天然彩棉棕色素稳定性及其机理研究

测定了阳光、温度、洗衣粉和金属离子等因素对棕色棉纤维稳定性的影响,并分析了不同pH和不同浓度的纯化色素水溶液色彩的特性,观察纯化色素液与金属离子反应,来探索彩棉棕色素的稳定性机理。实验发现棕色棉纤维色调值位于38度,饱和度为29%,亮度为53%,探明了阳光、温度、洗衣粉和金属离子等因素对棕色棉纤维色彩均产生影响以及pH和浓度对纯化色素的色彩产生影响的规律。     

酮古龙酸菌细胞色素c的表达、成熟及活性分析

目的:从酮古龙酸菌Y25中扩增细胞色素c基因,在大肠杆菌中表达、成熟并进行生物活性分析。方法:从酮古龙酸菌Y25基因组中PCR扩增细胞色素c基因,构建pET22b表达载体;从大肠杆菌BL21(DE3)中扩增细胞色素c成熟基因簇ccmABCDEFGH,连接到带有山梨糖脱氢酶组成型启动子的pBBR1MCS2-P200载体中;将构建的2个质粒共转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达后进行血红素染色检测;通过氧化还原光谱法对Ni柱亲和纯化的重组蛋白进行活性分析。结果:扩增得到1404 bp的细胞色素c基因及6481 bp的ccmABCDEFGH基因簇;重组菌株经IPTG诱导表达后行SDS-PAGE分析,可见相对分子质量为50×103的表达条带;血红素染色显示重组蛋白结合有血红素;经氧化还原光谱扫描,显示亲和层析纯化得到的目的蛋白有细胞色素c特征吸收峰。结论:从酮古龙酸菌Y25中扩增得到了细胞色素c基因,在大肠杆菌中进行了表达和成熟,表达蛋白具有细胞色素c生物活性。     

蜀葵紫红色素及其理化性质研究

研究了蜀葵（Althaen rosea L.Cavan.）紫红色素的提取纯化工艺、理化性质。实验以蜀葵紫红色花瓣为材料,采用溶剂浸提法、硅胶柱层析法对色素进行提取纯化,效果较好。利用光谱扫描对该色素进行理化性质鉴定时发现：该色素属于花色苷类色素;色素耐光性好;耐氧化性、耐还原性较差;对热有一定的耐受性;防腐剂及多数金属离子对色素的稳定性无不良影响;但Fe^3＋、Fe^2＋、Cu^2＋、Pb^2＋、Sn^2＋对色素具有不利影响。     

大鼠PIAS3蛋白表达、纯化及生物信息学分析

[目的]构建大鼠His-PIAS3真核表达载体,将His-PIAS3于体外进行表达纯化,并对PIAS3进行生物信息学分析。[方法]采用分子克隆构建His-PIAS3-pcDNA3.1真核表达载体,之后转染入HEK293细胞进行表达,考马斯亮蓝染色检测整体蛋白变化,免疫印迹鉴定His-PIAS3蛋白表达及细胞整体蛋白SUMO化,镍柱纯化His-PIAS3蛋白。生物信息学方法分析大鼠PIAS3蛋白的理化性质、亲疏水性、二级结构及序列的保守性。[结果] His-PIAS3目的基因扩增成功,且亚克隆入pcDNA3.1载体;和空载体组相比,转染His-PIAS3-pcDNA3.1组PIAS3蛋白表达水平明显增加,且整体蛋白的SUMO化水平显著升高;镍柱纯化可获得较高纯度的His-PIAS3蛋白。生物信息学结果显示,大鼠PIAS3蛋白包含628个氨基酸残基,分子量为68.3 kDa,理论等电点为8.05,亲水性平均值为-0.242;PIAS3主要定位于膜内;PIAS3蛋白的二级结构主要由18.79%α-螺旋、13.69%延伸链和67.52%无规卷曲组成;不同物种间pias3序列相似性均在70%以上...     

嗜热藻BP-1中几个蓝细菌光敏色素结构域体内重组及光化学性质研究北大核心CSCD

通过蛋白质序列同源性比对分析,在嗜热藻(Thermosynechococcus elongatus BP-1)里面找到了与已知的Pb/Pg型蓝细菌光敏色素TePixJ和TeTlr0924同源的3个基因tlr0911、tlr1215和tlr1999。通过分子克隆技术把它们的GAF结构域分别构建在pET30a(+)表达载体上,与可生成藻蓝胆素(PCB)的质粒pACYCDuet-ho1-pcyA在大肠杆菌BL21(DE3)体内重组,生成重组蛋白,利用亲和层析柱分离纯化,纯化后的蛋白质经过锌荧光和蛋白质酸性尿素变性以及荧光光谱和吸收光谱等实验分析鉴定,结果表明,Tlr0911-GAF存在蓝光吸收态Pb406 nm和绿光吸收态Pg527 nm之间的可逆光转换,它可共价结合两种藻胆色素,即藻紫胆素(PVB)和藻蓝胆素(PCB),Tlr1999-GAF则存在蓝光吸收态Pb417 nm和青光吸收态Pt496 nm之间的可逆光转换,它同样共价结合PVB和PCB,而Tlr1215-GAF1和Tlr1215-GAF2不能自发结合藻胆色素,不具有光活性。     

嗜热藻BP-1中几个蓝细菌光敏色素结构域体内重组及光化学性质研究

通过蛋白质序列同源性比对分析,在嗜热藻（Thermosynechococcus elongatus BP-1）里面找到了与已知的Pb/Pg型蓝细菌光敏色素TePixJ和TeTlr0924同源的3个基因tlr0911、tlr1215和tlr1999。通过分子克隆技术把它们的GAF结构域分别构建在pET30a（＋）表达载体上,与可生成藻蓝胆素（PCB）的质粒pACYCDuet-ho1-pcyA在大肠杆菌BL21（DE3）体内重组,生成重组蛋白,利用亲和层析柱分离纯化,纯化后的蛋白质经过锌荧光和蛋白质酸性尿素变性以及荧光光谱和吸收光谱等实验分析鉴定,结果表明,Tlr0911-GAF存在蓝光吸收态Pb406 nm和绿光吸收态Pg527 nm之间的可逆光转换,它可共价结合两种藻胆色素,即藻紫胆素（PVB）和藻蓝胆素（PCB）,Tlr1999-GAF则存在蓝光吸收态Pb417 nm和青光吸收态Pt496 nm之间的可逆光转换,它同样共价结合PVB和PCB,而Tlr1215-GAF1和Tlr1215-GAF2不能自发结合藻胆色素,不具有光活性。     

激光捕获显微切割技术纯化的鼻咽癌和正常鼻咽上皮细胞的比较蛋白质组学研究

为筛选鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma, NPC)的分子标志物,采用激光捕获显微切割技术(laser capture microdissection, LCM)分别从NPC组织和正常鼻咽上皮组织(normal nasopharyngal epithelial tissue, NNET)中切割纯化NPC细胞和正常鼻咽上皮细胞(normal nasopharyngal epithelial cells, NNEC),应用二维凝胶电泳(two-dimensional electrophoresis, 2-DE)分离LCM纯化细胞的蛋白质,图像分析识别差异表达的蛋白质点,基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)和电喷雾电离串联质谱(ESI-Q-TOF-MS)鉴定差异蛋白质点,Western blot检测差异蛋白cytokeratin 8 (CK8)在LCM纯化的NPC细胞和NNEC以及具有不同分化程度或转移潜能的4株NPC细胞中的表达,免疫组织化学检测CK8在63例NPC、28例NNET及20例颈淋巴结转移NPC组织中的表达水平.建立了LCM纯化的NPC细胞和NNEC的2-DE图谱,质谱鉴定了29个差异蛋白质,其中15个蛋白质只在NPC表达或表达明显增高,14个蛋白质在NPC中表达下调或缺失;Western blot结果显示,CK8的表达水平在NPC中较NNET明显下调,并与NPC细胞株的分化程度和转移潜能有关;免疫组织化学结果显示,CK8在NPC组织中的表达较NNET明显下调,在颈淋巴结转移NPC中的表达较原发NPC明显上调.研究结果提示,CK8与NPC分化及淋巴结转移相关,有望成为预测NPC转移和区别NPC分化程度的分子标志物.     

叶绿体分裂蛋白PDV1胞质侧结构域可溶性表达条件的研究及纯化

目的:探索叶绿体分裂蛋白PLASTID DIVISION1(PDV1)胞质侧结构域的高效可溶性表达条件,并得到高纯度目的蛋白。方法:通过改变表达载体种类、基因片段大小、诱导剂浓度、诱导温度的方法,以及运用分子伴侣的协助,实现目的蛋白高效可溶性表达。通过镍柱亲和层析和分子筛层析纯化目的蛋白。结果:(1)带His标签的目的蛋白大部分以包涵体形式存在于沉淀中;(2)截掉疏水区域并与增溶标签GST或NusA融合表达,再通过改变诱导表达条件,可以实现PDV1胞质侧结构域的可溶性表达;(3)比较目的蛋白可溶性表达量,选择高效可溶性表达体系,并在该条件下纯化得到高纯度目的蛋白。结论:PDV1胞质侧结构域的高效可溶性表达及纯化,为进一步研究该蛋白的结构及其在叶绿体分裂过程中的作用奠定了一定基础。     

绿竹SEP3-like蛋白表达纯化以及不同结构域互作研究

在双子叶植物中,SEPALLATA3(SEP3)参与生殖生长的很多方面,包括花分生组织和花器官的形成。但是在单子叶植物中,花器官形成的分子机制还不清楚。为了揭示单子叶植物中SEP3蛋白的结构以及聚合体的形成与生物学功能的关系,以单子叶植物绿竹Bambusa oldhami为材料,构建绿竹SEP3(BoSEP3)蛋白不同结构域原核表达载体,在大肠杆菌中进行重组蛋白诱导表达,获得不同结构域的可溶蛋白,通过镍柱及分子筛分离纯化表明,BoSEP3蛋白K结构域以四聚体形式存在;同时构建BoSEP3蛋白不同结构域的酵母表达载体,通过酵母双杂交系统检验BoSEP3蛋白同源互作表明,K结构域有参与形成多聚体的功能。实验提供了一套表达纯化BoSEP3蛋白以及检验蛋白质互作的有效方案,为开展BoSEP3蛋白功能和结构生物学研究奠定了基础。     

新型rhNDPK-A工程菌的构建及表达产物纯化研究

目的 :为简化纯化过程 ,获得有临床研究价值的rhNDPK -A蛋白 ,构建新型rhNDPK -A基因的表达质粒 ,利用 6×His标签以Ni+ -NTA亲和层析柱纯化蛋白。方法 :将抑癌基因nm2 3-H1从质粒PBVNMH1中亚克隆于带有纯化标签的表达载体pQE4 0中。IPTG诱导表达目的蛋白。通过镍离子螯合层析柱一步纯化法纯化目的蛋白。结果 :pQE - 4 0中亚克隆的nm2 3-H1序列完全正确 ;目的蛋白在大肠杆菌M15中的表达量可达 4 9.6 % ;Ni+ -NTA亲和层析柱一步纯化后蛋白纯度为 93%。结论 :构建了带有 6×His纯化标签的新型rhNDPK -A基因表达质粒pQE -nm2 3H1,所构建质粒能高效表达目的蛋白 ,利用Ni+ -NTA亲和层析柱简便高效地纯化了表达产物。     

豌豆Lhcb2基因在大肠杆菌中的高效表达及其表达产物与色素的重组

将豌豆的Lhcb2基因亚克隆至原核表达载体pET-3d上, 通过定点突变使其在大肠杆菌BL21 (DE3)中得到高效表达, 其表达量约占大肠杆菌总蛋白的40%, 经纯化后获得电泳纯的Lhcb2蛋白. 采用改进的液氮/室温冻融的重组方法将纯化的蛋白与色素进行重组, 建立了高效的重组系统. 重组后所获得的LHCB2单体与天然的LHCⅡ单体相比, 其在部分变性胶的电泳行为、低温荧光发射光谱和激发光谱, 以及室温吸收光谱等方面都非常相似, 说明大量表达的Lhcb2蛋白与色素已成功地重组, 并具有与天然LHCⅡ单体相类似的组成和结构.     

凝胶过滤与镍柱亲和纯化金葡菌a-溶血素重组蛋白的生物学特性比较

以在宿主菌株BL21(DE3)中成功表达的重组金黄色葡萄球菌a-溶血素蛋白为研究对象, 分析比较通过凝胶过滤层析(Gel filtration chromatography)和镍柱亲和层析纯化试剂盒(Ni-NTA spin columns)纯化所得到的重组蛋白的蛋白含量和生物特性方面的差异。SDS-PAGE分析检测纯化产物, Bradford法测定蛋白含量, 兔红细胞测定半数溶血效价。结果显示这2种方法得到的纯化产物在53 kD处均呈现单一清晰带, 达电泳级纯度。与此同时, 凝胶过滤对目的蛋白的纯化率为14.04%, 蛋白含量为0.337 mg/mL, 溶血活性为1519 HU/mg; 镍柱亲和层析的纯化率为17.5%, 蛋白含量为0.35 mg/mL, 溶血活性为1463 HU/mg。由此可见, 凝胶过滤得到的纯化产物在蛋白含量和蛋白活性方面丝毫不亚于镍柱亲和层析纯化试剂盒。     

凝胶过滤与镍柱亲和纯化金葡菌α-溶血素重组蛋白的生物学特性比较

以在宿主菌株BL21(DE3)中成功表达的重组金黄色葡萄球菌α-溶血素蛋白为研究对象,分析比较通过凝胶过滤层析(Gel filtration chromatography)和镍柱亲和层析纯化试剂盒(Ni-NTA spin columns)纯化所得到的重组蛋白的蛋白含量和生物特性方面的差异.SDS-PAGE分析检测纯化产物,Bradford法测定蛋白含量,兔红细胞测定半数溶血效价,结果显示这2种方法得到的纯化产物在53 kD处均呈现单一清晰带,达电泳级纯度.与此同时,凝胶过滤对目的蛋白的纯化率为14.04%,蛋白含量为0.337 mg/mL,溶血活性为1519 HU/mg;镍柱亲和层析的纯化率为17.5%,蛋白含量为0.35 mg/mL.溶血活性为1463 HU/mg.由此可见,凝胶过滤得到的纯化产物在蛋白含量和蛋白活性方面丝毫不亚于镍柱亲和层析纯化试剂盒.     

重组人色素上皮细胞衍生因子融合蛋白的制备及其抑制新生血管

目的：人色素上皮细胞衍生因子 (pigment epithelium-derived factor, PEDF)是一种有效的新生血管形成抑制因子和神经营养因子。本文通过原核细胞表达人PEDF蛋白,鉴定其抑制新生血管的生物学活性。方法：采用PCR法扩增人PEDFcDNA,将其克隆到pET32a载体中,在大肠杆菌BL21中表达人PEDF蛋白。经SDS-PAGE和Western-blot鉴定后,镍柱亲和层析法变性条件下纯化重组融合蛋白。Bradford法测蛋白浓度,采用鸡胚脲囊膜法测其对新生血管形成的影响。结果：成功构建了pET32a-PEDF表达载体。重组人PEDF蛋白在BL21宿主菌中获得了稳定高效表达,鸡胚脲囊膜实验结果显示在重组蛋白浓度为0.4、0.04 ng/ml时均有对新生血管的显著抑制作用（P<0.01）,而在4 ng/ml时无抑制作用。结论： 成功高效表达及纯化了重组人PEDF蛋白,鉴定其抑制新生血管的生物学活性,并且证实该活性在一定范围内有效,为进一步研究其功能及推广应用奠定了基础。     

酮古龙酸菌细胞色素c基因的克隆及表达

目的:从酮古龙酸菌SCB329中分离细胞色素c(Cytc)相关基因,在大肠杆菌中进行表达并验证。方法:根据酮古龙酸菌SCB329基因组序列设计引物,通过PCR从SCB329基因组中扩增cytc基因,酶切后连接pET22b表达载体,转化至大肠杆菌DH5α后提取质粒,经PCR、质粒双酶切及测序鉴定后,转入大肠杆菌BL21(DE3),并对表达条件进行考察;用Chelating Sepharose珠粒对可溶性的Cytc-His融合蛋白进行纯化;经光谱扫描和血红素染色等方法对表达蛋白定性分析。结果:PCR扩增的cytc基因长513 bp;重组菌在IPTG浓度为0.025 mmol/L的条件下,于28℃诱导10 h后,SDS-PAGE分析可见表达条带,相对分子质量约为18×103;Ni柱亲和层析纯化得到目的蛋白,纯化蛋白经光谱扫描呈现Cytc特征峰,血红素染色呈现阳性结果。结论:从酮古龙酸菌SCB329中分离得到一种cytc基因,并表达纯化了融合蛋白Cytc-His,纯化蛋白呈现Cytc特性,为研究酮古龙酸菌中产酸关键酶的电子传递机制奠定了基础。     

小檗色素的提取及其理化性质研究

研究了不同溶剂对小檗色素的提取效果,以及不同pH、不同金属离子、氧化剂和还原剂对该色素稳定性的影响。结果表明,小檗色素在40％的乙醇溶液及水中的溶解效果最好;在酸性条件下色素较稳定;铁离子对其有增色作用;氧化剂、还原剂对色素稳定性均有影响,其中以还原剂影响较大。通过对小檗色素理化性质的研究,表明该色素在化妆品、食品、染料、饮料等工业领域有很大的应用前景。     

人IGF-1在大肠杆菌中的可溶表达和纯化

目的:在大肠杆菌中的可溶表达和纯化人胰岛素样生长因子1(hIGF-1)。方法:根据hIGF-1的氨基酸序列和大肠杆菌密码子偏爱性,利用重叠延伸PCR的方法合成hIGF-1DNA序列,构建表达载体,在大肠杆菌OrigamiB(DE3)中与硫氧还蛋白TrxA融合表达,并通过盐析和镍柱亲合层析进行纯化。结果:SDS-PAGE分析显示,重组融合蛋白以可溶形式存在,分子量约为28kDa,占上清总蛋白的50%以上。经盐析和镍柱亲合层析进行纯化,目标蛋白纯度可达到90%左右。结论:复合干扰素在大肠杆菌中的高效可溶表达。     

异戊二烯合成酶(IspS)在大肠杆菌中的表达及其产异戊二烯的研究

将来源于银白杨的异戊二烯合成酶基因按照大肠杆菌密码子偏爱性进行优化,克隆到表达载体pACYCDu-et-1上,在大肠杆菌BL21(DE3)中异源表达,采用镍柱亲和层析纯化重组蛋白并测定其异戊二烯合成酶活性,通过摇瓶发酵实验对重组菌产异戊二烯进行进一步研究。结果显示:银白杨异戊二烯合成酶在大肠杆菌中能够高效表达,经过镍柱纯化后,电泳检测到特异性表达条带;该重组异戊二烯合成酶能够催化异戊二烯的合成,重组菌的异戊二烯产量可达到60μg/L。     

重组大肠杆菌表达水稻白叶枯病菌FtsZ蛋白

旨在通过现代分子生物学技术制备水稻白叶枯病菌FtsZ蛋白。以水稻白叶枯病菌总DNA为模板,采用巢式PCR方法扩增获得水稻白叶枯病菌fts Z基因,构建fts Z基因的表达载体p ET-22b-ftsZ,转化表达宿主E.coli BL21后,经PCR、Nde I/Xho I双酶切及测序鉴定、阳性克隆子经IPTG诱导表达,融合蛋白经镍柱纯化后,通过SDS-PAGE和Western blotting分析鉴定。结果显示,水稻白叶枯病菌ftsZ基因的重组表达载体构建成功,且阳性克隆子在IPTG的诱导下表达了Fts Z-6×His融合蛋白,并通过镍柱纯化获得了电泳纯的Fts Z-6×His融合蛋白。