响应面法优化有机溶剂极端耐受性菌株Burkholderia sp．ZYB002产脂肪酶条件

Burkholderia sp．脂肪酶具有较高的有机溶剂耐受性和转酯活性,广泛应用于手性化合物的拆分。本研究利用统计学方法对一株具有有机溶剂极端耐受性的脂肪酶高产茵株Burkholderia sp．ZYB002在摇瓶培养条件下产脂肪酶条件进行了优化。通过单因素实验,首先确定了最适碳源、氮源、诱导荆等。以Plackett—Burrman设计筛选影响Burkholderia sp．ZYB002产酶的主要因素,通过最陡爬坡实验和响应面分析法确定产酶最适条件。K2HP04、大豆油乳化液和起始RH确定为影响菌株产酶的3个主效因素。最佳产酶条件为：糊精0．3％（W／V）,牛肉膏2．0％（W／V）,MgSO4．7H2O．075％（W／V）,K2HPO4 0．14％（W／V）,大豆油乳化液4．89％（V／V）,pH8．11,玻璃珠10颗／瓶,接种量2．0％（V／V）,30℃,250r／min,发酵时间22h。在此条件下,发酵液脂肪酶酶活最高达45．6U／mL,较发酵基本培养基发酵液的脂肪酶酶活提高了3．44倍。     

耐受有机溶剂洋葱伯克霍尔德菌ZYB002全细胞脂肪酶酶学性质

一株对多种有机溶剂具有良好耐受能力的产脂肪酶菌株ZYB002经分子鉴定为洋葱伯克霍尔德菌。其产生的细胞结合脂肪酶最适温度为65°C,最适pH为8.0,在低于70°C和pH3-8.5的范围内,全细胞脂肪酶保持稳定。Ca2+、K+、Na+和NO3-等离子对脂肪酶活性有激活作用,而Zn2+有抑制效应。全细胞脂肪酶对正丁醇有较强的耐受能力,但曲拉通X-100对脂肪酶活性有强烈的抑制效应。洋葱伯克霍尔德菌ZYB002全细胞脂肪酶良好的碱稳定性、热稳定性和有机溶剂耐受性,表明该全细胞脂肪酶具有重要的工业应用潜力。     

理性设计盐桥构建伯克霍尔德菌脂肪酶热稳定突变体

【目的】借助蛋白质工程技术提高伯克霍尔德菌ZYB002脂肪酶LipA的热稳定性,以期更好地将其应用于工业生产中。【方法】利用YASARA、Fold X、Rosetta、Gromacs等生物信息学软件,构建1个脂肪酶Lip A的热稳定性提高的微型突变体电子文库;通过对突变体的结构信息和自由能变化进行评估,筛选出潜在的有价值的突变体。继而利用基因定点突变技术,构建上述候选突变体的突变基因文库,通过实验筛选出热稳定性提高的脂肪酶LipA突变体。【结果】利用上述方法,从构建的20个脂肪酶LipA突变体中,筛选到热稳定性有显著提高的3个突变体LipA-Asn~(125)Asp、LipA-Asn~(125)Glu和LipA-Gln~(262)Glu。经55°C处理12 min后,上述3个突变体的T1250值较野生型分别提高4.0°C、5.5°C和4.4°C;在55°C下的半衰期较野生型分别提高了2.2倍、3.8倍和2.6倍。【结论】利用生物信息学软件,构建脂肪酶LipA突变体电子文库,结合蛋白质的结构信息,可以快速筛选到热稳定性提高的脂肪酶LipA突变体。     

伯克霍尔德氏菌ZYB002脂肪酶lipC24基因的克隆、表达及其酶学性质

【目的】克隆伯克霍尔德菌ZYB002菌株中的新型脂肪酶lip C24基因,测定其基本酶学性质,为后续深入研究该基因在菌株中的生理功能奠定基础。【方法】根据洋葱伯克霍尔德菌JK321菌株的全基因组DNA信息,直接设计引物从伯克霍尔德菌ZYB002菌株基因组中扩增出lip C24基因,并对之进行原核表达、重组蛋白的纯化及酶学性质分析。【结果】lip C24基因全长1317 bp,编码438个氨基酸残基;多肽链中具有保守五肽-G-X1-S-X2-G-序列;重组蛋白Lip C24的分子量为45 k Da;能有效水解各种对硝基苯酯,对中链脂肪酸的对硝基苯酯表现出偏爱性;其催化水解反应的最适温度为40℃,最适p H7.5;40℃下的半衰期为15.72 min,在p H 7.0-8.0的条件下,具有较好的稳定性。【结论】lip C24的编码产物为一个45 k Da蛋白,具有明显的脂肪酶活性,为中温中性脂肪酶。     

基于核糖体基因序列快速鉴定产脂肪酶微生物

利用含罗丹明B的橄榄油检测平板从中国各省市油污土壤中分离、筛选产脂肪酶微生物菌株,扩增细菌的核糖体基因16S rDNA序列和真菌的ITS2序列,分析核糖体基因簇DNA,并结合形态学特征从而对产脂肪酶菌株进行分子生物学鉴定.核糖体基因16S rDNA序列分析及系统发育分析表明,分离得到的产脂肪酶细菌分别属于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、产碱假单胞菌(Pseudomonas alcaligenes)、洋葱伯克霍尔德氏(Burkholderia cepacia)、琼氏不动杆菌(Acinetobater jurii)、嗜麦芽窄食单孢菌(Stenotrophomonas maltophilia)和荧光假单胞菌(Pseudomonas sp.);真菌核糖体基因转录间隔区(ITS2)序列及同源性分析表明产脂肪酶真菌分别属于黑曲酶(Aspergillus niger)、白地酶(Galactomyces geotrichum)、解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)、丝孢酵母(Trichosporon guehoae)和假丝酵母(Candida sp.).研究结果表明,核糖体基因簇的DNA分析技术为从自然界分离、鉴定产脂肪酶菌种提供了一种快速有效的手段,为产脂肪酶微生物资源开发利用奠定了技术基础.     

表皮葡萄球菌SarA对atlE、lipA和zinC基因表达调控的研究

表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermids)是一种条件致病菌,SarA(StaphylococcalaccessoryregulatorA)是该菌中一个全局性调控因子,它控制着细胞中许多与毒性相关的基因表达.报道了SarA在转录水平直接调控atlE、lipA和zinC基因的表达.RT-PCR和lacZ报告基因的分析结果显示,在表皮葡萄球菌ATCC35984中,SarA对atlE(自溶酶基因)表达起负调控作用,而对lipA(脂肪酶基因)和zinC(膜相关锌金属蛋白酶基因)的表达则有正调控作用.生物信息学分析表明,SarA控制atlE,lipA和zinC3种基因表达可能是通过与被调控基因上游的特定DNA序列的结合来实现的,该DNA结合区保守并富含AT碱基.根据已报道的金黄色葡萄球菌中SarA的结合位点序列,利用Omiga软件分析并推测了SarA结合atlE,lipA和zinC的可能区域.基于SarA是一种多功能的毒素相关调控因子,结果提示,SarA能调控众多因子,可以作为防治表皮葡萄球菌感染的一个药物筛选靶点.     

一株脂肪酶产生菌的鉴定及钙在其发酵产酶过程中的作用

通过16S rDNA序列分析,结合菌株形态和生理生化特征,对一株脂肪酶产生菌株Y-G进行了分类鉴定,研究了Ca~(2+)在菌株发酵过程中产脂肪酶的作用。结果表明,实验菌株为不动杆菌(Acinetobacter sp.),一定浓度的Ca~(2+)(5 mmol/L)能够显著提高发酵液酶活,而稀土离子La~(3+)、Ca~(2+)螯合剂EGTA或三氟拉嗪(TFP)的加入都会不同程度的影响发酵液中酶活产量,说明钙信号系统可能参与细菌脂肪酶分泌的调控。     

利用麻风树油驯化筛选高活性脂肪酶产生菌及其催化酯化反应

以1株分解麻风树油的脂肪酶产生菌Pseudomonas sp. LP-1为出发菌株, 通过麻疯树油定向驯化筛选获得1株酶活较高且产酶稳定的菌株P. sp. X-2-45, 其水解酶活为29.79 U/mL, 比原始菌株提高了288%。对P. sp. X-2-45生长与产酶特征、对植物油脂水解能力及在有机相中催化脂肪酸和有机醇间的酯化反应研究发现, 该菌株生长速率和产酶速率明显加快, 培养30 h时生物量和酶活达到最大, 稳定期延长, 培养过程中脂肪酶在培养基中的稳定性提高。以麻疯树油诱导合成的P. sp. X-2-45脂肪酶对麻疯树油的水解能力比原始菌株提高了378%, 说明采用麻风树油定向驯化可提高脂肪酶对相应底物的水解能力。X-2-45脂肪酶可以催化月桂酸与正丁醇、正辛醇、月桂醇和丙三醇之间, 棕榈酸、硬脂酸与甲醇、正辛醇、月桂醇和丙三醇之间, 油酸与甲醇、正丁醇、正辛醇、月桂醇和丙三醇之间发生酯化反应。     

羟胺对粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)的诱变效应

羟胺(HA)引起S.pombe的失活作用因菌株而异,实验用两株突变体的失活曲线皆非指数曲线。钠离子对HA所处理的细胞不仅沒有保护作用,反而会引起细胞损伤。HA的两种独立的效应——失活与诱变效应在以S.pombe为材料的实验里沒有观察到。相反,低浓度HA(0.01M)既能引起S.pombe细胞失活,又有诱变作用。 HA对4类19株NA-生化突变体的回复诱变材料证明:有些NA-生化突变体的突变位点之碱基对为GC,另外一些突变体目前则尚难确定,有待进一步确证。HA同样诱发S.pombe野生型菌株产生大量正向突变体。因而它可供作选育生产菌株的诱变剂。     

粘质沙雷氏菌脂肪酶基因的克隆表达和酶学性质的研究

目的:克隆粘质沙雷氏菌脂肪酶基因(lipA)使其在大肠杆菌B121(DE3)中实现高效表达,并对重组酶进行酶学性质研究.方法:以产脂肪酶粘质沙雷氏菌总DNA为模板,PCR扩增脂肪酶基因lipA,构建重组表达载体pET-lipA,并将其导入大肠杆菌进行诱导表达,对表达产物进行SDS-PAGE和酶学性质的测定.结果:经过优化培养条件,脂肪酶活力最高能达到104U/mL.重组脂肪酶的最适反应温度为40～45℃,最适pH为7.0～7.5,在50℃保温1h下仍能保持80%的酶活力,Ca2+、Sr2+、Mn2+和Mg2+对脂肪酶酶活有较强的激活作用,尤其是Ca2+使脂肪酶酶活提高了1倍多,而Ni2+、Fe2+、Fe3+、Cu2+、Zn2+和Al3+对酶活具有较强的抑制作用,尤其是Zn2+和Al3+使酶活力几乎完全丧失.该酶对一些有机溶剂有较好的耐受性,与50%甲醇混合24h,仍能保持84%的酶活力.结论:该脂肪酶具有较好的热稳定性和甲醇耐受力,作为生产生物柴油的催化剂具有很大的应用价值,为基因工程酶法生产生物柴油打下良好的基础.     

热稳定性伯克霍尔德菌脂肪酶A突变体的筛选

摘要:【目的】为更好地提高伯克霍尔德菌ZYB002脂肪酶LipA在TMP纸浆造纸工艺中的应用,有必要利用蛋白质工程技术,提高其热稳定性。【方法】基于B-factor值筛选LipA多肽链中潜在的突变位点,利用迭代饱和诱变技术,构建突变文库,筛选热稳定性提高的突变体。【结果】利用上述方法,从4个突变文库中分别筛选到在55℃下,半衰期较野生型脂肪酶LipA分别提高了1.8倍、3倍、2.2倍和1.7倍的脂肪酶突变体。【结论】基于B-factor值选择突变位点,利用迭代饱和突变技术,快速筛选到热稳定性有显著提高的突变体。     

基于T7表达系统的洋葱伯克霍尔德菌G63脂肪酶同源高效表达

为实现对洋葱伯克霍尔脂肪酶的可控高效表达, 将目前被广泛使用的T7重组蛋白高效表达系统移植到洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia cepacia)G63中进行脂肪酶同源表达。首先采用PCR从大肠杆菌BL21(DE3)中得到T7 RNA 聚合酶基因(T7 RNAP)并将其克隆到致死质粒pJQ200SK上, 然后在T7 RNAP 前后各加入500 bp用于同源重组的片段, 再通过三亲本杂交把T7 RNAP整合到B. cepacia基因组上, 使T7 RNAP受到脂肪酶基因(lipA)启动子调控。接着把lipA和它的伴侣基因lipB单独或全部克隆到载体pUCPCM和pBBR22b上, 构建出pBBR22blipAB、pBBR22blipA、pUCPCMlipAB、pUCPCMlipA、pUCPCMΔlipAlipB、pUCPCMΔlipA、pUCPCMΔlipB七种表达质粒, 通过电转化将上述表达质粒转化到含T7 RNAP的B. cepacia宿主菌中, 最终得到一系列脂肪酶基因工程菌。通过摇瓶诱导发酵发现含表达质粒pUCPCMlipAB的工程菌脂肪酶酶活最高, 达到607 U/mg, 与野生菌相比酶活力提高2.8倍, 并且除含pUCPCMΔlipB的工程菌外, 其它工程菌的脂肪酶酶活均有不同程度提高。野生菌与工程菌pUCPCMlipAB的发酵液经硫酸铵沉淀, Sephadex G-75凝胶过滤纯化后, 比酶活分别为29 984 U/mg和30 875 U/mg。以上结果表明, 构建的基于T7表达系统的B. cepacia脂肪酶基因工程能有效提高脂肪酶的表达量, 同时说明分泌信号PelB和增强转录的核糖体接合位点对脂肪酶的表达有促进作用。     

尖镰孢古巴专化型1号生理小种致病相关基因敲除突变体△Focr1-328的生物学特性

由尖镰孢古巴专化型1号生理小种Fusarium oxysporum f. sp. cubense race 1（Focr1）引起的香蕉枯萎病是粉蕉类香蕉品种（AAB）不能规模化种植的最主要因素,其致病机理至今尚不十分清楚。本实验室前期通过T-DNA插入获得Focr1致病性丧失突变体Focr1-328,从Focr1全基因组序列中定位了因T-DNA插入失活的基因,并从野生型菌株Focr1-N2中敲除了该致病相关基因,获得了敲除突变体△Focr1-328。为了明确该致病相关基因的生物学功能,通过活体叶片、活体根     

二步法黑曲霉脂肪酶基因lipA的全基因合成及其在毕赤酵母中的高效表达

黑曲霉脂肪酶是重要的工业用酶,在食品、制药等领域具有广泛的用途。获得黑曲霉脂肪酶高效表达的基因工程菌是该脂肪酶规模化应用的前提。通过全基因合成对目的基因进行分子改造和人工组建是实现基因高效表达和体外分子进化的有效手段。本研究主要针对一步法长片段基因合成中复杂结构的非特异性配对和过多的PCR引入碱基错配等问题,采用二步法(组装PCR和酶切-酶连)合成了黑曲霉脂肪酶基因lipA。首先在DNA2.0和Gene2Oliga软件辅助下对lipA基因密码子及RNA二级结构进行优化并引入ClaI(237位)和PstI(475位)酶切位点;通过组装PCR分别合成lipA基因的各片段F1(237bp)、F2(238bp)和F3(422bp);通过该基因内的ClaI和PstI限制性酶切位点连接成完整的全长lipA基因。本方法有效地降低了长片段合成过程中寡核苷酸片段的非特异性配对、复杂的二级结构以及碱基突变对DNA合成的影响,提高了长片段合成的成功率。经密码子优化后的脂肪酶基因(lipA-syn)在毕赤酵母GS115中经诱导表达72h后,发酵液酶活达176.0U/mL,蛋白质含量为143.7mg/L,较出发基因分别提高了10.8倍...     

尖镰孢古巴专化型Focr4-1701突变体的生物学表型研究

由尖镰孢古巴专化型(Fusarium oxysporum f.sp.cubense,Foc)引起的香蕉枯萎病是香蕉生产中的毁灭性病害之一。Foc有4个小种,其中4号小种(Focr4)因其寄主范围广且无高抗病性的香蕉品种,对香蕉产业的危害最大,其致病机制至今尚不清楚。为研究其致病机制,本文对Focr4野生型菌株(Focr4-193-6)、因其T-DNA插入导致致病性严重减弱的突变体Focr4-1701、T-DNA插入标签基因敲除子△Focr4-1701及敲除基因互补子△Focr4-1701-cp-1为材料,从致病性测定、玻璃纸穿透试验、孢子形态观察、产孢量与孢子萌发率测定、粗毒素测定等方面对其与致病性相关的生物学表型进行了测定。结果表明:T-DNA插入突变体Focr4-1701和基因敲除突变体△Focr4-1701接种后的香蕉植株叶片没有表现发病症状,敲除基因互补菌株与野生型菌株一样表现出发病症状;T-DNA插入突变体和基因敲除突变体不能穿透玻璃纸生长,T-DNA插入突变体及基因敲除突变体在产孢量、孢子萌发率和产毒素能力上均极显著低于野生型菌株及互补菌株。这些表型性状差异说明Focr4-1701致病性严重减弱可能是T-DNA插入位点标签基因失活后导致了菌丝体侵染能力下降及产毒素能力降低造成的。     

扩展青霉脂肪酶K56R叠加突变对热稳定性的影响

目的:扩展青霉脂肪酶随机突变体ep8是一株热稳定性比野生型有所提高的突变体.获得热稳定性提高的优良菌株.方法:在ep8的基础上利用重叠延伸PCR构建叠加突变重组质粒pPIC3.5K-ep8一K56R,将该质粒电转毕赤酵母(Pichia paaoris)GS115进行异源表达.结果:该叠加突变脂肪酶在毕赤酵母中获得了活性表达.15%SDS-PACE结果分析表明突变脂肪酶PEL-ep8-K56R-GS分子量与野生型PEL-GS一致,约为28kDa.叠加突变脂肪酶在37℃时酶活为852U/mL、野生型为760u/mL、随机突变体为824u/mL,叠加突变体酶活相比野生型提高了21.1%,相比随机突变体提高了3.4%.热稳定性分析数据表明叠加突变脂肪酶Tm值为40.1℃、野生型为38.7℃、随机突变体为39.9℃,Tm值相比野生型提高了1.4℃,相比随机突变体提高了0.2℃.     

2型猪链球菌假想转运蛋白89k/pTP与毒力的相关分析

目的：构建2型猪链球菌假想转运蛋白89k/pTP的基因插入失活突变体并进行毒力相关分析。方法：首先将同源臂片段克隆到pSET4s质粒上,构建插入失活载体pSET4s-pTP,并通过对单交换的筛选获得89k/pTP的基因插入失活突变体,再用小鼠腹腔感染模型对突变株和野生株的毒力进行比较。结果：获得了89k/pTP的基因插入失活突变体,并发现其毒力与野生型相比明显下降。结论：2型猪链球菌假想转运蛋白89k/pTP与其毒力有关,其作用和机制值得进一步分析。     

苏云金芽胞杆菌sigK 基因插入失活突变体的特点及其对cry3A基因启动子活性的影响

摘要: 【目的】构建苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt) sigK 基因插入失活突变体,分析突变体特点并明确其对cry3A 基因启动子的影响。【方法】采用同源重组技术在苏云金芽胞杆菌HD-73 菌株sigK 基因中插入卡那霉素抗性基因,构建了sigK 基因插入失活突变体。通过生长曲线测定、扫描电子显微镜观察晶体、芽胞形成情况和芽胞计数及SDS-PAGE 等方法分析了突变体的特点; 构建了遗传恢复菌株对上述性状进行了功能验证; 利用启动子融合lacZ 技术检测了cry3A 基因启动子的转录活性。【结果】获得了苏云金芽胞杆菌HD-73 菌株sigK 基因突变体,生长曲线测定表明,突变体较出发菌株在稳定期后期生长较慢; 扫描电子显微镜观察和芽胞计数分析显示,突变体丧失了形成芽胞和晶体的能力; SDS-PAGE 分析表明突变体中伴胞晶体蛋白的表达量明显低于出发菌株和恢复菌株。利用载体pHT315 携带sigK 基因及其启动子在突变株中表达,所获得的遗传恢复菌株恢复了突变株产生芽胞和晶体的能力; sigK 基因的突变可以提高cry3A 基因启动子在产胞后期的转录活性,对cry3A 启动子指导的Cry 蛋白表达量没有显著影响。【结论】本研究证明sigK 基因为苏云金芽胞杆菌芽胞形成所必需,并影响伴胞晶体蛋白的产量; sigK 基因功能的丧失有利于cry3A 基因启动子在产胞后期的转录。     

UV与DES复合诱变选育高产脂肪酶菌株

以产脂肪酶菌株BaciUus sp CS-4为出发菌株,进行了UV与硫酸二乙酯(DES)复合诱变处理.筛选出一株高酶活的目的菌株,命名为Bacillus spDE-8.其酶活为每毫升14.85U,比出发菌株提高48.2%.传代实验证明,其遗传性能稳定.     

尖镰孢古巴专化型4号小种T-DNA插入突变体Focr4-1562及其基因敲除子的生物学表型研究

尖镰孢古巴专化型4号小种Fusarium oxysporum f. sp. cubense race 4（Focr4）是引起毁灭性土传病害香蕉枯萎病的危害性最大的小种,至今其致病机理尚不清楚。对已获得的野生型菌株Focr4-193-6经基因T-DNA插入引起致病性严重减弱的突变体Focr4-1562及其插入失活基因的敲除子△Focr4-1562的生物学表型进行了研究。玻璃纸穿透试验、活体叶片接种及根部接种致病性测定的结果表明,插入突变体和敲除子不能穿透玻璃纸生长,叶片接种和根部接种未见有明显病斑和球茎维管