重组大肠杆菌利用木糖发酵产高纯度L-乳酸

对重组大肠杆菌JH16利用木糖产高纯度的三一乳酸进行研究。通过无氧管驯化EscherwhiacdiJH12菌株得到E．coliJH16,驯化后的菌株茵体浓度提高了31％,乙酸积累减少了43％;在摇瓶中考察不同Mg2＋浓度对EcoliJHl6产三一乳酸的影响,确定最适Mg2＋质量浓度为0．25g/L;EcoEJH16以60g/L木糖为C源,在7L全自动发酵罐中添加0．25g／LMg2＋,乳酸积累量提高了18％,达38．18g/L,乳酸纯度高达95％;E．coliJH16在30g／L木糖和30g／L葡萄糖混合C源中,优先利用葡萄糖,当葡萄糖质量浓度低于1．56g/L后,菌体开始利用木糖进行乳酸发酵,最终得到39g／L乳酸。     

L-乳酸脱氢酶在大肠杆菌BL-21(DE3)中的表达

为了在大肠杆菌中构建利用葡萄糖生产L-乳酸的途径,以鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)LA - 04 -01基因组为模板,设计引物扩增L-乳酸脱氢酶基因L-ldh.将该基因连接到表达栽体pET-28a(+)上,并转化大肠杆菌Top10.通过卡那霉素抗性平板筛选,提取重组质粒pET28a-L-ldh并测序,结果正确.将pET28a-L-ldh转化大肠杆菌BL-21( DE3),通过卡那霉素抗性平板筛选,得到产乳酸的大肠杆菌基因工程菌.经IPTG诱导后,SDS-PAGE电泳,检测到目的蛋白条带,L-乳酸脱氢酶比酶活力达到9.44 U/mL.该基因工程菌通过摇瓶发酵,L-乳酸产量达到3 g/L,成功构建出一条在大肠杆菌中生产L-乳酸的新途径.     

保加利亚乳杆菌ATCC11842 L-乳酸脱氢酶同工酶基因的克隆与表达分析

通过对保加利亚乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus)L-乳酸脱氢酶(L-lactate dehydrogenase, L-LDH)同工酶基因的异源表达、酶活测定和摇瓶发酵研究L-LDH在乳酸合成中的作用。将保加利亚乳杆菌ATCC11842中L-乳酸脱氢酶基因ldb0120和ldb0094分别克隆至载体pET28a(+)中,构建重组表达载体pET28aldb0120和pET28aldb0094,并转化到大肠埃希菌(Escherichia coli) BL21(DE3)中进行表达。进一步对重组蛋白进行Ni-NTA柱亲和层析和酶学活性测定,结果显示,LDB0120和LDB0094的比活力分别为0和25 U/mg,表明LDB0094是具有低活性的L-乳酸脱氢酶,而LDB0120不具有活性。对两株重组菌分别进行好氧和微好氧发酵,重组菌E.coli BL21/pET28aldb0094在好氧和微好氧条件可以合成L-乳酸,浓度分别为41.9和227.9 mg/L,而菌株E.coli BL21/pET28aldb0120在两种培养条件下均基本不合...     

丙酮丁醇梭菌ldhL基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

首次从丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum ATCC824)中克隆得到L-乳酸脱氢酶(L-lactate dehydrogenase,ldhL)基因,并将其连接到pSE380表达载体上,得到重组质粒pSE380ldhL,将重组质粒转化到乳酸脱氢酶和丙酮酸裂解酶缺陷的Escherichia coli FMJl44大肠杆菌中进行表达。SDS-PAGE分析表达产物的分子量约为34kD,摇瓶发酵后用HPLC检测分析L-乳酸产量为2.4g/L,纯度达到99.9%,不需要再进行手性分离,为以后在工业上生物法生产高纯度的L-乳酸打下基础。     

重组大肠杆菌利用废纸水解液发酵产L-乳酸

前期通过基因工程手段,构建了一株大肠杆菌工程菌E.coli WL204,该菌株可以有效利用木糖为底物发酵产L-乳酸。以废纸为发酵原料,研究该菌株利用木质纤维素发酵产乳酸的特性。原料以稀硫酸预处理后,经纤维素酶酶解,得到的水解液用Ca(OH)2脱毒后,接种E.coli WL204,在7L发酵罐中发酵72h,每100g废纸可以产生31g乳酸,糖酸转化率为79%。结果表明,E.coli WL204可以木质纤维素原料为底物发酵生产L-乳酸,具有一定的工业化开发潜力。     

α-乙酰乳酸脱羧酶在大肠杆菌中的克隆表达

根据已知的α-乙酰乳酸脱羧酶（ALDC）的基因序列,通过PCR获得了枯草芽孢杆菌168的ALDC基因,将该基因克隆到克隆载体pUC18和表达载体pQE60中,构建了pUC18-ALDC和pQE60-ALDC,经DNA测序证明序列正确。重组大肠杆菌DH5a／pQE60-ALDC经IPTG诱导能够高表达ALDC。对该酶进行了活力测定,结果显示工程菌产酶活力为0．11U／mL。     

代谢工程大肠杆菌利用甘油高效合成L-乳酸

以甘油为碳源高效合成L-乳酸有助于推进油脂水解产业和生物可降解材料制造业的共同发展。为此,首先分别从凝结芽胞杆菌Bacillus coagulans CICIM B1821和大肠杆菌Escherichia coli CICIM B0013中克隆了L-乳酸脱氢酶基因BcoaLDH和D-乳酸脱氢酶 (LdhA) 的启动子片段PldhA。将两条DNA片段连接组成了表达盒PldhA-BcoaLDH。然后将上述表达盒通过同源重组删除FMN为辅酶的L-乳酸脱氢酶编码基因lldD的同时克隆入ldhA基因缺失菌株E. coli CICIM B0013-080C (ack-pta pps pflB dld poxB adhE frdA ldhA)的染色体上,获得了L-乳酸高产菌株E. coli CICIM B0013-090B (B0013-080C,lldD::PldhA-BcoaLDH)。考察了菌株CICIM B0013-090B不同培养温度下代谢利用甘油和合成L-乳酸的特征后,建立并优化了一种新型L-乳酸变温发酵工艺。在7 L发酵罐上,发酵27 h,积累L-乳酸132.4 g/L,产酸强度4.90 g/(L·h),甘油到L-乳酸的得率为93.7％,L-乳酸的光学纯度达到99.95％。     

鼠李糖乳杆菌D-(+)-乳酸脱氢酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

利用PCR的方法从鼠李糖乳杆菌基因组DNA中扩增到D-(+)-乳酸脱氢酶基因(ldhD),并连接到载体pSE380上,构建表达质粒pSE-ldhD,将重组质粒pSE-ldhD转化大肠杆菌BL21(DE3),重组菌株经IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳分析表明ldhD在大肠杆菌中实现了表达,表达产物的分子量约为37kD。同时采用紫外分光光度法测定D-乳酸脱氢酶的酶活,测得重组菌株的D-乳酸脱氢酶活力为5.4U/mL,最适反应温度为35℃,最适pH为5.6。     

干酪乳杆菌L-乳酸脱氢酶在大肠杆菌中的表达、纯化及酶学性质

L-乳酸脱氢酶(L-lactate dehydrogenase,L-LDH)是发酵生产L-乳酸中催化丙酮酸转化成L-乳酸的关键酶。以干酪乳杆菌G-02(Lactobacillus casei G-02)基因组DNA为模板,克隆得到L-LDH基因(ldhL),经序列分析后将其连接到表达载体pET-28a(+)上,构建成重组质粒pET-ldhL转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,实现ldhL基因的表达。30°C加入IPTG诱导表达后,经镍柱亲和层析纯化的重组蛋白样品通过SDS-PAGE分析,约在40 kD处出现显著的特异性条带。对表达的L-LDH生物学特异性研究显示:重组L-LDH的比酶活为1 722 U/mg,最适反应温度为40°C-45°C;果糖-1,6-二磷酸(FBP)为别构激活剂,使最适pH向中性方向偏移(pH为6.6-6.8),Mn2+可拓宽最适酶活pH范围;Mn2+、Ca2+和Mg2+对L-LDH有激活作用,而Zn2+对L-LDH有抑制作用。     

短芽孢杆菌a-乙酰乳酸脱羧酶基因在大肠杆菌中的克隆和表达

用PCR方法扩增短芽孢杆菌α—乙酰乳酸脱羧酶基因,引入原核表达载体pBV220中,得到重组质粒pALDl。pALDl中的ALDC基因在大肠杆菌中高效表达,每毫升发酵液产酶80单位以下,比原始菌株提高200余倍。SDS-PAGE蛋白质分析表明,大肠杆菌DH5α(pALDl)表达的ALDC占细胞总蛋白量的40％以上。研究了重组质粒稳定性,大肠杆菌DH5α(PALDl)和HB101(pALDl)分别在无选择压力下30℃连续培养50代以上,41℃诱导不同时间,DH5α(pALDl)在热诱导5h后,未发现质粒不稳定性,HB101(pALDl)在热诱导3h后,质粒基本稳定,但热诱导5h后,丢失质粒的细胞约占70％。     

Lactobacillus casei磷脂酶A_2基因在大肠杆菌中的重组表达

以Lactobacillus casei染色体基因组为模板,PCR扩增获得磷脂酶A2基因pla2,以pET-28a(+)为载体构建重组表达质粒pET-28a(+)-pla2。通过IPTG诱导实现磷脂酶A2在E.coli DE3中的重组表达。对诱导条件初步优化后,重组菌酶活最大可达2.8 U/mL。通过Ni-螯合柱对目的蛋白进行纯化,SDS-PAGE分析重组磷脂酶A2相对分子质量为1.7×104。通过酶学性质分析,最适温度为37℃,最适pH 8,比酶活为110 U/mg。     

抗菌肽-X基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

用PCR技术获得抗菌肽—X基因、TNFα基因,与温度诱导的表达载体pRC连接成为重组表达载体,导入大肠杆菌TG1,通过温度诱导表达重组蛋白。将重组质粒转入不同的表达菌中进行表达,经SDS—PAGE选出E.coil BL21(DE3)为最佳表达的宿主菌。培养后,离心得菌体,经超声破碎离心得包涵体,溶解后用CNBr切割并透析,最后经CM52纤维素柱分离纯化得到有活性高纯度的抗菌肽—X。     

人铜锌超氧化物歧化酶基因的克隆和在乳酸乳球菌中的表达

采用RT-PCR技术从人肝总RNA中分离扩增了0.45kb的人铜锌超氧化物歧化酶(Cu/Zn SOD)基因的cDNA序列,首先克隆至大肠杆菌表达质粒pET23b,进行了序列测定和超高表达。将Cu/Zn SOD cDNA亚克隆至乳酸乳球菌表达载体pMG36e,用电穿孔法将重组质粒pMG36esod转化到乳酸乳球菌中,获得Cu/Zn SOD的组成型表达,其表达量约占乳酸乳球菌可溶性蛋白的5%以上,活性染色表明该工程菌表达的Cu/Zn SOD具有较好的酶活性。     

利用五碳糖产高纯度L-乳酸的大肠杆菌基因工程菌的构建

[目的]本研究以已敲除多个产杂酸酶基因的大肠杆菌(Escherichia coli)乙醇工程菌SZ470(△frdBC △ldhA △ackA △focA-pflB △pdhR::pflBp6-pflBrbs-aceEF-lpd)为起始菌株,进一步敲除其乙醇脱氢酶(alcohol dehydrogenase,ADH)基因,同时插入带有自身启动子的乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)的L-乳酸脱氢酶(L-lactate dehydrogenase,LLDH)基因,构建可利用五碳糖同型发酵L-乳酸重组大肠杆菌.[方法]利用λ噬菌体Red重组系统构建乙醇脱氢酶基因(adhE)缺失菌株Escherichia coli JH01,并克隆P.acidilactici的ldhL基因,利用染色体插入技术将其整合到JH01基因组,构建产L-乳酸大肠杆菌基因工程菌Escherichia coli JH12,利用无氧发酵15 L发酵罐测定重组菌株L-乳酸产量.[结果]工程菌JH12在15 L发酵罐中以6％的葡萄糖为碳源进行发酵,发酵到36 h的过程中葡萄糖的消耗速率为1.46 g/(L·h),乳酸生产强度为1.14 g/(L·h),乳酸的产量达到41.13 g/L.发酵产物中未检测到琥珀酸、甲酸的生成,仅有少量乙酸生成,L-乳酸纯度达95.69％(L-乳酸在总发酵产物的比率).工程菌JH12以6％的木糖为碳源进行发酵,发酵到36 h的过程中葡萄糖的消耗速率为0.88 g/(L·h),乳酸生产强度为0.60 g/(L·h),乳酸的产量达到34.73 g/L.发酵产物中杂酸少,乳酸的纯度高达98％.[结论]本研究通过基因敲除、染色体插入及无氧进化筛选获得一株产L-乳酸的大肠杆菌工程菌JH12,该菌株不需利用外源质粒,稳定性好,可利用五碳糖进行发酵,发酵产物中杂酸少,L-乳酸的纯度高.本研究为L-乳酸大肠杆菌工程菌的构建提供一定的技术支持,同时也为大肠杆菌L-乳酸的工业化生产提供了参考依据.     

在大肠杆菌中高效表达重组Protein A

本文构建了高效表达质粒pPA-3,其在大肠杆菌中表达的重组Frotein A仅含天然Prot—ein A的免疫球蛋白Fc段结台区,表达量达菌体可溶蛋白的20％。sDs—PAGE及western—b1ot结果显示,重组protein A的分子量有4种,即33、32．2,29．5和28．6kDa,其中33kDa与理论计算结果一致,推测其它分子量可能是由于胞内蛋白酶降解所致。一步亲和层析即可将重组Protein A从细胞裂解上清液中纯化出来。火箭电泳及酶联免疫分析结果表明,等蛋白量的该重组Protein A比天然Protein A能结台更多的免疫球蛋白。     

短芽孢杆菌α—乙酰乳酸脱羧酶基因在大肠杆菌中的克隆和表达

用ＰＣＲ方法扩增短芽孢杆菌α－乙酰乳酸脱羧酶基因,引入原核表达载体ｐＢＶ２２０中,得到重组质ｐＡＬＤ１．ｐＡＬＤ１的ＡＬＤＣ基因在大肠杆菌中高效表达,每毫升发酵液产酶８０单位以上,双原始菌株提高２００余倍。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ蛋白质分析表明,大肠杆菌ＤＨ５α表达的ＡＬＤＣ占细胞总蛋白量的４０％以上。研究了重组质粒稳定性,大肠杆菌ＤＨ５α和ＨＢ１０１分别大无选择压力下３０℃连续培养５０代以上,４１℃诱导     

乳酸乳球菌启动子—信号肽活性片段在大肠杆菌中的克隆和表达

利用pGPB14为启动子-信号肽序列探测载体,在大肠杆菌中克隆乳酸乳球菌总DNA中具有启动子-信号肽功能的DNA片段。共得到42个具有红霉索、氨苄青霉素双重抗性的转化子。转化子的氨苄青霉素抗性水平在100～800μg/ml之间,β-内酰胺酶活力大多积累于周质空间,说明重组质粒中的外源插入片段确实具有发动转录和促进分泌的功能。Southern杂交结果表明,插入片段的确来源于乳酸乳球菌总DNA,其大小在80～400bp之间。DNA序列测定发现pSEQ8和pSEQ12中插入片段分属于pSEQ4和pSEQ17插入片段的一部分。在测序的4个DNA序列中都找到了启动子和起始密码子。其中2个含有典型的S.D.序列和非典型的信号肽序列,其他2个则没有发现典型的S.D.序列和信号肽序列。另外发现启动子上游序列对启动子转录起始的效率具有促进作用。     

重组PAI－1在大肠杆菌中的高效表达

纤溶酶原激活物抑制因子－１（ＰＡＩ－１）在天然状态下含量很低。为了进行ＰＡＩ－１的结构与功能的研究,构建了表达重组ＰＡＩ－１的质粒ｐＢＶ２２０／ＰＡＩ－１,并在大肠杆菌中得到了高效表达。最高表达量为菌体总蛋白量的４９％以上,经Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｉｎｇ检测,得到了分子量为４３．０ｋＤａ的反应条带。对形成包涵体的表达产物进行变、复性处理及Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－７５的初步纯化,得到了潜伏态的重组Ｐ     

重组人载脂蛋白AI米兰突变体在大肠杆菌中的高表达

用RT-PCR法从人肝总RNA库中克隆出人载脂蛋白Al的cDNA序列,再通过重叠PCR将载脂蛋白AI的第179位精氨酸密码子突变成半胱氨酸密码子,即载胎蛋白AI米兰突变体基因。将此目的基因克隆至表达载体pQE30,重组质粒转化JMl09宿主菌,经表达试验筛选出高表达克隆;工程菌经诱导后表达出含6个氨基酸前肽的载脂蛋白AI米兰突变体。表达产物主要以可溶形式存在,但也有部分为包涵体。