基因工程产品中大肠杆菌残余蛋白含量测定方法比较研究

为简便、快速、灵敏地测定基因工程半成品中大肠杆菌(DH5α)残余蛋白的含量,用大肠杆菌DHSα菌体蛋白免疫家兔,制备抗血清,建立了间接ELISA法、直接ELISA法、夹心ELISA法和Dot-ELISA法。4种方法的灵敏度很接近,分别为0.5ng/ml、0.5ng/ml、1.5ng/ml、1ng/ml,都明显高于聚丙烯酰胺方法。前3种方法的直线范围分别为0.5～1250ng/ml、0.5～2500ng/ml、0.5～10000ng/ml。经8次测定,显示很好的重复性。     

快速同时检测玉米赤霉烯酮和脱氧雪腐镰刀菌烯醇的研究

目的：利用稀土离子作为示踪剂,建立DON/ZEN双标记间接竞争时间分辨荧光免疫分析方法同时检测DON、ZEN。 方法：以DON BSA、ZEN-BSA共包被于固相微孔板,与DON/ZEN标准或样品中的DON、ZEN竞争结合抗DON多抗、抗ZEN单抗,然后分别用稀土离子Eu3+-羊抗兔IgG及Sm3+ 羊抗鼠IgG进行示踪检测,并对建立DON/ZEN-双标记TRFIA进行方法学的考核。结果：DON/ZEN-双标记TRFIA检测灵敏度,DON为0.2 ng/ml、ZEN为0.7 ng/ml,检测范围为：DON 0.2~100 ng/ml,ZEN 0.7~50 ng/ml,批内、批间变异率均小于10%。不同样品添加回收实验表明玉米、小麦样品中DON平均回收率分别为102.8%、98.8%,ZEN平均回收率分别为94.2%、95.7%。DON/ZEN-双标TRFIA检测时,DON与ZEN不相互干扰,该方法特异性好。玉米样品检测结果表明,DON/ZEN双标记TRFIA与单标记DON -TRFIA、ZEN-TRFIA试剂盒结果高度相关,具有较好的一致性,两者检测DON的结果相关系数为0.9760,检测ZEN结果的相关系数为0.9695,结论：DON/ZEN-双标记TRFIA灵敏度高,检测范围宽,重复性、稳定性好,一次检测可同时得到DON、ZEN两个结果,是一种简便、快速、经济、稳定、可进行大批量样品筛查的检测方法。     

水柱法场扩大提高CE-UV检测核酸灵敏度

目的：采用水柱法场扩大堆积技术,提高毛细管电泳紫外分析核酸灵敏度。方法：已知浓度的DNA Marker为标准样品,TE缓冲液递度稀释,压力进样前加一段去离子水柱（0.5psi,20s）,观察不同浓度下压力进样紫外检测图谱。结果：在对分离度无明显影响下,将压力进样时间延长至0.5psi,990s,与常规的压力进样（0.5psi,10s）相比,灵敏度提高了94.4倍。与时间延长后的压力进样（0.5psi,90s）相比,灵敏度提高8.2倍,最低检测总浓度为1ng/μl,DNA的检测限降至80ng/ml（S/N=3）,比前人报道的7ng/μl检测限提高了87.5倍。结论：验证了水柱法场扩大堆积注射可以有效提高毛细管电泳紫外检测核酸灵敏度。     

妇科腹腔镜手术中不同血浆靶浓度瑞芬太尼对异氟醚MACBAR的影响

目的观察妇科腹腔镜CO2气腹快速充气阶段不同血浆靶浓度瑞芬太尼对异氟醚MACBAR的影响。方法将120例全麻下行妇科腹腔镜手术患者按瑞芬太尼血浆靶浓度随机分为4组:R0组(0ng/ml)、R1组(1ng/ml)、R2组(2ng/ml)和R3组(3ng/ml)。4组麻醉诱导药物:依托咪酯0.3mg/kg、顺阿曲库铵0.2mg/kg及血浆靶控瑞芬太尼(3ng/ml)。患者气管插管后吸入异氟醚,R0组停用瑞芬太尼,R1、R2、R3组以瑞芬太尼1ng/ml、2ng/ml、3ng/ml的血浆靶浓度靶控输注。根据每组患者CO2气腹快速充气阶段HR或MAP的变化采用序贯法对异氟醚MACBAR进行测定,同时观察气腹前后BIS值与血流动力学改变的关系。结果各组异氟醚MACBAR分别为:R0组(1.63±0.05)%,R1组(1.03±0.06)%,R2组(0.71±0.07)%,R3组为(0.58±0.06)%。结论异氟醚MACBAR随着瑞芬太尼血浆靶浓度的增加逐渐降低,有出现封顶效应的趋势。     

时间分辨免疫荧光分析测定人血清铁蛋白

用一种新型非放射性免疫分析——时间分辨荧光免疫分析法测定人血清铁蛋白含量。方法灵敏度达2ng/ml;测量范围5—1500ng/ml;批内、批间变异系数分别为7.1±0.8％和10.0±1.3％(x±SD);回收率为98.4±7.4％。测定值与RIA法测定值比较,相关性良好。     

固相抗体放射免疫分析法测尿中微量白蛋白

将抗人白蛋白抗体(或第二抗体)与纤维素偶联,建立了固相放免法。其剂量反应曲线在20—540ng/ml范围内呈一直线,灵敏度为20ng/ml。20例正常人尿中微量白蛋白测定值为5.71±1.39 mg/24 h尿,与液相放免法的7.17±3.70mg/24 h尿的结果相接近。固相一抗放免法和液相或固相二抗放免法均有很好相关。     

不同浓度尼古丁对牙周膜成纤维细胞增殖及纤维结合蛋白合成的作用

目的:探讨不同浓度尼古丁对人牙周膜成纤维细胞(PDLFs)增殖及纤维结合蛋白(Fn)合成的作用。方法:不同浓度的尼古丁(50 ng/ml,250 ng/ml,500 ng/ml,1μg/ml,2μg/ml,3μg/ml)作用于PDLFs,MTT比色法检测细胞增殖活性,流式细胞仪检测细胞周期,酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测Fn合成含量。结果:不同浓度尼古丁作用下:人PDLFs的增殖均被抑制,且呈浓度依赖性。浓度为250 ng/ml~3 ug/ml的尼古丁有明显抑制人PDLFs增殖的作用(P0.05),3 ug/ml尼古丁显示出最强的抑制增殖作用(P0.01);人PDLFs的G0-G1期、S期、G2-M期与对照组相比,G0-G1期细胞周期分布比例逐渐增高,S期和G2-M期逐渐降低,差异均有统计学意义,呈浓度依赖性;人PDLFs合成Fn逐渐减少,呈浓度依赖性。浓度为50 ng/ml~3μg/ml的尼古丁均有明显抑制人PDLFs合成Fn的作用(P0.05),其中3μg/ml抑制作用最强。结论:尼古丁抑制牙周膜细胞的增殖及Fn的合成,呈浓度依赖性,并影响其细胞周期的进程,进而影响牙周新附着的形成,加重牙周病的病情。     

重组人睫状神经营养因子蛋白质定量检测方法的建立

采用ELISA双抗体夹心法,建立一种快速灵敏的定量检测rhCNTF成品蛋白含量的方法。结果显示,rhC-NTF抗原浓度在(0～25)ng范围内线性良好(r>0.99),灵敏度为0.3ng/ml,与其他重组细胞因子无交叉反应,样品的检测结果与理论含量相吻合,CV<15%,该方法检测速度快、重复性好、灵敏度高、特异性好。     

bFGF和BMP-2联合应用对体外培养兔骨髓间充质干细胞增殖与骨向分化的影响

目的:研究碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和骨形成蛋白-2(BMP-2)联合应用对体外培养兔骨髓间充质干细胞(BMSCs)增殖与骨向分化的影响.方法:体外培养兔骨髓间充质干细胞,在第2代细胞培养液中加入不同浓度的bFGF和BMP-2,依据加入bFGF和BMP-2浓度的不同分为5个实验组(组1:80 ng/ml bFGF;组2:80 ng/ml BMP-2;组3:30 ng/ml bFGF 30 ng/ml BMP-2;组4:50ng/ml bFGF 50ng/ml BMP-2;组5:80ng/ml bFGF 80ng/ml BMP-2)和对照组(不加任何生长因子),采用绘制生长曲线,四唑盐比色法(MTT),碱性磷酸酶(ALP)活性检测法和碱性磷酸酶(ALP)免疫组化染色法比较各组间差异,观察不同浓度的bFGF和BMP-2联合应用对兔骨髓间充质干细胞增殖与骨向分化的影响.结果:与对照组相比,单独应用80 ng/ml bFGF可显著促进BMSCs的增殖,但对BMSCs的骨向分化显著抑制;单独应用80 ng/ml BMP-2对BMSCs的增殖和骨向分化均有促进作用;30ng/ml bFGF 30 ng/ml BMP-2、50 ng/ml bFGF 50 ng/ml BMP-2和80 ng/ml bFGF 80 ng/ml BMP-2可显著地促进BMSCs增殖和促进BMSCs的骨向分化,且呈正性剂量-效应关系,联合应用两种生长因子较二者单独应用促细胞增殖及骨向分化的效果更为显著.结论:一定浓度范围内,bFGF和BMP-2的联合应用促进BMSCs增殖的同时也促进其骨向分化,两者对BMSCs有明显的协同增强的生物学效应.     

金黄色葡萄球菌D型肠毒素抗血清制备和在肠毒素免疫检测上的应用

参考Robbins等文章,制定了制备抗-SED血清的免疫方案,抗原用量6.9mg/兔,注射8针,免疫时间共14周。用免疫双向琼脂扩散方法测定,抗-SED血清效价可达1:128,所制抗-SED血清与高纯度(98%)及低纯度(60%)的SED只产生一条沉淀线,并且融合,与SEA、SEB、SEC_1、SEC_2均没有交叉反应。以抗-SED抗体IgG制备的诊断血球检出灵敏度较高,约1ng/ml。对6种罐头食品人工污染毒素的模拟实验结果,检出灵敏度为1.56ng/ml,略低于含纯SED标本,食物成份对反向血凝检出没     

乙型肝炎病毒X蛋白定量试验与临床研究

HBV X蛋白 （HBx）是由乙型肝炎病毒（HBV）基因组编码的调控蛋白,与由乙肝引起的肝癌发生具有密切的关系。血清HBx对乙型肝炎、肝癌的诊断及发病机理研究有较高的临床应用价值。在表达并纯化HBx、制备出HBx单克隆抗体与酶标抗体的基础上,研制了HBx定量检测试剂盒（增强化学发光法）,对其灵敏度、特异性等指标进行分析,并将该试剂盒应用于临床研究。结果表明,原核表达并纯化的HBx纯度≥94%;试剂盒灵敏度达0.1ng/ml;线性范围达到0.5ng/ml -600ng/ml;特异性高,与球蛋白、脂蛋白、血红蛋白、酸性糖蛋白、HBc、HBe、HBs、HBV preS2不发生交叉反应;批间CV≤6.5%;临床标本检验慢性乙型肝炎阳性率为55%、肝硬化阳性率为68%、肝癌阳性率70%,表明此试剂盒可应用于乙肝、肝硬化、肝癌的临床诊断及发病机理研究。     

膀胱镜检对前列腺增生患者血清PSA、FPSA的影响

目的:探讨膀胱镜检对BPH患者血清前列腺特异性抗原(PSA)、游离PsA(FPSA)的影响.方法:32例BPH患者,均行膀胱镜检,研究其对患者血清PSA、FPSA的影响程度及时阃.结果:膀胱镜检前患者平均血清PSA值为2.28±1.86ng/ml,FPSA值0.48±0.31ng/ml;镜检后24h内PSA值4.89±3.72ng/ml,FPSA值1.07±0.65ng/ml;镜检后第3天患者平均血清PSA值2.42±1.92ng/ml,FPSA值0.51±0.28ng/ml.镜检后24h内患者血清PSA、FPSA值较镜检前相比P<0.05,有统计学意义;镜检后第3天患者血清PSA、FPSA值较镜检前相比P>0.05,无统计学意义.而各组F/T差异均无统计学意义(P>0.05).结论:膀胱镜检可引起BPH患者血清PSA和FPSA值显著改变,但对F/T值改变无影响,重复血清PSA和FPSA的测定可在膀胱镜检后72h进行.     

TGF-β 1 对人蜕膜基质细胞中趋化因子及其受体表达的影响

为探讨转化生长因子β1(TGF-β1)在蜕膜基质细胞中发挥免疫调节作用的机制,本研究以人妊娠初期的蜕膜基质细胞为研究对象,经0 ng/ml、1 ng/ml、5 ng/ml和10 ng/ml的TGF-β1处理后,运用RT-PCR方法检测趋化因子mRNA的表达,Western-blot检测趋化因子蛋白质的表达。结果表明:在mRNA水平和蛋白水平,高浓度的TGF-β1能够显著的下调蜕膜基质细胞中趋化因子配体CX3CL1、CXCL12和CXCL16的表达,有意义的上调趋化因子受体CXCR4和CXCR6的表达。研究结果提示,TGF-β1对趋化因子配体/受体有显著的调节作用,并通过趋化因子参与母胎界面的免疫调节。     

单细胞因子支持人胚胎干细胞生长的培养体系

[目的]为2株中国人胚胎干细胞系建立培养液中仅添加1种细胞因子的培养体系。[方法]两株人胚胎干细胞h ES-846XX和h ES-18 46XY分别使用含有成纤维细胞生长因子(b FGF)160ng/ml、转化生长因子(TGFβ1)20ng/ml和noggin 200ng/ml的培养液进行无饲养层培养,观察细胞的生长情况并对所得细胞进行鉴定。[结果]培养液中添加b FGF 160ng/ml可以有效地支持人胚胎干细胞的长期增殖,传代8次的细胞仍然保持胚胎干细胞的特性。添加TGFβ1或noggin的培养基无法维持人胚胎干细胞的长期增殖,3代以后细胞完全分化。[结论]证明培养液单独添加高浓度b FGF 160ng/ml支持2株中国人胚胎干细胞长期保持未分化状态增殖,实际未分化率为68.2±1.08%。     

沙丁胺醇人工抗原的合成及抗体制备

沙丁胺醇是一种β-兴奋剂,常被很多畜禽水产养殖户非法用于动物养殖。为建立沙丁胺醇在食品中残留的快速检测方法,研究了沙丁胺醇免疫原的合成和抗体的制备方法。采用对氨基苯甲酸法合成了沙丁胺醇（SAL）免疫原SAL-cBSA,采用重氮化法合成的克伦特罗（CL）偶合物CL-cOVA作为包被抗原,用紫外光谱法分析了所合成免疫原和包被抗原。用免疫原SAL-cBSA免疫新西兰大白兔获得多克隆抗体,抗体效价达到32000。采用间接ELISA法检测抗体IC50值为8.79ng/ml,SAL的浓度在1ng/ml~100ng/ml区间时,SAL与对抗体的竞争结合力呈直线关系。表明所制备的沙丁胺醇免疫原具有良好的免疫原性,所制备的抗体拥有很高的灵敏度。     

不同剂量LPS诱导肝Kupffer细胞释放TNF的体外研究

本实验观察了不同剂量LPS诱导大鼠肝Kupffer细胞释放TNF的作用。加入LPS后1小时,三种剂量LPS组Kupffer细胞培养上清中均可测到TNF活性,3小时达到峰值。100和150ng/ml LPS组TNF活性高于50ng/ml组(P<0.01),而100和150ng/ml两组之间无明显差异(P>0.05),再次加入LPS(终浓度100ng/ml),只有50ng/ml LPS组培养上清液中有TNF活性检出,但幅度明显下降(P<0.01)。上述结果提示LPS在体外诱导肝Kupffer细胞释放TNF在一定范围内具有剂量依赖关系,且呈一定的时间反应性。     

The Effect of TGF-β1 on Expression of Chemokine and Its Receptor in Human Decidual Stromal Cells

为探讨转化生长因子β1(TGF-β1)在蜕膜基质细胞中发挥免疫调节作用的机制,本研究以人妊娠初期的蜕膜基质细胞为研究对象,经0 ng/ml、1 ng/ml、5 ng/ml和10 ng/ml的TGF-β1处理后,运用RT-PCR方法检测趋化因子mRNA的表达,Western-blot检测趋化因子蛋白质的表达.结果表明:在mRNA水平和蛋白水平,高浓度的TGF-β1能够显著的下调蜕膜基质细胞中趋化因子配体CX3CL1、CXCL12和CXCL16的表达,有意义的上调趋化因子受体CXCR4和CXCR6的表达.研究结果提示,TGF-β1对趋化因子配体/受体有显著的调节作用,并通过趋化因子参与母胎界面的免疫调节.     

血清泌乳素水平对泌乳素瘤患者的临床价值研究

目的:分析术前血清泌乳素水平对泌乳素瘤患者的临床价值。方法:选择2011年1月至2016年12月于青岛大学附属医院行垂体腺瘤切除术且术前测得泌乳素(prolactin,PRL)水平、术后行病理免疫组化染色的垂体腺瘤164例,通过Spearman相关分析PRL水平与肿瘤大小的相关性,通过Kappa值判断PRL水平与病理诊断的一致性。采用ROC曲线获得PRL水平最佳临床诊断临界值。结果:(1)164例垂体瘤患者中,病理诊断单激素PRL瘤25例,主要表现为男性性功能低下及头痛、头晕,女性月经紊乱、闭经、泌乳;(2)术前PRL水平与年龄、性别无显著相关性(P均0.05),与肿瘤大小呈中度正相关(r=0.530,P0.05);(3)以正常范围上限值(23.3 ng/m L)为基线,分别以PRL23.3 ng/mL(1倍)、46.6 ng/m L(2倍)、69.9 ng/ml(3倍)、100 ng/mL、150 ng/m L、200 ng/mL为诊断标准,与病理免疫组化的一致性分析显示PRL69.9ng/m L作为诊断标准时符合率和Kappa系数最高,分别为82.3%和0.533;(4)以病理免疫组化作为诊断金标准作泌乳素瘤ROC曲线,以血清PRL为69.785 ng/m L作为诊断标准时,曲线下面积最大,此时符合率和Kappa系数分别为82.3%和0.553,灵敏度49.1%,特异度98.3%。结论:泌乳素瘤血清学诊断与病理免疫组化诊断一致性较高,血清PRL水平69.9 ng/mL(3倍于正常上限值)是诊断泌乳素瘤的最佳参考值。     

胰岛素和IGF-I对离体犊牛小肠上皮细胞增殖和吸收功能的影响

本试验选择离体犊牛小肠上皮细胞,以细胞增殖率和葡萄糖吸收率作为细胞生长发育与功能成熟的指标,研究了胰岛素与胰岛素样生长因子-I(IGF-)对细胞生长发育的影响。结果表明,胰岛素浓度为10μg/ml时,明显促进小肠上皮细胞的增殖和对葡萄糖的吸收,浓度达到50μg/ml时则抑制细胞的增殖和吸收(P<0.01)。IGF-I浓度为100ng/ml时,对促进小肠上皮细胞增殖和吸收葡萄糖的作用最强(P<0.01),但100ng/ml、500ng/ml和1000ng/ml三种不同浓度的IGF-I对刺激细胞增殖和提高吸收功能无显著差异(P>0.05)。     

肾素与动脉粥样硬化性肾动脉狭窄支架术预后相关性研究

目的:评价下腔静脉肾素活性与动脉粥样硬化性肾动脉狭窄支架植入术后血压及肾功能的相关性.方法:选取我院2007年至2011年49例单侧或者双侧动脉硬化性肾动脉狭窄(ARAS)患者(狭窄程度＞70％),成功进行血运重建术;记录患者术前动脉粥样硬化相关危险因素;测量并记录术前及术后患者肾素、血管紧张素、醛固酮、血压、抗血压药物数量、肌酐,并对患者血压及肌酐进行1、3、12月随访观察,评价肾素水平与支架术后血压及肾功能的相关性.结果:根据患者术前与术后下腔静脉肾素水平下降值分为＞3 ng/ml/h组和＜3 ng/ml/h组,平均随访12个月,观察到肾动脉支架术后患者血压、肾素、血管紧张素、醛固酮均有明显改善,并趋于稳定;两组肌酐肾小球滤过率存在明显差异,分别为第1月随访(52.1+ 17.7 ml/min和38.3+ 17.5 ml/min P＜0.05)第3月随访(53.1+ 21.6 ml/min和41.7+ 16.6 ml/min P＜0.05)第12月随访(51.7+ 19.0 ml/min和41.9±20.7 ml/min P＜0.05);肾素水平下降值＞3 ng/ml/h组较＜3 ng/mi/h组血压及肾功能改善较明显.结论:肾素水平与动脉粥样硬化性肾动脉狭窄支架术后血压及肾功能改善有相关性.