环介导等温扩增联合横向流动试纸条可视化检测哈维氏弧菌的研究

以哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)为材料,利用环介导等温扩增技术(LAMP)进行核酸扩增,借助横向流动试纸条(LFD)完成产物检测,旨在建立一种可用于哈维氏弧菌快速检测的LAMP-LFD新技术。以哈维氏弧菌的溶血素基因(vhh A)为检测靶标设计了3对特异性引物(其中,上游内引物vhh A-FIP由生物素标记),进行由生物素标记的LAMP反应;同时设计1条异硫氰酸荧光素(FITC)标记的探针,与获得的LAMP产物进行特异性杂交,杂交产物经LFD完成检测。经优化,LAMP的反应条件为63℃反应40 min,由LFD完成结果判读共需50 min。结果表明,LAMP-LFD方法能特异性地检出哈维氏弧菌,对创伤弧菌等其他9种水产养殖重要病原菌的检测结果呈阴性。利用该方法,针对细菌纯培养物的检测灵敏度为1.0×102 CFU/m L或2 CFU/反应,针对污染有该菌的大黄鱼组织的检测灵敏度为5×102 CFU/m L或20 CFU/反应,均是以LAMP外引物vhh A-F3/vhh A-B3的常规PCR方法的100倍。因此,该方法能够快速、准确地检出哈维氏弧菌,有望在海水养殖过程哈维氏弧菌的监测和即时检测中普及使用。     

环介导等温扩增联合横向流动试纸条可视化检测志贺氏菌

【目的】将环介导等温扩增技术(LAMP)与横向流动试纸条(LFD)联合应用,建立一种可应用于志贺氏菌快速检测的LAMP-LFD技术。【方法】以福氏志贺氏菌的侵袭性质粒抗原H(ipa H)基因为检测靶标设计3对特异性引物(其中上游内引物Sfl-ipa H-FIP由生物素标记),进行LAMP反应;同时设计1条异硫氰酸荧光素(FITC)标记的探针Sfl-ipa H-HP,与获得的LAMP产物进行特异性杂交,杂交产物经LFD完成检测。【结果】优化后的LAMP反应条件为63°C 40 min,加上LFD结果判读共需50 min。LAMP-LFD方法能够特异性检测出福氏志贺氏菌,而对肠炎沙门氏菌等其它4种导致腹泻的致病菌和创伤弧菌等5种常见食物源性致病菌,以及4株不同大肠杆菌的检测结果呈阴性。该方法针对福氏志贺氏菌的检测灵敏度为1.0×10~2 CFU/m L或4 CFU/反应,针对人工污染鲤鱼肠组织的检测灵敏度是5.0×10~2 CFU/m L,是以LAMP外引物Sfl-ipa H-F3/Sfl-ipa H-B3的常规PCR方法的100倍。【结论】建立的LAMP-LFD技术具有操作简单、检测快速准确、检测成本低等优点,有望在志贺氏菌的常规监测和即时检测中被普及使用。     

水产品中创伤弧菌DNA环介导恒温扩增快速检测方法的建立及初步应用

创伤弧菌是一种重要的食源性致病菌,主要存在于河口和海洋环境中,严重危害水产养殖业的发展和人类健康。建立快速、准确、易操作的检测方法对防控创伤弧菌的传染,保障水产养殖业发展和增强食品安全意义重大。基于创伤弧菌vvHA基因,利用一种新型的核酸扩增技术-环介导恒温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP),建立了创伤弧菌LAMP快速检测方法。对11种共46株细菌进行扩增,仅创伤弧菌为LAMP阳性结果,说明LAMP方法具有高度特异性。灵敏度试验结果表明,对创伤弧菌纯培养菌的检测灵敏度为15CFU/ml,对污染食品中创伤弧菌的检测灵敏度为24CFU/g。此法40~60min内即可完成检测,检验检疫实践证明:LAMP方法操作简便、特异性强、灵敏度高且成本低廉,具有良好的应用前景。     

副溶血弧菌LAMP检测方法的建立

副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)是一种能引起食源性疾病的重要病原菌。首次将一种新颖的核酸扩增技术-环介导等温扩增技术（Loop-Mediated Isothermal Amplification, LAMP）应用于副溶血弧菌的快速检测。针对副溶血弧菌不耐热溶血毒素基因（tlh）设计四条特异性引物（两条内引物和两条外引物）进行LAMP扩增,对扩增反应进行优化,最佳反应时间为60 min,反应温度为60 ℃。对12种细菌共28株菌进行LAMP扩增,仅14株副溶血弧菌得到阳性扩增结果,证明引物具有很高的特异性。副溶血弧菌基因组DNA和纯培养物的检测灵敏度分别约为90 fg和24 cfu/mL。对模拟食品样品进行直接检测,检测限为89 cfu/g。结果表明,该方法检测副溶血弧菌特异性强、灵敏度高,并且操作简便、检测成本低,1 h即可完成,有望发展成为快速检测副溶血弧菌的有效手段。     

环介导恒温扩增法检测肺炎链球菌的研究

目的 建立环介导恒温扩增(LAMP)检测肺炎链球菌的方法.方法 用LAMP技术扩增肺炎链球菌菌株,并应用50例临床标本采用传统培养法、PCR法、LAMP法进行检测,比较3种方法的检出率,同时检测方法特异性和灵敏度.结果 所测肺炎链球菌均获扩增产物,对其他非肺炎链球菌无交叉反应.LAMP检测灵敏度可达102 CFU/mL.50例临床标本使用LAMP法检出9例肺炎链球菌阳性(18.0％),使用传统培养法检出阳性4例(8.0％).结论 LAMP法较传统培养检测方法特异性强、灵敏度高、操作方便、快速,适合临床标本的肺炎链球菌检测.     

DNA环介导恒温扩增技术快速检测霍乱弧菌

霍乱弧菌是一种重要的食源性致病菌,主要引起急性肠道传染病,其快速检测具有重要意义。根据霍乱弧菌的mdh管家基因序列,设计2对特异性检测引物,利用DNA环介导恒温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP),经反应体系优化,成功建立了霍乱弧菌的LAMP快速检测方法。该方法最佳反应温度为65℃,60min完成检测,对培养菌的检测限为25CFU/mL,污染食品中霍乱弧菌的检测限为32CFU/g。对33株同种或近源细菌进行LAMP检测,仅霍乱弧菌得到阳性扩增。LAMP方法实践应用结果表明,对1057份虾、蟹、牡蛎、肉类、人腹泻物等样本进行检测,共检出85份阳性,与国际标准(ISO TS21872-1-2007)检测结果的符合率为100%。结果表明,本研究建立的霍乱弧菌LAMP检测方法特异性强、灵敏度高、操作简便,有利于霍乱弧菌疫情的监测。     

水产品中创伤弧菌和副溶血弧菌 双重PCR检测方法的建立

目的建立一种同步检测创伤弧菌和副溶血弧菌的双重PCR方法。方法选择副溶血弧菌tlh基因和创伤弧菌vvhA基因作为靶序列各设计一对引物。用合成的引物对副溶血弧菌和创伤弧菌进行双重PCR扩增,确定特异性和最低检出限。然后用此方法对53株副溶血弧菌和7株创伤弧菌进行检测。结果确定了双重PCR检测创伤弧菌和副溶血弧菌的最优反应条件,其中退火温度为60℃,方法具有较好的特异性。对副溶血弧菌的最低限为1.0×10~2 CFU/mL,创伤弧菌最低限为4.2×10~4 CFU/mL。双重PCR对分离株检测符合率达100%。结论建立的双重PCR方法简便、快速、特异性好,可同时检测副溶血弧菌和创伤弧菌,为水产品中病原菌的基层检测提供解决方案。     

变性高效液相色谱技术对创伤弧菌检测的研究

应用PCR结合变性高效液相色谱技术对创伤弧菌进行检测,建立创伤弧菌快速准确的检测新方法。经过DHPLC分析条件优化,在DHPLC非变性温度下分析创伤弧菌特异性PCR扩增产物。同时进行方法特异性、灵敏度、重复性实验。实验结果表明所建立的创伤弧菌PCR-DHPLC检测方法特异性强、灵敏度高、重现性好、结果稳定可靠、检测时间短,检测低限可达到124 CFU/mL,是创伤弧菌快速检测的新技术。     

基于颜色判定的环介导恒温扩增法快速检测副溶血性弧菌

利用DNA环介导恒温核酸扩增法（LAMP）针对副溶血性弧菌特异基因tlh基因设计4条引物,通过引物特异性识别tlh基因上的6个独立区域来快速检测副溶血性弧菌.LAMP反应的过程中会产生白色沉淀焦磷酸镁,故可以通过监测浊度来判定反应结果.实时浊度仪监测反应结果表明,LAMP反应在60～65℃恒温条件下50min内完成;如果在反应前添加羟基萘酚兰（HNB）,蓝色的阳性结果很明显区别于紫色阴性结果;LAMP方法的最低检出限为9.74pg/μL,PCR方法最低检出限为97.4pg/μL,LAMP方法检测灵敏度是PCR方法检测灵敏度的10倍,且具有良好的特异性.LAMP方法用于快速检测副溶血性弧菌具有检测过程简单、实验装置简便、反应结果肉眼可辨别、灵敏度高和特异性强的特点,所以LAMP方法检测副溶血性弧菌特别适合用于现场和基层检疫及医疗单位的快速诊断.     

LAMP-LFD技术及其在生物快检方面应用

LAMP-LFD技术是环介导横温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification)与横向流动试纸条(Lateral flow dipstick)相结合的一种新颖的检测技术,该技术将核酸横温扩增和可视化试纸条检测有机地结合。环介导等温扩增技术(LAMP),只需要在恒温(60℃~65℃)条件下保温几十分钟,即可将所需目的基因扩增到109水平。横向流动试纸条(LFD),融合了免疫层析技术和分子生物学手段,能在纸条上形成有颜色的检测线从而可以特异性地检测出该目标产物。环介导横温扩增技术(LAMP)与横向流动试纸条(LFD)相互结合的技术,使LAMP扩增产物现场检测可视化,检测结果明显直观,通过肉眼即可辨认,并具有高特异性、高灵敏度、简便、安全及成本低的特点,一度引起科研工作者的广泛关注。综述了环介导横温扩增方法与横向流动试纸条相结合(LAMP-LFD)技术的原理、优势、及其在生物快速检测方面的应用等,并指出了LAMP-LFD技术目前存在的不足以及展望。     

LAMP实时浊度法检测转基因植物NPTⅡ基因

根据转基因植物常用的选择标记基因NPTⅡ(HE582394.1)的序列,设计6条特异性LAMP引物,利用实时浊度仪对反应体系中扩增产物的实时监控筛选出最佳引物,最终建立转基因植物NPTⅡ基因的LAMP检测方法,并对该方法的特异性、灵敏度、稳定性进行了评价。结果表明,该方法能够特异性检出含有NPTⅡ基因的植物及其加工产品,特异性高,灵敏度达0.5%。对转基因玉米MON863(含NPTⅡ基因)含量为10%、1%、0.5%、0%(W/W)的样品DNA分别进行扩增,其稳定性好,无假阳性和假阴性。所建立的LAMP方法适用于特异性筛选检测含NPTⅡ基因的植物及其加工样品。     

环介导恒温扩增技术快速检测溶藻弧菌

溶藻弧菌是中国南部水产养殖业中弧菌病的最主要病原菌,其快速检测具有重要意义.根据溶藻弧菌外膜蛋白OmpK基因序列,设计一套引物,通过条件优化.成功建立了针对致病性溶藻弧菌的环介导恒温扩增检测技术(loop-mediated isothennal amplification.LAMP).应用LAMP技术,在65℃温育1 h的条件下扩增溶藻弧菌基因组DNA.琼脂糖凝胶电泳得到特异性梯度条带.该研究建立的LAMP法特异性检出致病性溶藻弧菌,其检测下限比PCR法低一个数量级,相当于n(cell)=38/mL的菌液浓度,灵敏度更高.综合分析表明,LAMP技术是快速、简易、实地诊断溶藻弧菌的理想工具.     

一种检测储存喷气燃料中特征真菌的新方法——LAMP-LFD

利用环介导等温扩增(LAMP)与横向流动试纸快速检测技术(LFD)相结合,以Amorphotheca resinae的18S rRNA基因为靶序列,设计1套LAMP引物,建立了反应温度63℃、时间35 min。用喷气燃料中曾发现的4株真菌和A.resinae作为特异性试验菌株,LAMP-LFD法检测只有A.resinae呈阳性反应。A.resinae基因组DNA检测灵敏度为26 fg/μL;用已建立的LAMP-LFD方法对9个喷气燃料样品进行检测,其中有6个样品被检出存在A.resinae。结果表明该方法用于快速检测喷气燃料中的A.resinae耗时短、操作简便、特异性强、灵敏度高,有望用于为检测喷气燃料中特征真菌A.resinae的新方法。     

环介导等温扩增技术快速检测肉中单增李斯特菌

通过建立的环介导恒温扩增（Loop-Mediated Isothermal Amplification,LAMP）方法以达到肉中单增李斯特菌快速、灵敏的检出。以特异性的hlyA毒力基因作为靶基因,与6株非单增李斯特菌进行特异性试验,同时对不同培养浓度的单增李斯特菌进行了LAMP和PCR方法的灵敏度比较,进而应用LAMP法检测人工污染肉中的单增李斯特菌。结果表明：纯培养物中单增李斯特菌LAMP检出限为8.8×100CFU/mL,其灵敏度比普通PCR高100倍;在人工污染肉中单增李斯特菌的检出限为8.8×101CFU/mL,在1h内即可完成扩增反应。LAMP方法具备快速、特异、简单、灵敏度高等优势,在食品基质中单增李斯特菌的检测方面具有较好的应用前景。     

核酸试纸条在检测转EPSPS基因作物中的应用

目的:建立快速、简便和特异的检测转EPSPS基因作物的方法。方法:针对转EPSPS基因作物外源基因cp4-EPSPS的8个区域,设计2对特异性引物和1对环引物,对反应体系中的MgSO4、内引物、环引物、甜菜碱、dNTP浓度和反应温度等条件分别进行优化,并用核酸试纸条对扩增产物进行检测,建立用于检测转EPSPS基因作物的环介导等温扩增方法(LAMP)。结果:用建立的LAMP方法检测转EPSPS基因作物时,在64℃恒温反应30 min,即可根据试纸条显色直接观察结果;该方法具有高度特异性,可检测到10个拷贝的EPSPS DNA。结论:LAMP方法可快速、灵敏、特异、经济地检测转EPSPS基因作物,在基层和实验室都具有良好的应用前景。     

用基于TaqMan探针的Real-timePCR技术定量检测副溶血弧菌

副溶血弧菌是一种引起食源性疾病的重要病原菌,传统的鉴定方法费时费力且容易出现假阴性,建立一种定量检测副溶血弧菌基因的方法尤为重要。根据GenBank公布的副溶血弧菌的gyrB基因序列设计一对引物和TaqMan探针,建立了基于TaqMan探针的Realtime PCR方法。通过对9种细菌（12株菌株）的DNA进行扩增,结果所有4株副溶血弧菌均可产生扩增曲线,其他8株非副溶血弧菌均不产生扩增曲线,证明了引物和探针具有很高的特异性。细菌纯培养物品和人工布菌的检测敏感度分别为1 CFU/ PCR反应体系和10 CFU/PCR反应体系,相关系数均为0.99（r2＝0.99）,整个试验可在1h内完成。建立的方法可用于海产品中副溶血弧菌的快速定量检测。     

重组酶聚合酶扩增技术结合侧向流动试纸条快速检测锦鲤疱疹病毒

为建立一种快速、灵敏并适用于临床检测Ⅲ型鲤疱疹病毒(Cy HV-3, KHV)的方法,实验根据KHV SphI-5基因的保守序列片段设计引物及探针,采用重组酶聚合酶扩增技术结合侧流层析试纸条(RPA-LFD)检测KHV。重组酶聚合酶扩增技术(RPA)具恒温扩增及高灵敏度特点,简化了设备要求的同时又能做到高效检测病毒,再结合侧向流动试纸条(LFD)将RPA结果快速地可视化,提高了该疾病的检测效率。结果表明,在38℃的最适反应温度下,采用RPA-AGE技术仅需10min便可检测出病原的目标片段,结合LFD方法仅需5min便可将RPA结果通过试纸条可视化呈现。研究研发的KHV RPA-LFD检测方法简单、快捷,可为实验条件有限的养殖场快速诊断需求提供技术支撑。     

一步法PCR检测大鼠肺支原体核酸的研究

一步法体外扩增结合Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交检测Ｍ５３鼠肺支原体标准株,设计一对特异寡核苷酸引物及探针,合成、纯化、建立了特异、敏感、快速的检测手段。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定,结果显示鼠肺支原体Ｍ５３株基因组ＤＮＡ７１０ｂｐ特异谱带。对５０只ＳＤ大鼠进行检测,结果ＰＣＲ方法检出率高于分离培养法,扩增产物行Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ杂交验证,采用碱性磷酸酶标记寡核苷酸探针,可与膜上特异靶ＤＮＡ序列杂交,而阴性对照无杂交信号。特异性实验检出１０ｐｇ的ＤＮＡ。充分说明一步法ＰＣＲ,具有高度、特异、灵敏、快速等优势,适应与大、小鼠监测中应用。     

基因芯片技术检测3种肠道病原微生物方法的建立

目的:建立一种运用多重PCR和基因芯片技术检测和鉴定伤寒沙门氏菌、痢疾杆菌和单核细胞增生利斯特菌的方法。方法:分别选取伤寒沙门氏菌染色体ViaB区域中编码调控Vi抗原表达的基因(vipR)、痢疾杆菌编码侵袭质粒抗原H基因(ipaH)和单核细胞增生利斯特菌溶血素基因(hlyA)设计引物和探针,探针3'端进行氨基修饰,下游引物标记荧光素Cy3。在优化的PCR和杂交反应条件下,进行三重PCR扩增,产物与包括3种致病菌特异性探针的基因芯片杂交。在评价基因芯片的特异性和灵敏度之后,对临床样本进行检测。结果:只有3种目的致病菌的PCR产物在相应探针位置出现特异性信号,其他阴性细菌均无信号出现;3种致病菌的检测灵敏度均可达到103CFU/mL;检测30例临床样本的结果与常规细菌学培养结果一致。结论:所建立的可同时检测伤寒沙门氏菌、痢疾杆菌和单核细胞增生利斯特菌的基因芯片方法快速、准确,特异性高,重复性好,为3种肠道致病菌的快速检测和鉴定提供了新方法和新思路。     

环介导等温扩增技术快速检测肉中沙门氏菌

应用环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification,LAMP）建立了一种快速、高效、灵敏的肉中沙门氏菌的检测方法。针对沙门氏菌的属特异性基因invA设计2对引物,对人工污染肉样以及实际肉样分别进行检测。结果表明：所建立的LAMP反应能够特异性的检测沙门氏菌,对沙门氏菌纯菌的检测灵敏度为普通PCR的100倍,可达到9.8×100CFU/mL。LAMP检测人工污染沙门氏菌肉样的检测限为9.8×101CFU/mL。因此,本实验利用LAMP建立的沙门氏菌检测方法具有快速、灵敏、特异、操作简便的特点,具有广泛发展前景。