

为探讨无乳链球菌对四环素类的敏感性及其与耐药基因、多位点序列分型(multilocus sequence typing,MLST)之间的关系,本研究收集2014—2017年深圳市南山区人民医院分离自患者的136株无乳链球菌临床分离株,采用琼脂平板稀释法分析四环素类最低抑菌浓度(minimum inhibitory co...     

人抑癌基因PTEN的原核表达载体的构建及融合表达

为研究抑癌因子PTEN蛋白的抑癌机理,掏建了PTEN cDNA的原核表达载体并进行融合表达。将含有PTEN cDNA的质粒pMD-PTEN经EcoR Ⅰ和Sal Ⅰ双酶切,回收PTEN基因片段与经相同酶切的高效原核表达载体pET-44a连接,经序列测定,证实融合型表达载体pET-Nus-PTEN构建成功。转化表达宿主BL21(DE3)后,IPTG诱导表达。经12％SDS-PAGE凝胶电泳,获得118kD的特异蛋白条带。目的蛋白占细菌总蛋白的17％。结果表明：PTEN基因和Nus基因融合表达成功,获得可溶性Nus-PTEN蛋白。该研究为PTEN蛋白的抑癌机理和基因工程药物的研究打下了基础,这是国内PTEN蛋白在原核细胞中成功表达的首次报道。     

奥尼罗非鱼及其亲本感染无乳链球菌后生理响应变化

研究通过比较杂交子一代奥尼罗非鱼(Oreochromis spp.)与亲本在腹腔注射无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)后累积死亡率差异,血液生理指标、生化指标和脾脏促炎性细胞因子的表达水平变化,以深入了解奥尼罗非鱼抗病性杂种优势的生理和分子基础。结果显示:在无乳链球菌人工感染后,奥尼罗非鱼的累积死亡率显著低于亲本(P<0.05)。感染前奥尼罗非鱼的白细胞数、红细胞数和红细胞压积最高,感染后3种罗非鱼的白细胞都显著性升高(P<0.05),红细胞数、红细胞压积和血红蛋白显著性下降(P<0.05),呼吸暴发受到抑制,奥尼罗非鱼血液生理指标与父本奥利亚罗非鱼更为接近;奥尼罗非鱼在感染细菌后的血糖浓度和溶菌酶含量显著高于亲本,呼吸暴发强于亲本(P<0.05)。定量PCR结果显示感染后3种罗非鱼脾脏TNF-α、IL-1β和IL-6的mRNA表达水平都显著上升(P<0.05), 3种罗非鱼的TNF-α和IL-6都在感染后7h达到峰值,奥尼罗非鱼IL-1β在感染后48h达到峰值,尼罗罗非鱼IL-1β在感染后24—48h达到峰值,奥利亚罗非鱼IL...     

华北地区牛源无乳链球菌的分离鉴定及生物学特性

【目的】了解华北地区牛源无乳链球菌的生物学特性。【方法】在2012到2015年间从内蒙古自治区、河北、北京等地隐性乳房炎557份奶牛乳样中分离、收集无乳链球菌。采用纸片扩散法和PCR的方法对这些菌株分别进行耐药谱测定、荚膜分子分型、表面蛋白基因及毒力因子的检测。【结果】无乳链球菌的分离率为5.03%,其药物敏感性与其他地区无明显差别。分离到的28株无乳链球菌均属于荚膜Ia型,且毒力基因基本相同并且其表面蛋白均属于未定型。【结论】华北不同地区的无乳链球菌有相似的药物敏感性和毒力基因。为奶牛乳房炎无乳链球菌疫苗的研制及药物防治提供理论依据。