人工miRNA技术及其在植物抗病育种中的应用

内源miRNAs被认为是真核生物调控基因表达的重要调节因子,人工miRNA(amiRNA)是一种基于天然miRNA的结构用以沉默内源基因的有效策略。利用人工miRNA替换植物内源miRNA前体中miRNA/miRNA*序列,使产生的人工miRNA与靶基因配对,并特异性地抑制靶基因的表达。从天然miRNA的合成过程和作用机制,人工miRNA的设计基本原理及构建方法,人工miRNA技术在植物抗病育种上的应用等方面进行综述。     

拟南芥At5g01510和At5g49820基因人工microRNAs的构建与鉴定

以拟南芥内源MIR319a前体为骨架,构建沉默DUF647家族基因At5t01510和At5g49820表达的人工microRNAs,研究其对目的基因表达的抑制效果。利用WMD平台设计分别靶向At5g01510和At5g49820的amiRNAs序列,通过重叠PCR改造拟南芥MIR319a骨架序列,使其包含我们设计的特异amiRNAs序列。构建35S：：amiR-At5g0150和35S：：amiR-At5g49820融合基因,以农杆菌介导的花苞浸染法转化获得转基因拟南芥。RT-PCR分析表明,人工microRNAs能够显著抑制靶基因的表达,获得了抑制效果明显的转基因植株。本工作为进一步研究这两个基因的功能奠定了良好的基础。     

P119驱动amiRNA介导的PL基因沉默对草莓果实硬度的影响

果胶裂解酶基因(Pectate lyase,PL)是调控果实软化的重要靶点。本研究测定了红颜草莓果实在发育过程中果胶裂解酶活性变化和硬度变化规律,并通过人工小干扰RNA(artificial micro-interfering RNA interference,amiRNA)技术,以拟南芥miR390a前体序列作为沉默PL基因的骨架,在番茄果实特异性启动子P119的驱动下,通过农杆菌介导转入草莓果实中瞬时表达,通过RT-PCR分析草莓瞬时转染后PL基因的表达量,并检测了PL沉默对果实硬度的影响。结果表明,随着草莓果实发育的推进,果胶裂解酶活性呈逐渐上升趋势,与果实硬度呈负相关;构建了基于拟南芥miR390a为骨架的amiRNA靶向栽培草莓中的PL基因;在番茄果实特异性启动子P119驱动下,miRNA前体可以在草莓果实中瞬时表达;草莓果实中总PL基因表达量下降达34. 5%;基因沉默组果实硬度比对照组更高,且沉默对果实颜色发育进程无明显影响。该结果表明:果胶裂解酶主要在果实发育后期调节细胞壁的解离,采用amiRNA沉默PL基因可以延缓草莓果实软化进程。     

人工microRNAs对拟南芥At1g13770和At2g23470基因的特异沉默

DUF647(Domain of unknown function 647)蛋白家族是在真核生物中广泛存在的、高度保守的蛋白家族。拟南芥中该基因家族共有6个成员,迄今为止拟南芥DUF647家族中4个成员的功能尚不清楚。文章以拟南芥内源MIR319a前体为骨架,构建了敲减DUF647家族中2个基因At1g13770和At2g23470表达的人工microRNAs(Artifical microRNAs,amiRNAs)。利用WMD(Web microRNA designer)平台设计分别靶向At1g13770和At2g23470基因的amiRNAs序列,通过重叠PCR置换拟南芥MIR319a前体序列。构建融合amiRNAs前体的植物表达载体pCHF3-amiRNAs,在农杆菌介导下转化拟南芥。RT-PCR分析表明,amiRNAs能够显著抑制At1g13770和At2g23470基因的表达,获得了抑制效果明显的转基因株系。At2g23470-amiRNA转基因植株At2g23470转录水平的下调导致育性严重下降。文章为进一步研究这两个基因的功能奠定了良好的基础。     

人工microRNAs对拟南芥At1g13770和At2g23470基因的特异沉默

DUF647 (Domain of unknown function 647) 蛋白家族是在真核生物中广泛存在的、高度保守的蛋白家族。拟南芥中该基因家族共有6个成员, 迄今为止拟南芥DUF647家族中4个成员的功能尚不清楚。文章以拟南芥内源MIR319a前体为骨架, 构建了敲减DUF647家族中2个基因At1g13770和At2g23470表达的人工microRNAs(Artifical microRNAs, amiRNAs)。利用WMD(Web microRNA designer)平台设计分别靶向At1g13770和At2g23470基因的amiRNAs序列, 通过重叠PCR置换拟南芥MIR319a前体序列。构建融合amiRNAs前体的植物表达载体pCHF3-amiRNAs, 在农杆菌介导下转化拟南芥。RT-PCR分析表明, amiRNAs能够显著抑制At1g13770和At2g23470基因的表达, 获得了抑制效果明显的转基因株系。At2g23470-amiRNA转基因植株At2g23470转录水平的下调导致育性严重下降。文章为进一步研究这两个基因的功能奠定了良好的基础。     

人工 microRNA 技术研究进展

RNA干扰（RNAi）是由双链RNA触发的在mRNA水平进行的特异靶序列的基因沉默现象,广泛存在于动物、植物和病毒中,主要包括小干扰RNA（siRNA）及微小RNA（miRNA）两种作用途径。人工miRNA（amiRNA）是将天然miRNA的成熟序列替换成人工设计的靶向其他感兴趣基因的反义序列,通过天然miRNA的生成和作用途径达到RNAi的效果,具有干扰效果明显、作用迅速、毒性低等优点,拥有广阔的应用前景。我们对基于amiRNA的基因沉默技术进行了较为系统的介绍和总结,梳理了该技术的优缺点和适用范围,并展望了其进一步发展的方向和应用前景。     

基于烟草瞬时表达体系对amiRNA沉默效果快速有效的预验证

amiRNA(artificial microRNA)作为一种诱导基因发生特异性沉默的技术已在多种植物中应用,但设计出的不同amiRNAs在所转化株系中的沉默效率难以预测,因此对amiRNA载体的沉默效率进行预验证是非常必要的。本实验以丹参(Salvia miltiorrhiza)的1个MYB类转录因子基因SmPAP1的mRNA序列为amiRNA作用对象,并挑选2个经在线软件WMD3(Web MicroRNA Designer)设计的amiRNAs,分别命名为amiRNA1-SmPAP1和amiRNA2-SmPAP1,然后通过农杆菌介导将构建的2个amiRNA载体和SmPAP1过表达植物载体在烟草叶片细胞中进行瞬时共表达。结果显示,amiRNA2的表达丰度约是amiRNA1的2倍;amiRNA2对靶标SmPAP1的沉默效率约是amiRNA1的2.5倍;SmPAP1在mRNA和蛋白水平上均与相应amiRNA的表达水平呈显著负相关。因此,amiRNA在烟草细胞中的瞬时表达可快速、有效地对不同amiRNA沉默效果进行预验证,从而为后续的植物遗传转化研究提供重要参考。     

小分子RNA表达载体构建的新方法——MicroRNA前体PCR置换法

MicroRNA(miRNA)基因的终产物是进化上高度保守的、具有基因表达调控功能的非编码小分子RNA。miRNA的特征性发卡环前体(pre-miRNAs)在体内经数步加工后,与AGO蛋白构成沉默复合体(RISC)以行使其功能。如将已知pre-miRNAs上的miRNA成熟链和互补链(miRNA*)分别置换为有待研究的小分子RNA,并构建表达载体转化植株,利用转化株内源的miRNA成熟加工体系,可以产生预设的小分子RNA。利用已知拟南芥miRNA前体为模板,使用替换PCR的方法,人工构建了gso8-ap-miRNA-pBI121表达载体。利用农杆菌介导法转化拟南芥,多数T1代植株表现出提早开花的突变表型。该方法是一种简便、高效的构建小分子RNA表达载体的方法。     

基于miRNA-155结构的人工miRNA表达载体的构建与评价

目的:建立一种适用于人工miRNA(amiRNA)表达研究的克隆载体。方法:基于实验室构建的短发夹RNA(shRNA)表达载体pshOK-basic,将鼠源miRNA-155的侧翼序列插入合适的酶切位点构建得到amiRNA重组表达载体pOK-basic;应用本载体分别构建靶向萤火虫荧光素酶(luc2)和红色荧光蛋白(mCherry)基因的amiRNA并检测其沉默效果。结果:应用此载体能快速高效地构建amiRNA,靶向luc2和mCherry报告基因的amiRNA能较好地抑制靶基因的表达。结论:构建了一种能高效表达amiRNA的克隆载体,为amiRNA的进一步研究及应用奠定了基础。     

基于EST和GSS序列的玉米未知微RNA的数据挖掘

miRNAs通过与靶基因互补位点配对结合,在转录后水平负性调控靶基因的表达.根据miRNA进化上的保守性,以拟南芥、水稻等已知的植物miRNAs为探针,与相关数据库中玉米表达序列标签(EST)和基因组序列(GSS)中的非编码序列比对,采用一系列的标准进行筛选,最后预测得到24个玉米miRNA前体,通过靶基因的预测共得到61个靶基因.通过生物信息学方法大大提高了人们发现miRNAs及其靶基因的效率,补充了玉米miRNA数据库的不足.     

毛竹miR164b前体的克隆及其在叶形态建成中的功能分析

microRNA（miRNA）参与植物多种生理代谢过程,在调控植物形态建成中发挥着重要作用。miR164作为植物特有的miRNA,其主要的靶基因是NAC转录因子,参与调控植物茎、叶顶端分生组织的建立、器官的分化和植株衰老等过程。本研究以毛竹（Phyllostachys edulis（Carr.） Lehaie）为材料,从中分离出miR164b的前体序列（82 bp）,二级结构分析结果发现该前体序列能够形成稳定的茎环结构,其成熟序列（21 bp）产生于茎环结构5'端的臂上,且碱基具有较高的保守性。本研究还构建了由CaMV 35S启动,包含毛竹miR164b前体序列的植物表达载体,并转化野生型拟南芥（Arabidopsis thaliana（L.） Heynh）,获得了转基因植株。结果表明,转基因植株生长瘦弱,莲座叶数量明显减少,叶片变小且叶片边缘锯齿减少,更加光滑。实时定量PCR分析结果显示,转基因拟南芥中毛竹miR164b的表达量极显著上升,而拟南芥内源靶基因CUC1与CUC2的表达量极显著下降。表明毛竹miR164b通过调节CUC1和CUC2的表达来参与植物叶形态建成过程。研究结果可为利用miRNA开展竹子分子育种提供参考。     

gma-miR1507a生物信息学分析、植物表达载体的构建及遗传转化

miRNA(microRNA)是一类长度为18~25nt的内源性非编码小分子RNA,通过对其靶基因mRNA的降解或抑制翻译来调控基因表达,进而参与调控植物相关的生理活动。该研究分析gma-miR1507a的成熟体序列、茎环结构和前体启动子区域的顺式作用元件并检测了逆境处理下大豆组织中gma-miR1507a的水平;使用psRNATarget在线软件预测了gma-miR1507a的靶基因;构建植物表达载体amiRNA1507a-pCAMBIA2301并转化大豆子叶,获得了发状根。结果发现,gma-miR1507a前体的启动子区域存在与干旱胁迫和病菌侵染相关的顺式作用元件;在线软件psRNATarget预测到9个gma-miR1507a的靶基因;该研究利用发状根介导的遗传转化结合GFP染色,确定阳性发状根;在转基因根毛中,gma-miR1507a水平与空载相比显著提高,预测的部分靶基因表达量显著下调。以上结果显示,过表达amiRNA1507a能够提高大豆发状根中gma-miR1507a水平,为研究gma-miR1507a的功能奠定基础。同时,gma-miR1507a可能参与调控大豆的逆境胁迫。     

一种新的植物miRNA体内下调表达系统

MicroRNA(miRNA)是一种内源性的21到24个核苷酸长度的小分子RNA,在植物发育过程中起重要作用。旨在建立一种新的植物miRNA下调表达系统,为miRNA的功能研究提供有力的工具。不同于原有target mimicry的构建方法,以miRNA核心序列为基础,通过设计特定DNA引物,利用聚合酶链式反应(PCR)获得多拷贝的靶基因类似序列(Target mimicry or target mimics),构建target mimicry载体,转化拟南芥。通过qRT-PCR验证miRNA靶基因在转基因植株中的表达。以拟南芥6个保守miRNA为基础,获得了各个miRNA下调表达转基因株系,在转基因植株中检测miRNA靶基因的表达,与野生型相比差异明显,均发生了明显的上调。我们基于一种新的target mimicry的载体构建方法,成功建立了一种在植物中具有普遍适用性的高效miRNA低表达系统。     

amiRNA分子设计及其离体合成策略

详细介绍了基于WMD3 (Web MicroRNA Designer 3) 软件平台的amiRNA (artificial microRNA)分子自动设计方法及其离体合成策略。应用网络在线设计时,只需输入目的基因靶序列相关信息后便可获得候选amiRNA。根据选定的最佳amiRNA,可得到四条含有amiRNA以及载体中miRNA 两侧序列的寡聚核苷酸序列。重叠延伸PCR合成策略可以以这四条序列以及根据质粒模板设计的A、B两段序列作为引物,扩增出目标amiRNA。同样尿嘧啶切除的策略也可合成amiRNA,但这些引物序列需做适当调整变动。此外,本文还介绍了基于特异引物退火的amiRNA合成策略,该策略可保证amiRNA分子能够一步PCR合成,合成后的amiRNA表达盒可通过合适的限制性位点被克隆至目的载体中的相应位点。可以预见,这种amiRNA分子设计的科学性与合成策略的精确性将会使amiRNAi技术在生物基因功能分析中发挥更加重要的作用,对生命科学研究产生深远的影响。     

人工microRNA干扰拟南芥AtCDKC;1和AtCDKC;2基因表达的初步研究

以来源于拟南芥的microRNA序列为骨架,构建抑制AtCDKC;1和AtCDKC;2基因的人工microRNAs载体,研究其对目的基因表达的抑制效果。选择AtCDKCs基因的特异性序列,通过重叠PCR的方法改造拟南芥microRNA164a骨架序列,连接到双元载体pPZPY122,在农杆菌介导下转化拟南芥。RT-PCR分析表明,人工microRNA能够显著抑制目的基因的表达,获得了抑制效果明显的转基因植株,并且对AtCDKCs在拟南芥生长发育中的作用进行了初步的研究。     

靶向HIV-1 vif的高效人工miRNA的构建及慢病毒介导的体外抗病毒研究

RNAi在HIV-1的治疗研究中得到了广泛的应用,构建高效并且安全的RNAi抗病毒元件是开展相关研究的基础。vif37是以前的研究中筛选获得的靶向HIV-1 vif的高抑制效率兼具保守性的RNAi靶点。miRNA在抑制效率和启动子的选择上比常用的shRNA具有优势。本研究探索以人工miRNA结构引发vif37靶点对应的RNAi。本研究以天然的miR-155前体为骨架,采用步移的方式设计了3个靶向vif37的人工miRNA,以RNA聚合酶Ⅱ类启动子指导表达。miRNA表达质粒和HIV-1的感染性克隆pNL4-3共转染的结果显示,3个人工miR-NA中只有miR-vif37H具有抑制效果,效率与shRNA-vif37相当。与携带靶序列的荧光素酶报告质粒共转染实验证明miR-vif37H具有良好的抑制特异性。用表达miR-vif37H的重组慢病毒转导HIV-1的敏感细胞MT-4,克隆化后获得稳定表达miR-vif37H的细胞株MT-4-miR37H,该细胞可以有效抑制HIV-1的体外复制。实时RT-PCR检测结果显示,与shRNA-vif37相比,miR-vif37H的表达水平明显下降,安全性更好。进一步的实时RT-PCR检测结果还显示,miR-vif37H在细胞内的稳定表达不会影响内源代表性miRNA(miR-181和miR-16)的加工以及干扰素应答相关基因Stat1的mRNA水平。miR-vif37H是一个特异的高效RNAi元件,为vif37靶点的进一步应用研究奠定了基础。     

miR319a及其靶基因在木薯中的低温响应分析

旨在探索mi RNA在木薯低温逆境中的调控作用,前期小RNA测序筛选出mi R319对低温显著响应,通过实时定量PCR方法分析mi R319与其4个不同靶基因在两个木薯品种的4种低温处理下的差异表达情况。结果显示,mi RNA与其靶基因在两个不同木薯品种间的响应不同,4个低温处理间的响应也不同,mi RNA与各个靶基因的相关系数也不同。比较发现在C4中mi R319a与3个靶基因(GSTU8除外)负相关性均好于SC124,处理之间在NAH中的负相关表现最典型,mi R319与4个靶基因之间的相关系数从大到小的顺序为:MYB33UnknownTCP4GSTU8,预示着MYB33和Unknown(021030m)两个靶基因在C4的NAH中是mi R319a更为优先的调控目标。结果表明在木薯的低温逆境适应过程中mi R319对MYB33和Unknown两个靶基因的调控作用值得深入研究。     

PLOD3基因3’调控区的人类特异突变改变miR-124a对PLOD3的调控

microRNAs(miRNAs)是一类在转录后水平调控基因表达的不编码蛋白质的小RNA(长度20-24个碱基).其中,miR-124a是一个在哺乳动物中枢神经系统高度表达的miRNA,在神经前体细胞向神经元分化的过程中起着举足轻重的作用.由于miRNAs特异性地识别靶基因的3'端调控区(3'UTR)的靶序列,因此,在人类起源过程中基因3'UTR的单核苷酸序列变异有可能导致miRNA调控的改变.通过靶基因预测和3'UTR区在哺乳动物代表物种间的同源序列比较,我们发现miR-124a的靶基冈中有一个基因(PLOD3)3UTR的靶位点中存在人类特异突变位点.利用体外报告基因系统,发现PLOD3基因3'UTR靶位点中所含的一个人类特异的突变导致miR-124a对PLOD3的调控效率降低.研究表明,miRNAs靶基因3'UTR的序列变异具有功能效应,它有可能足人类中枢神经系统在起源和演化中发挥关键作用的重要遗传机制之一.     

红花microRNAs靶基因的生物信息学预测

miRNA是一类动、植物细胞中负责转录后调控的非编码RNA,植物的miRNA通常来源于具有茎环结构的单链RNA前体上,加工成熟后同ARGONAUTE转变成蛋白复合体结构,通过结合并沉默蛋白合成模板的方式关闭完整的基因表达网络。由于miRNA存在组织表达的特异性,且miRNA在植物中的表达高度保守。通过高通量测序获得的红花(Carthamus tinctorious L.)miRNA序列信息与红花转录EST数据库比对,通过靶基因预测筛选,对属于104个家族的173个红花miRNA进行预测,其中得到109个miRNAs对应调控的385个红花靶基因。并且通过Nr基因注释表明多数红花miRNA的靶基因编码包括调控细胞生长发育、信号转导及新陈代谢等相关的功能蛋白。     

玉米microRNAs及其靶基因的生物信息学预测

microRNAs (miRNAs) 是一类非编码的小分子RNA, 通过碱基互补调控靶基因的表达。鉴定和发现新的miRNAs及其靶基因, 对揭示miRNAs在基因表达调控中的作用至关重要。玉米全基因组测序工作开展较晚, 已经鉴定登记的miRNAs很少, 对靶基因的调控作用尚待解明。文章根据miRNA进化上的保守性, 以已知的植物miRNAs为探针, 与相关数据库中玉米表达序列标签(EST)和基因组序列(GSS)中的非编码序列比对, 共发现11个新的miRNA前体。虽然在序列长度和二级结构方面各有变化, 但这11个前体均可折叠形成miRNA家族的标准二级结构。通过靶基因预测, 找到其中7条miRNAs的26个靶基因, 分别编码与新陈代谢、信号转导、转录调节、跨膜运输、生物和非生物胁迫及叶绿体组装等相关的蛋白。这些miRNAs及其靶基因的鉴定, 补充了miRNA数据库的不足。