白叶枯病菌胞内蛋白的提取及电泳分离方法的构建

水稻白叶枯病菌已成为研究植物-病原物互作模式的病菌。要利用蛋白质组学方法深入研究其生物学特性和致病机理,人们面临着其胞内蛋白提取和有效分离方法尚未建立的问题。本文采用TCA丙酮沉淀法和裂解液沉淀法提取白叶枯病菌胞内蛋白,利用两种等点聚焦程序(IEFⅠ,IEFⅡ)进行一向等电聚焦,用三种蛋白上样浓度(400μg,600μg,800μg)进行双向电泳,G-250烤染后,通过Imagemaster软件对双向电泳图谱进行比较分析。结果表明,裂解液沉淀法、等电聚焦程序Ⅱ(IEFⅡ)、600μg上样浓度三者相结合的方法是提取和分离白叶枯病菌胞内蛋白的理想方法,能获得较好的实验效果。该方法的建立为白叶枯病菌蛋白质组学研究奠定基础。     

蚜虫全蛋白提取方法的比较研究

为建立适于SDS-PAGE分析的蚜虫蛋白质样品制备平台,以便为蚜虫蛋白质的双向电泳分析奠定基础,本研究比较了TCA/丙酮沉淀、PEG提取、饱和酚抽提和直接裂解4种蛋白质提取方法.结果表明:不同样品制备方法的蛋白提取率有显著的差异,其中直接裂解法的提取率最高,为17.43 mg/g;其次是饱和酚抽提法,提取率为12.30 mg/g;而PEG制备法提取率最低,只有7.96 mg/g.利用SDS-PAGE电泳对不同的蛋白质样品进行了分析,发现在凝胶图谱上显现的条带也有明显的差异,其中饱和酚抽提法显现的条带数最多,为36条,且从14.4 kDa～116.0 kDa范围有广泛分布,条带清晰;PEG提取法条带数为30条,一些蛋白条带丢失或不明显;TCA/丙酮沉淀法的蛋白条带集中分布在25.0 kDa～67.0 kDa区域;直接裂解法条带数仅为24条,且小分子量的条带可辩率很低.通过以上结果可以得出,饱和酚抽提法最适用于蚜虫全蛋白样品的制备.     

粤、闽、贵烟草青枯病菌分离株及其致病力

【目的】从粤、闽、贵3地烟草青枯病株中分离青枯病菌,测定其致病力并探讨判断致病力的方法。【方法】采用氯化三苯基四氮唑(简称TTC)培养基和蛋白质电泳相结合对青枯病菌致病力进行测定,并分析菌株生化型。【结果】已分离出烟草青枯病菌59株,依据致病力进行划分,无致病力菌株5株,有致病力菌株54株。不同致病力菌株蛋白电泳特定条带存在差异。粤、闽、贵3地烟草青枯病菌有致病力菌株均占主导地位,广东有致病力菌株比例略大,福建次之,贵州最小。按生化型划分,59株青枯病菌中1株属于生化型Ⅳ外,其他58株属于生化型Ⅲ或其亚型生化型Ⅲ-1。【结论】烟草青枯病菌致病力存在差异,SDS-PAGE蛋白指纹中的特定条带可作为判定青枯病菌有无致病力的依据。     

三种李斯特菌菌体蛋白提取方法的比较

通过对3种李斯特菌菌体蛋白提取方法主要是破壁方式的比较,找到一种可高效提取李斯特菌菌体蛋白的方法,为该菌的深入研究提供可靠技术。以绵羊李斯特菌新鲜液体培养物为材料,收集菌沉淀,分别选用3种破壁方式破除细胞壁,三氯乙酸(trichloroacetic acid,TCA)-丙酮沉淀法沉淀破壁液中的菌体蛋白,采用聚丙烯酰氨凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)和Western-blot分析所得菌体蛋白。溶菌酶-超声破壁-TCA-丙酮沉淀法提取得到的李斯特菌菌体蛋白SDS-PAGE条带清晰丰富,Western-blot条带特异。溶菌酶-超声破壁-TCA-丙酮沉淀法可有效提取李斯特菌菌体蛋白,满足常用蛋白分析技术的要求,是一种提取李斯特菌菌体蛋白的可靠方法。     

油菜黄化突变体蛋白质组分析：两种蛋白质提取方法比较

以芥菜型油菜黄化突变体L638-y及其野生型L638-g五叶期叶片为材料,用IEF/SDS-PAGE双向凝胶电泳技术对两种不同蛋白质提取方法(TCA/丙酮沉淀法和改进的PEG分级沉淀法)进行了比较,同时在IPG胶条pH范围及SDS-PAGE胶浓度选择上进行了探索与优化．结果表明,以pH 4～7 17 cm的线性IPG胶条进行IEF,11% SDS-PAGE进行第二向电泳,每350 μl体系上样量为180 μg,蛋白质可以得到较好的分离,2-DE图谱质量最佳．用改进的PEG分级沉淀法提取的突变体L638-y叶片总蛋白的2-DE图谱可清晰识别的蛋白质点数目为(1235 ± 6)个,比TCA/丙酮沉淀法多识别出330个蛋白质点;用该方法提取蛋白质时,在突变体L638-y与其野生型L638-g叶片总蛋白2-DE图谱上可识别出差异蛋白质点数目为190个,比用TCA/丙酮沉淀法提取蛋白质时多鉴别出100个差异蛋白质点．由此表明,研究芥菜型油菜黄化突变体L638-y叶片蛋白质组变化,采用改进的PEG分级沉淀法提取蛋白质更为简单有效．     

芽胞杆菌菌体蛋白提取方法的比较

目的：比较不同破碎方法下3种芽胞杆菌菌体蛋白的提取效果。方法：以菊酯类农药降解菌巨大芽胞杆菌、球形芽胞杆菌、弯曲芽胞杆菌为研究对象,以裂解液为提取介质,分别采用超声波破碎法、水煮法和机械破碎法提取芽胞杆菌蛋白,并通过革兰染色电镜观察菌株破碎程度,用SDS-PAGE和Bradford法测定蛋白浓度。结果：革兰染色电镜观察发现玻璃珠机械破碎法对3种芽孢杆菌的细胞壁破碎程度最明显,其次为超声波破碎法,水煮法破碎效果不明显。SDS-PAGE和Bradford法测定结果表明,巨大芽胞杆菌、球形芽胞杆菌、弯曲芽胞杆菌经玻璃珠机械破碎后,提取的蛋白图谱条带清晰,丰度高,重复性好,含量分别为20.247、19.902和18.893 mg/mL;经超声波破碎提取的蛋白图谱条带较清晰,丰度一般,重复性不好,含量分别为10.572、9.438和10.424 mg/mL;经沸水浴破碎提取的蛋白图谱条带模糊,丰度低,重复性差,含量分别为1.366、1.119和1.136 mg/mL。结论：玻璃珠机械破碎法是破碎3种芽胞杆菌的最优方法,破碎后提取的蛋白含量高,条带清晰,重复性好。     

线虫surface coat proteins提取方法的建立与双向电泳分析

目的:建立一套适用于蛋白质双向电泳体系的线虫surface coat proteins(SCPs)样品制备技术,为今后研究线虫surfacecoat蛋白质组学及线虫病理生理学奠定基础.方法:以秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)为研究材料,对比和分析不同的蛋白提取沉淀方法,进而采用SDS-PAGE电泳技术和双向电泳技术对所提蛋白进行评价.结果:通过35%乙醇结合TCA-丙酮沉淀法获得的质量较好的线虫SCPs,在12%的SDS-PAGE分析中该法提取的蛋白背景浅,蛋白条带多且清晰尖锐,含有丰富的蛋白信息量.通过双向电泳分析,可从提取的蛋白中鉴定出清晰蛋白点400多个.随机选择5个蛋白斑点,进行基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱鉴定,鉴定得到高度匹配的已知线虫蛋白质2个.结论:所建立的方法可为今后研究线虫surface coat蛋白质组学及线虫病理生理学提供重要工具.     

红螯螯虾感光器中Gq蛋白的鉴定及光波长对其含量的影响

用蛋白质常规提取方法分别提取红螯螯虾复眼视网膜的可溶性和膜结合蛋白质,用SDS-PAGE和免疫印迹法进行G蛋白的分离和鉴定;在经光、暗适应及红、绿、蓝、黄4种波长光照处理后,对其感光器中G蛋白分别进行SDS-PAGE分析.暗适应、自然光及4种波长光适应的感光器可溶性蛋白、膜结合蛋白条带数量和分子量大小基本相同,在42?kD处都出现一条清晰的蛋白条带.兔抗Gαq-11多克隆抗体能识别这一蛋白条带.表明红螯螯虾感光器中存在可溶性和膜结合Gq蛋白α亚基,分子量为42?kD.在不同光照条件下感光器中可溶性和膜结合Gqα亚基的含量有差异.可溶性Gqα蛋白占总蛋白的百分含量依次为:日光(7.71%)>黄光(7.32%)>红光(7.06%)>暗适应(6.94%)>蓝光(6.46%)>绿光(5.74%);除暗适应与红光之间差异不显著外,红光与黄光差异显著,其余差异极显著.而膜结合Gqα亚基的百分含量则相反,依次为:绿光(13.94%)>蓝光(10.56%)>暗适应(10.25%)>红光(10.14%)>黄光(9.76%)>日光(9.44%);除暗适应与红光差异不显著外,红光与黄光差异显著,其余差异极显著.推测红螯螯虾感光器中Gq蛋白的激活与光照刺激的波长有关,其感光器对不同波长光刺激的敏感度有差别.     

适用于双向电泳分析的水稻悬浮细胞外分泌蛋白提取方法

目的:建立适用于双向电泳分析的水稻悬浮细胞外分泌蛋白提取方法。方法:采用酚抽提结合甲醇醋酸铵沉淀法、三氯乙酸-丙酮沉淀法和硫酸铵沉淀等3种方法制备水稻悬浮细胞外分泌蛋白,并进行双向电泳分析;利用Western印迹对候选方法提取的外分泌蛋白进行纯度检测。另外,还利用质谱技术对从双向电泳胶上随机挑选的9个蛋白点进行测定,并用SignalP 3.0 Server对测定的蛋白点进行信号肽预测。结果:酚抽提结合甲醇醋酸铵沉淀法提取的外分泌蛋白得率最高,且双向电泳图谱清晰,并能检测到最多的蛋白点;Western印迹表明利用该法所提取的外分泌蛋白未被细胞内蛋白质污染。利用质谱技术鉴定了随机挑选的9个蛋白点,SignalP 3.0 Server分析表明其中6个蛋白含有信号肽。结论:酚抽提结合甲醇醋酸铵沉淀法是一种适用于双向电泳分析的水稻悬浮细胞外分泌蛋白提取方法。     

海带内生芽胞杆菌DNN7和HSN2胞外蛋白抗肿瘤活性初步研究

为检测海带内生芽胞杆菌DNN7和HSN2胞外蛋白的抗肿瘤活性,用0.22μm滤膜过滤将海带内生芽胞杆菌DNN7和HSN2的菌体和发酵液分开,用硫酸铵沉淀发酵液的蛋白组分并用SDS-PAGE检测,用海虾毒性法和MTT法检测胞外蛋白的抗肿瘤活性。结果表明,海带内生芽胞杆菌DNN7的粗蛋白主要由分子量约为66×103、52×103和34×103的3条带组成,HSN2的粗蛋白主要由分子量约为44×103和52×103的2条带组成。DNN7胞外蛋白对体外慢性粒细胞白血病癌细胞K562、肝肿瘤细胞HepG2和乳腺癌细胞MDA-MB-231均具有较好的抑制活性,其抑制率分别高达96.46%、42.99%和85.70%;HSN2胞外蛋白对体外慢性粒细胞白血病癌细胞K562、肝肿瘤细胞HepG2和乳腺癌细胞MDA-MB-231也具有较好的抑制活性,其抑制率分别为92.65%、66.80%、88.48%。     

拟南芥细胞异三聚体G蛋白的分离纯化

以拟南芥哥伦比亚Columbia(Col-0)野生型悬浮培养细胞为材料,采用超声波破碎、匀浆、离心、40%~60%饱和度硫酸铵分步沉淀、Sephadex G-25脱盐、DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换、Sephadex G-200凝胶过滤,最后经过Sepharose CL-6B得到纯化的目的蛋白,蛋白收率为0.097%。纯化的蛋白质经非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定显示为一条带,经Western blotting证实为G蛋白。把经Native-PAGE鉴定的蛋白质的条带回收,进行SDS-PAGE显示有3条带。一条是Gα亚基,其分子量为60kDa左右;另外2条带分子量为45kDa和35kDa,可能是β、γ亚基,初步证实拟南芥中存在异三聚体G蛋白。G蛋白提取方法的建立为在基因突变型拟南芥中G蛋白功能的研究奠定基础。     

白芸豆球蛋白的提取及其氨基酸组成研究

本文研究了白芸豆球蛋白的提取工艺、分子量和氨基酸组成。结果表明,白芸豆球蛋白最佳提取工艺为NaCl浓度2.5 g/100 mL,料液比1∶22(g/mL),提取温度55℃,提取时间5 h,在此条件下的球蛋白提取率为31.46%;用60%的硫酸铵,在4℃下盐析1 h,球蛋白的盐析得率为73.55%;球蛋白的SDS-PAGE电泳图谱中有6条蛋白亚基条带,其相对分子质量分别为97.52、47.35、33.84、29.62、26.28和21.99 ku,其中有5条与白芸豆分离蛋白的亚基条带相吻合;球蛋白的氨基酸组成种类齐全,必需氨基酸含量接近FAO/WHO推荐模式,是一种优质植物蛋白质资源。     

白芸豆球蛋白的提取及其氨基酸组成研究北大核心CSCD

本文研究了白芸豆球蛋白的提取工艺、分子量和氨基酸组成。结果表明,白芸豆球蛋白最佳提取工艺为NaCl浓度2.5 g/100 mL,料液比1∶22(g/mL),提取温度55℃,提取时间5 h,在此条件下的球蛋白提取率为31.46%;用60%的硫酸铵,在4℃下盐析1 h,球蛋白的盐析得率为73.55%;球蛋白的SDS-PAGE电泳图谱中有6条蛋白亚基条带,其相对分子质量分别为97.52、47.35、33.84、29.62、26.28和21.99 ku,其中有5条与白芸豆分离蛋白的亚基条带相吻合;球蛋白的氨基酸组成种类齐全,必需氨基酸含量接近FAO/WHO推荐模式,是一种优质植物蛋白质资源。     

蝶蛹金小蜂毒液蛋白不同提取分离方法的比较

为了建立蝶蛹金小蜂Pteromalus puparum毒液抑制寄主血细胞免疫活性组分合适的分离纯化方法,就等电点沉淀法、乙醇沉淀法、75%硫酸铵沉淀法、75%硫酸铵沉淀法+40℃加热处理法,以及75%硫酸铵沉淀法分别与3种不同滤膜的分子大小截留法的组合等7种方法对毒液蛋白分离效果及活性的影响进行了比较。结果表明：等电点沉淀法获得的组分抑制寄主菜粉蝶Pieris rapae离体血细胞延展和包囊的活性最强,乙醇沉淀法次之,75%硫酸铵沉淀法最弱。从蛋白组分的SDS-PAGE图谱来看,等电点沉淀法获得毒液组分相对最纯,仅有3条主要谱带,分子量大小在45～116.2 kDa范围内;乙醇沉淀法次之,有5条主要谱带,分子量大小在24～116.2 kDa范围内;硫酸铵沉淀法的谱带组成与毒液蛋白粗提液相似。3种分子大小截留法获得的毒液组分的活性分析表明,强活性组分分子量大小可能都大于100 kDa。综合认为,7种方法中以等电点沉淀法提取分离蝶蛹金小蜂毒液蛋白相对为最适。     

苹果树腐烂病菌非核糖体多肽合成酶基因VmNRPS12的功能

【目的】非核糖体多肽合成酶(NRPS)在植物病原真菌与其寄主互作过程中发挥着重要作用,明确Vm NRPS12基因在苹果树腐烂病菌致病过程中的功能,将为今后深入研究苹果树腐烂病菌NRPS作用机制提供理论依据。【方法】基于苹果树腐烂病菌全基因组数据,得到VmNRPS12基因。运用qRT-PCR技术分析VmNRPS12在侵染初期的表达水平,利用Double-joint PCR和PEG介导的原生质体转化获得该基因抗潮霉素的突变体,对突变体进行PCR检测及Southern blot验证得到敲除突变体,进一步通过重新导入该基因全长片段获得互补突变体,最后对野生型、敲除突变体和互补突变体进行菌落、产孢及致病力观察,对检测数据用SPSS软件进行差异显著性分析。【结果】定量分析显示该基因在侵染初期显著上调表达,且接种48 h后的表达量是对照的138.6倍。该基因的敲除突变体在营养生长及产孢方面与野生型菌株03-8相比无显著性差异,但致病力与野生型菌株03-8相比显著减弱,且互补突变体致病力近似恢复至野生型水平。【结论】VmNRPS12基因与苹果树腐烂病菌致病性相关。     

银杏种仁中一种抗氧化活性蛋白的纯化及性质

银杏种仁经破碎,提取缓冲液4℃浸取后离心得上清液。上清液经硫酸铵沉淀,DEAE-52离子交换层析,MonoQ离子交换层析,UltroGelACA-54凝胶过滤层析后,分离得到一种具有抗氧化活性的蛋白。该蛋白经UltroGelACA-54凝胶过滤层析测定分子量为60 kD,经PAGE和SDS-PAGE鉴定均为单一蛋白质条带。SDS-PAGE测定其亚基分子量为10 kD。该蛋白具有一定的还原能力和清除超氧阴离子自由基及DPPH自由基能力,并在30～60℃温度下具有良好的稳定性。     

舟山眼镜蛇毒神经生长因子的亲和层析分离

用层析和制备SDS-PAGE法纯化舟山眼镜蛇(Najanajaatra Cantor)毒神经生长因子(NGF),免疫家兔获得抗血清。用辛酸-硫酸铵沉淀法初步纯化IgG,蛋白A-Sepharose亲和层析进一步纯化IgG,并与CNBr活化的Sepharose4B偶联,采用亲和层析法对舟山眼镜蛇毒神经生长因子进行分离纯化。产物经过SDS-PAGE检测呈一条带,并显示了良好的生物学活性。纯化NGF最大比活性为5.0×104U/mg蛋白,亲和常数为4.35×108L/mol,亲和层析分离NGF得率比传统分离方法得率提高35.2%,该方法为NGF的大量提取提供了技术支持。     

尿液蛋白富集方法的比较

人尿液中蛋白含量低,在进行质谱分析时易被高丰度蛋白掩盖。因此,发展高效和高选择性的富集方法,是实现尿蛋白标记物深度覆盖的必要前提。探究不同实验方法对尿液蛋白富集和尿蛋白质组的影响尤为重要。本研究采用超滤法、硝酸纤维素膜富集法和饱和硫酸铵沉淀法,等体积各处理5例健康志愿者和膀胱癌患者10 mL尿液样本,富集尿液蛋白,SDS-PAGE分离尿蛋白,比较不同方法纯化的效率;通过质谱分析,比较不同纯化方法的肽段鉴定效果,确定针对尿液蛋白质组蛋白的最佳富集方法。相对于超滤和硝酸纤维素膜富集法,饱和硫酸铵沉淀法成功地应用于健康人尿蛋白的富集和质谱检测,在保证回收蛋白质量的前提下,可减少高丰度白蛋白的干扰,富集更多低丰度蛋白,提高了质谱鉴定的灵敏度。综上所述,饱和硫酸铵提取尿蛋白的效果较好,该方法具有大规模处理尿液、提高蛋白质组学筛选临床诊断标记物研究的应用潜力。     

条斑紫菜R-藻红蛋白提纯工艺研究

对条斑紫菜叶状体R-藻红蛋白提纯方法进行了研究和分析。首先分别采用冻融法、化学试剂法、溶胀法等单一及组合细胞破碎方法对条斑紫菜细胞进行破碎,结果表明溶胀 组织捣碎法效果最佳。其次用25%～60%饱和度范围内的硫酸铵沉淀法粗提藻红蛋白,发现25%～45%硫酸铵分步沉淀法效果最好,再经结晶法盐析纯度(D565nm/D280nm)达到2.088。盐析液用SephadexG-25层析柱脱盐,再经羟基磷灰石(HA)柱层析,纯度可达到4.98。R-藻红蛋白的最大吸收峰在565nm,其室温荧光发射峰为578nm。SDS-PAGE结果显示,R-藻红蛋白可分为α、β两个亚基,Mr分别为17.0×103和19.0×103。     

山西省苹果树腐烂病菌的种群结构分析

为明确山西省苹果树腐烂病菌的分布与组成,本研究采集并分离得到来自山西省8个苹果树种植区有代表性的78株腐烂病菌,通过形态特征观察及利用2个DNA片段（ITS和EF1α）构建系统发育树等方法对其遗传结构进行了研究。结果表明山西省苹果树腐烂病由苹果黑腐皮壳菌Valsa mali和梨黑腐皮壳菌Valsa pyri 2个致病种所致,其中V. pyri是优势种,分布于山西省各个苹果树种植区,占菌株总数的58.97%。以山西省8个苹果树种植区腐烂病菌各个种的相对频率进行聚类分析,欧式距离9作为聚类分割点将其种群结构分为3类。第Ⅰ类包括忻州、朔州2个苹果树种植区,V. pyri为该类型苹果树种植区的致病菌、相对频率为100%。第Ⅱ类包括晋城、长治、临汾、太原、运城5个苹果树种植区,V. pyri是这5个种植区的优势种。第Ⅲ类包含晋中1个苹果树种植区,V. mali是该种植区的优势种。