基于重组氧化葡萄糖酸杆菌生物合成吡咯喹啉醌

吡咯喹啉醌(Pyrroloquinoline quinone,PQQ)是一种重要的氧化还原酶辅基,具有多种生理生化功能,在食品、医药卫生及农业等领域具有广泛的应用。文中采用重组氧化葡萄糖酸杆菌生物合成吡咯喹啉醌。首先构建丙酮酸脱羧酶基因GOX1081敲除的重组菌G. oxydans T1,减少副产物乙酸的形成。然后利用筛选的内源性组成型启动子P0169融合表达pqqABCDE基因簇及tldD基因,构建重组菌G. oxydans T2。最后对发酵培养基添加物和发酵条件进行优化。结果显示重组菌G. oxydans T1、G. oxydans T2生物量较野生菌分别提高43.02%和38.76%,而PQQ的产量分别是野生菌的4.82倍和20.5倍。进一步优化G. oxydans T2碳源及培养条件,最终PQQ产量达(51.3241±0.8997)mg/L,是野生菌的345.62倍。通过基因工程手段,可以有效提高氧化葡萄糖酸杆菌的生物量和合成PQQ的产量,为改善PQQ生物合成效率奠定基础。     

适应性驯化选育高产吡咯喹啉醌的生丝微菌突变株

吡咯喹啉醌(PQQ)广泛存在于生物体内,具有促进机体生长、维护线粒体功能、促进神经生长因子合成和调节机体自由基水平等生理功能,在医药、食品和化妆品领域具有广阔的应用前景。为提高脱氮生丝微菌Hyphomicrobium denitrificans FJNU-6的PQQ生产性能,文中以高浓度甲醇为拮抗因子进行实验室适应性定向驯化,通过光谱法快速筛选体系,选育PQQ高产正突变株。6轮适应性驯化后,每轮驯化的正向突变率达到90%以上,产量提高1倍的突变株达到10%左右。最后,利用5L发酵罐对突变株FJNU-R8进行分批补料培养,相较于出发菌株,突变株在不同甲醇浓度下pqq和moxF基因簇的表达量较高且差异较小,甲醇消耗和生长速度较慢,PQQ产量达到1 087 mg/L (143 h),单位细胞产量提高了1.42倍,展现出良好的工业应用潜力。文中所述的适应性定向驯化结合快速筛选体系能简单、快速地获得高产PQQ的生丝微菌突变菌株,对其他甲基营养菌高产PQQ突变株的高通量筛选具有借鉴作用。     

一株吡咯喹啉醌产生菌的筛选和初步鉴定

目的:筛选新的吡咯喹啉醌(PQQ)产生菌株。方法:收集土壤样品富集培养,分离菌株,NBT染色法快速筛选PQQ产生菌,经Native-PAGE复筛,NBT-Gly法和分光光度法相结合测定菌株PQQ产量;选取产量最高的1株菌考察菌株生长条件,扩增16S rDNA并测序,Blast比对分析确定菌株分类位置。结果:从500余份土壤样品中筛选得到1株PQQ产生菌T28,PQQ产量达13.3 mg/L。该菌株16S rDNA序列与生丝微菌的同源性为96%,确定了T28的最适生长培养基配方。结论:从土壤中筛选到1株新的PQQ产生菌,命名为生丝微菌T28。     

吡咯喹啉醌产生菌筛选方法建立及菌种筛选

吡咯喹啉醌(PQQ)是一种氧化还原酶的辅酶,具有多种生理功能。扩增得到大肠杆菌葡萄糖脱氢酶(GDH)基因,并利用表达载体pET28a在E.coli BL21(DE3)中进行了表达。纯化了可溶性表达产物,并建立了基于GDH的重组酶法分析PQQ的方法。确定了甲基营养菌筛选模型,从2000余份土样中分离得到一株PQQ高产生菌MP606,在未经培养条件优化及诱变选育的条件下PQQ产量达113mg/L。从该菌培养液中制备得到了产物的结晶,HPLC分析、特征光谱分析以及酶法分析均证实该产物为PQQ。扩增并分析了MP606的16S rDNA序列,结果显示该菌16S rDNA序列与12种甲基营养菌都具有95%以上同源性,其中与食甲基菌属两菌株的16S rDNA序列同源性达99%。     

吡咯喹啉醌合成及生产工艺研究进展

吡咯喹啉醌(pyrroloquinoline quinone, PQQ)是继烟酰胺和核黄素之后发现的第三类氧化还原酶辅因子,普遍存在于生物体中参与呼吸链电子传递,具有促进线粒体产生、清除自由基、增强细胞代谢和预防心肌损伤等生理功能,在医药、食品和农业领域具有广泛的应用前景。微生物发酵法是PQQ生产的主要方式,解析PQQ生物合成途径及其调控机制,通过代谢工程选育短周期、高产量的生产菌是PQQ工业化的研究方向之一。本文综述了PQQ的合成途径、高产菌株选育以及微生物发酵生产与分离纯化的研发工作,为深入阐释PQQ的生物合成机制和工业化生产菌株的选育提供参考。     

甲醇利用型吡咯喹啉醌产生菌的筛选及鉴定

从虎杖内生细菌和黏细菌中筛选吡咯喹啉醌(PQQ)产生菌。采用3种以甲醇为唯一碳源的培养基对160株供试菌株进行摇瓶培养发酵,发酵产物采用光谱学分析法及HPLC法筛选。结果显示,通过初筛和复筛共得到甲醇利用型菌134株,PQQ产生菌4株,其中菌株083114的PQQ产量为64.34 mg/L。菌株083114的16S rRNA基因序列分析结果显示,其序列与酸快生芽孢杆菌(Bacillus acidiceler)的系统发育关系最近。虎杖内生细菌及黏细菌中存在PQQ产生菌。     

甲基营养菌MP688甲醇脱氢酶基因mpq1818的敲除及功能研究

目的:研究甲醇脱氢酶基因mpq1818在甲基营养菌MP688生长代谢中的作用。方法:利用同源重组原理构建中间为庆大霉素抗性基因Gmr、两侧mpq1818基因上下游序列同源的敲除载体pAK0-up-Gmr-down,接合转移导入MP688,通过庆大霉素抗性和组合PCR方法筛选基因敲除菌,并检测其生长、甲醇脱氢酶活性、甲醇利用及吡咯喹啉醌(PQQ)生物合成能力等方面的差异。结果:抗性和PCR验证显示mpq1818缺失株构建成功;与野生菌相比,缺失株的甲醇脱氢酶活力及利用甲醇的能力降低,而且菌株的生长和PQQ产量也有显著下降。结论:基因mpq1818的缺失影响菌株前期生长与PQQ合成。     

常压室温等离子体诱变扭脱甲基杆菌AM1高产吡咯喹啉醌

吡咯喹啉醌(Pyrroloquinoline quinone,PQQ)作为一种新型的氧化还原酶辅酶,在医药和食品等领域有广阔的应用前景。为改善扭脱甲基杆菌Methylobacterium extorquens AM1 PQQ生产性能,采用常压室温等离子体(Atmospheric and room temperature plasma,ARTP)进行诱变,结合高通量快速筛选方法,得到以PQQ产量为指标的正向突变株。ARTP诱变的菌株正突变率为31.6%,筛选得到的较优正突变株M.extorquens AM1(E-F3),PQQ产量达到54.0 mg/L,是出发菌株的近3倍。系统的高通量方法筛选ARTP诱变菌为后续进一步提高M.extorquens AM1菌株PQQ的产量奠定了基础,亦为改善菌株生产性能提供了新思路。     

甲基营养菌甲醇脱氢酶基因的克隆及表达

目的:从甲基营养菌MP681中扩增甲醇脱氢酶(MDH)基因,在大肠杆菌中表达并检测其活性,同时在MP681中考察该基因对吡咯喹啉醌(PQQ)产生的影响。方法:根据MP681基因组序列设计引物,PCR扩增靶基因mdh,构建表达载体,考察活性,利用接合转移转化至MP681,考察PQQ的合成。结果:扩增得到甲基营养菌MP681甲醇脱氢酶基因,在大肠杆菌中的表达产物能够催化甲醇脱氢;将携带mdh基因的质粒转入MP681后,PQQ产量略有提高。结论:获得编码MDH的基因,该基因能够在大肠杆菌中表达,且表达产物具有生物活性;甲醇脱氢酶基因表达对宿主菌的PQQ合成可能有一定影响。     

酮还原酶中立体选择性还原位点的突变及其产物分析

为验证糖多孢红霉菌聚酮合成酶中酮还原酶(Ery KR)的LDD模式序列是否为控制2-甲基环己酮立体选择性还原的位点,构建了分别异源表达聚酮合成酶模块1的酮还原酶(Ery KR1)、模块2的酮还原酶(Ery KR2)、LDD残基替换为PQQ(LDD→PQQ)的EryKR1及PQQ替换为LDD(PQQ→LDD)的Ery KR2的重组大肠杆菌Escherichia coli BL21(p ET28a-eryKR1)、E.coliBL21(pET28a-ery KR2)、E.coli BL21(p ET28a-Tery KR1)和E.coli BL21(p ET28a-Tery KR2)。SDS-PAGE实验证明,经IPTG诱导后4个重组菌中都表达出相应的酮还原酶。粗酶液的比酶活分别为1.49 U/mg、0.37 U/mg、0.94 U/mg和0.31 U/mg。利用气相色谱分别检测4个重组菌还原2-甲基环己酮体系中产物的立体结构,结果显示与野生型Ery KR1的还原产物以顺式-2-甲基环己醇为主不同,LDD→PQQ的突变型Ery KR1催化2-甲基环己酮的还原产物主要为反式-2-甲基环己醇,而PQQ→LDD的突变型Ery KR2的主要还原产物也由野生型Ery KR2的反式-2-甲基环己醇转变成顺式-2-甲基环己醇,证实了LDD模式序列确实为酶中控制2-甲基环己酮立体选择性还原的位点。     

一株新的产吡咯喹啉醌甲基营养菌全基因组测序和比较基因组学分析

【背景】由于甲基营养菌被发现的时间较短,而且可以生产吡咯喹啉醌(pyrroloquinoline quinone,PQQ)的甲基杆菌属细菌只有少数菌株的全基因组序列被公布,增加了该类细菌基因组学和生物代谢途径研究的难度。【目的】将本实验室筛选的PQQ生产菌经多种诱变方式处理,用于提高PQQ的发酵产量。对高产突变菌株进行全基因组解析,以探究甲基杆菌PQQ合成的分子机制,为后续分子育种提供序列背景信息。【方法】将野生型PQQ生产菌株进行紫外诱变、亚硝基胍诱变、甲基磺酸乙酯诱变、硫酸二乙酯诱变和紫外-氯化锂复合诱变。将突变菌株利用PromethION三代测序平台和MGISEQ-2000二代测序平台测序,然后进行组装和功能注释。组装得到的全基因组序列与模式菌株扭脱甲基杆菌AM1 (Methylobacterium extorquens AM1)进行比较基因组学分析。【结果】经11轮诱变获得一株突变菌株NI91,其PQQ产量为19.49mg/L,相较原始菌株提高44.91%。突变菌株NI91的基因组由一个5 409 262 bp的染色体组成,共编码4 957个蛋白,与模式菌株M. extorqu...     

通过转座诱变筛选甲基营养菌吡咯喹啉醌合成缺陷突变株

目的:对电转化等Tn5转座诱变条件进行优化,获得大量甲基营养菌MP688突变株,筛选吡咯喹啉醌(PQQ)合成缺陷突变株,并对失活基因进行鉴定。方法:通过电击方法对MP688株进行Tn5转座诱变;通过检测PQQ产量,选择不产或几乎不产PQQ的突变株,用质粒拯救的方法鉴定突变基因。结果和结论:确定了MP688株电击转化的最优条件,优化了质粒拯救法鉴定突变基因的实验方案,得到了1株PQQ合成明显降低的突变株RM16,并确定了转座子在染色体上的插入位点。     

吡咯喹啉醌研究进展

吡咯喹啉醌（PQQ）是继烟酰胺和黄素核苷酸之后发现的氧化还原酶的第3种辅酶,具有多种生理功能,在食品、医药及农业等行业有广泛的应用前景。我们简要综述了PQQ参与醌酶电子传递、增强微生物对极端环境的适应能力、促进植物生长、刺激神经生长因子生成等生物学功能及相关作用机制,介绍了PQQ生产菌、PQQ合成基因及PQQ生物合成的调控等方面的研究进展。     

Gluconobacter oxydans木糖醇脱氢酶基因的克隆表达及木糖醇的转化分析

从氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter oxydans)的基因组DNA上扩增出木糖醇脱氢酶基因xdh,构建了诱导型表达载体pSE-xdh,导入E.coli JM109后获得了高效表达木糖醇脱氢酶基因的重组菌JM109/pSE-xdh。通过HisTrap HP亲和层析和SephacrylS 300分子筛两步纯化从细胞中得到纯酶,并对酶学性质进行研究。XDH最适还原反应的pH值为5.0,最适还原反应的温度为35℃;最适氧化反应的pH值为11.0,最适氧化反应的温度为30℃。重组菌中的XDH依赖NADH,对NADH的米氏常数Km=57.8 mmol/L,最大反应速率Vmax=1209.1 mmol/(ml·min)。重组菌的XDH酶活力为13.9 U/mg。利用重组菌和原始菌混合静止细胞转化D 木酮糖,16 h 28.0 g/L D木酮糖生成16.7 g/L木糖醇,而原始菌单独转化只生成8.3 g/L木糖醇。     

吡咯喹啉醌(PQQ)营养作用研究进展

吡咯喹啉醌(PQQ)是细菌脱氢酶氧化还原反应的辅助因子,广泛存在于微生物、植物、动物及人体中。迄今为止,PQQ催化氧化还原反应的能力远超过已知的生物活性分子。体内外研究表明,PQQ能够刺激微生物生长,增强其对极端环境的适应能力,并对植物和动物的生长、发育和繁殖十分重要。本文阐述了PQQ的理化性质、自然分布和营养作用的研究进展,以推动其在食品、医疗及农林渔业领域的发展应用。     

具有高谷胱甘肽合成活性重组大肠杆菌的构建及合成反应过程

以野生型大肠杆菌E.coliⅡ为宿主细胞,转化带有编码谷胱甘肽合成酶系的基因gshⅠ和gshⅡ的质粒pGH501,获得了一株谷胱甘肽合成活性、质粒稳定性和传代稳定性俱佳,并且能够重复使用的重组大肠杆菌E.coliⅡ\|1。该菌株经过甲苯处理后,能够在胞外积累4g/L左右的谷胱甘肽(GSH)。在合成反应体系中,提高L谷氨酸浓度可促进GSH合成,但L半胱氨酸浓度增大到20mmol/L后会抑制GSH的合成。根据GSH合成反应中能量辅因子的变化情况,提出E.coliⅡ\|1细胞控制的GSH合成反应机理：由谷胱甘肽合成酶(GSHⅡ)控制的第二步反应的能量供体是ADP而非ATP,该反应是整个GSH合成反应的限速步骤,高浓度ADP可能会抑制GSHⅡ的活性。在GSH合成反应体系中添加100mmol/L的L丝氨酸-硼酸钾混合物,可以有效地防止GSH的进一步降解,反应3 h后,GSH产量达到230mmol/L(约71g/L)。     

南沙链霉菌来源细胞色素P450酶CYP154C34的表征及生物转化

【目的】P450酶作为一种多功能生物催化剂,可在温和条件下高区域和立体选择性地催化复杂化合物中未活化的C-H键,因此P450酶在化工原料合成、环境污染物降解及药物合成等领域都具有重要作用。本文对南沙链霉菌基因组中的一个新颖的P450酶CYP154C34进行研究,通过构建异源表达和全细胞生物转化重组菌探究其功能。【方法】构建2种全细胞生物转化BL21(DE3)重组菌(含p ET28a-CYP154C34-RhFRED和pET28a-CYP154C34+pACYCDuet-Pdx/PdR)和1种异源表达BL21(DE3)重组菌(含pET28a-CYP154C34)。通过全细胞生物转化的方式筛选底物,分析催化功能及产物结构。比较2种全细胞生物转化重组菌和体外酶反应对底物的转化率。分析CYP154C34和不同底物及底物类似物的亲和力。【结果】通过底物筛选和产物鉴定发现CYP154C34可催化包括孕酮、睾酮、雄烯二酮在内的9种甾体化合物16α位羟基化。通过2种不同还原伴侣的全细胞体系及体外酶反应对底物转化率的比较,发现含有pET28a-CYP154C34-RhFRED的BL21(DE3)重组菌的...     

重组大肠杆菌全细胞催化合成莱鲍迪苷D

莱鲍迪苷D(Rebaudioside D,RD)是一种稀有具有高甜度的甜菊糖苷类化合物。本文实现了重组大肠杆菌全细胞催化莱鲍迪苷A(Rebaudioside A,RA)合成RD。以水稻c DNA为模板,扩增得到葡萄糖基转移酶基因eugt11,构建了重组菌株E.coli BL21(p ETDuet-eugt11),并成功表达了重组蛋白6His-EUGT11。通过Ni柱亲和层析纯化并在体外酶催化反应表征了其催化活性。将重组菌BL21(p ETDuet-eugt11)应用于催化合成RD研究。探讨了反应体系pH、温度、柠檬酸钠浓度、菌体密度、二价金属离子、二甲苯体积分数、UDPG添加浓度对反应效率的影响。单因素考察结果显示,在菌体密度0.16 g湿细胞/m L反应液,底物RA浓度为1.0 mmol/L,pH 8.0,60 mmol/L柠檬酸钠,1%二甲苯,0.1 mmol/L Zn Cl2,12.0 mmol/L UDPG,反应温度42℃,反应时间24 h的条件下,RD产量为123.6 mg/L(约0.1 mmol/L)。     

P450酶系中高效电子传递链的构建及应用

细胞色素P450作为单加氧酶的主要成员,能够在多种化合物中引入氧分子,催化包括羟化在内的多种反应。在级联的氧化还原反应中,需特定的电子传递链将氧原子中的电子传递至P450单加氧酶的亚铁红素结构中,并最终催化底物氧化,而电子传递体系的低效性往往成为整个反应的限速步骤。本文在介绍P450单加氧酶电子传递链基本结构的基础上,着重阐述对于细胞色素P450酶系中电子传递链未知或者内源性电子传递效率较低的情况下,利用DNA重组技术构建高效的电子传递链从而提高P450单加氧酶的催化效率相关研究进展,主要从细菌及真核细胞线粒体电子传递链(ClassⅠ)及真核生物细胞色素C还原酶CPR(ClassⅡ),天然融合电子传递链及人工融合蛋白电子传递链的构建及其应用展开。     

醌蛋白研究进展

醌蛋白又称醌酶,是一类以吡咯喹啉醌(PQQ)或其结构类似物(TTQ、TPQ或LTQ)为辅助因子的氧化还原酶。以PQQ为辅酶的醌蛋白是其中最重要的一类醌蛋白。按其在氧化还原反应过程中包含辅酶的种类和数量可以分为Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型等3种型别。Ⅰ型醌蛋白是一类简单的醌蛋白,只含有1分子的PQQ作为辅酶;而Ⅱ型和Ⅲ型醌蛋白含有PQQ和血红素c作为辅酶。Ⅱ型醌蛋白包含1分子PQQ和1分子血红素c,广泛存在于假单胞菌属、丛毛单胞菌属细菌的胞外周质中,参与催化反应过程。Ⅲ型醌蛋白仅存在于醋酸菌属细菌的细胞膜上,由3个亚基组成,即含有1个PQQ/血红素的催化亚单位、1个含有3个血红素c的亚单位和1个不含辅酶的功能未知的亚单位。综述了几种主要醌蛋白的结构、催化机制、电子传递,以及它们的应用情况。