内蒙古白绒山羊TSC2基因克隆与表达模式分析

旨在克隆内蒙古白绒山羊TSC2基因cDNA并分析其特性及基本表达模式.利用RT-PCR分段克隆TSC2基因cDNA片段并测序,将得到的cDNA各片段核苷酸序列拼接后获得绒山羊TSC2基因编码区全长序列(HQ684023)并进行生物信息学分析.半定量RT-PCR方法检测TSC2基因在不同组织中的表达特异性.结果表明内蒙古白绒山羊TSC2基因cDNA编码区核苷酸序列为5184 bp,包含了编码1727个氨基酸残基的全长ORF.核苷酸序列与牛、猪、马、大熊猫、犬、恒河猴、人、小鼠及大鼠的同源性分别为97％、90％、89％、88％、87％、87％、87％、86％和86％.NCBI CDD程序预测该基因编码的蛋白质有一个Tuberin结构域和一个Rap-GAP结构域;Psite程序分析有5个N糖基化位点、2个cAMP和cGMP依赖蛋白激酶磷酸化位点、16个蛋白激酶C磷酸化位点、25个酪蛋白激酶磷酸化位点.PSORT程序预测其定位于胞内体膜.TSC2基因在内蒙古白绒山羊的睾丸、脑、肝脏、肺、乳腺、脾和肾脏等组织中都有表达,mRNA丰度在睾丸中较高,乳腺中较低.     

内蒙古白绒山羊VEGF164基因cDNA克隆及组织表达特异性分析

旨在克隆内蒙古白绒山羊血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF164)基因并分析其基本表达模式。采用RT-PCR技术克隆基因,将得到的基因cDNA序列及其编码的氨基酸序列进行生物信息学分析。利用半定量RT-PCR方法进行组织表达检测。获得了内蒙古白绒山羊VEGF164基因编码区cDNA全长序列,扩增片段全长573 bp,包含了完整的ORF,编码190个氨基酸残基。核苷酸序列与绵羊的VEGF164(EU857623.1)基因同源性为99%,相应的氨基酸序列同源性为99%。SMART程序分析表明,ORF编码的蛋白质具有信号肽序列及血小板衍生和血管内皮生长因子家族(PDGF,VEGF)结构域。Psite程序分析表明,有1个蛋白激酶C磷酸化位点,4个酪蛋白激酶磷酸化位点。ProtComp Version 9.0程序分析将其定位于细胞外。RT-PCR检测表明,VEGF164基因在绒山羊脑、心脏、睾丸、胰腺、脾、肾和肺组织中均有表达。     

内蒙古白绒山羊IGF-IR基因cDNA克隆及组织表达特异性分析

旨在克隆内蒙古白绒山羊IGF-IR基因并分析其基本表达模式.采用RT-PCR克隆基因,将得到的IGF-IR基因cDNA片段的核苷酸序列及其编码的氨基酸序列进行生物信息学分析.半定量RT-PCR进行组织特异性表达检测.获得了内蒙古白绒山羊IGF-IR基因3’端编码区2118 bp的cDNA序列(JN200823),编码705个氨基酸残基.核苷酸序列与牛的IGF-IR( XM606794.3)基因同源性为98％,相应的氨基酸序列同源性为99％.SMART分析表明,推导出的编码蛋白具有跨膜域,酪氨酸激酶催化域.半定量RT-PCR检测表明,IGF-IR基因在绒山羊脑、胰腺、肝、肾组织中均有表达.     

内蒙古白绒山羊erk2基因的克隆及表达模式分析

旨在克隆内蒙古白绒山羊erk2基因cDNA并分析其基本表达模式。采用RT-PCR方法克隆白绒山羊erk2基因cDNA。通过在线软件Blast进行核酸序列分析,用SMART与Psite进行氨基酸序列分析。定量RT-PCR检测erk2基因在绒山羊组织中的表达特异性。免疫组化法检测绒山羊睾丸中erk2表达。克隆到的内蒙古白绒山羊erk2基因cDNA片段 (GenBank Accession No.JX569765) 长1 083 bp,包含了编码360个氨基酸残基的全长ORF,氨基酸序列与牛的ERK2 (Bos Taurus BC133588.1) 同源性为100％。SMART分析表明,ORF编码的蛋白包含了活化位点“TEY”及具有丝氨酸/苏氨酸激酶催化活性的S-TKc结构域。Psite分析表明,含2个N-糖基化位点、1个依赖于cAMP/cGMP的蛋白激酶磷酸化位点、3个蛋白激酶c磷酸化位点、5个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点、2个N-豆蔻酰化位点、2个异戊二烯基结合区 (CAAX box)、7个微体羧基端靶向信号、2个蛋白激酶ATP结合区标记及一个丝/苏氨酸蛋白激酶活性区域标记。PSORT (k-NN prediction) 程序预测其定位于细胞质中。定量RT-PCR分析显示erk2基因mRNA丰度在心脏、皮肤以及乳腺组织中mRNA丰度较高,脾、肾中的表达相对较低。在睾丸中检测到ERK2蛋白表达。     

内蒙古白绒山羊4E-BP1基因cDNA克隆及组织表达特异性分析

旨在克隆内蒙古白绒山羊4E-BP1(真核细胞翻译起始因子4E结合蛋白1)基因并进行生物信息学及表达模式分析。根据已报道物种4E-BP1基因cDNA序列,用primer premier5软件设计引物,通过RT-PCR从绒山羊胎儿成纤维细胞总RNA中扩增出4E-BP1基因编码区cDNA序列,对目的片段进行测序及表达模式分析。克隆到的内蒙古白绒山羊4E-BP1基因cDNA全长357 bp,包含了完整的的ORF,编码118个氨基酸残基。核酸序列与牛、马、人、大鼠及小鼠的同源性分别为98%、90%、90%、88%和87%。4E-BP1基因在绒山羊脑、心脏、睾丸及胰腺组织中均有表达。     

恶性疟原虫海南株(FCC1)翻译控制肿瘤蛋白(TCTP)基因的克隆及序列测定

为了获得翻译控制肿瘤蛋白 (TCTP)基因 ,提取恶性疟原虫海南株 (FCC1)总RNA ,直接用总RNA反转录成单链DNA ,再用长距PCR方法扩增出双链cDNA .根据小鼠约氏疟原虫TCTP基因序列设计引物 ,以cDNA为模板合成了恶性疟原虫海南株TCTP基因 .以pMD18 T为载体 ,用大肠杆菌XL1 blue对基因克隆 .测序结果表明 ,此基因序列与小鼠约氏疟原虫TCTP基因序列有 85 %同源性 .由此基因序列推导出的TCTP氨基酸序列 ,与小鼠约氏疟原虫TCTP氨基酸序列有 88%同源性 .进入GenBank国际基因库 (美国 )检索 ,所克隆的基因与基因库中恶性疟原虫基因同源性为 97% ;由所克隆的基因序列推导的TCTP氨基酸序列 ,与国际基因库恶性疟原虫TCTP基因推导的TCTP氨基酸序列仅有 1个氨基酸差异 .恶性疟原虫海南株TCTP基因克隆为进一步研究奠定了基础     

尼罗罗非鱼核糖体蛋白S6基因克隆及组织表达分析

核糖体蛋白S6(ribosomal protein S6, RPS6)是构成40S小亚基核糖体的关键蛋白之一,在蛋白质合成、调控细胞周期和凋亡、调节肿瘤细胞增殖和转移等方面具有重要作用。为探究RPS6在尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)中的分子结构、表达特性和生物学功能,本研究从尼罗罗非鱼中克隆获得RPS6基因的编码区序列(GenBank登录号：XM＿003454192.4;命名为On-RPS6),并采用qPCR法分析该基因在健康鱼体各组织的分布特征以及无乳链球菌刺激后该基因在鱼体肝脏、脾脏、脑和头肾中的表达模式。结果显示：On-RPS6的开放阅读框长度为750 bp,编码249个氨基酸,理论分子量为28.70 kDa,等电点为10.90。氨基酸序列分析显示,On-RPS6具有一个高度保守的核糖体蛋白S6e结构域,且与其他物种具有较高同源性。系统进化树分析表明,尼罗罗非鱼RPS6与斑马拟丽鱼(Maylandia zebra)RPS6聚为一支,表明二者具有较近的亲缘关系。qPCR结果显示,尼罗罗非鱼各组织均能检测到On-RPS6基因mRNA的表达,且在血液中的表达量...     

小麦翻译控制肿瘤蛋白TCTP与蔗糖非酵解型蛋白激酶SnRK1的相互作用

翻译控制肿瘤蛋白(Translationally controlled tumor protein, TCTP)广泛存在于真核细胞中,参与调节细胞分裂、植物生长发育,并介导植物抵御病原物侵染。蔗糖非酵解型蛋白激酶(SNF1-related protein kinase, SnRK1)在酵母、动物和植物中非常保守,并参与包括糖代谢和抵抗非生物和生物胁迫在内的一系列生理过程。本实验室前期工作证明TaTCTP响应叶锈菌侵染并参与诱发寄主产生防卫反应。为了深入探讨TaTCTP在叶锈菌侵染小麦诱发的防卫反应中发挥的作用,采用串联亲和纯化(TAP)与质谱(MS)联用技术,鉴定出SnRK1可能为TaTCTP潜在互作蛋白。文中对TCTP和SnRK1的相互作用进行了研究。酵母双杂交结果表明,同时携带TCTP和SnRK1的酵母可以在SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade(SD/-LWHA,四缺)培养基上生长,说明TCTP与SnRK1在酵母双杂交系统中可以发生相互作用;通过双分子荧光互补实验,发现TCTP与SnRK1发生相互作用的荧光信号分布在细胞质中;进一步用Co-IP实验证明TCTP和SnRK1可以发生相互作用。本研究为深入研究TaTCTP在小麦与叶锈菌互作过程中的作用机制奠定了重要基础,对进一步完善小麦抵御叶锈菌侵染的分子机理具有重要意义。     

芹菜NHL-like蛋白基因克隆与表达分析

植物生长发育过程中会遭遇各种病原物的攻击,植物为了应对这些危害并适应外界的生存竞争,逐渐演化出了复杂的防御机制。NHL基因家族庞大,部分NHL基因受病原物诱导后会过量表达,增强植物对多种病原菌的抗性,是与植物防御机制密切相关的蛋白。本研究以津南实芹和美国西芹2个芹菜品种为试验材料,分别克隆出NHL-like蛋白基因AgNHL。序列分析表明,上述2种芹菜的AgNHL基因序列均含636 bp的开放阅读框,编码211个氨基酸。2种芹菜碱基序列,只有第36位不同,津南实芹为T,美国西芹为C,2种碱基序列相似性高达99.84%,编码的氨基酸序列相同。进化分析显示,2种芹菜的NHL-like蛋白与葡萄、大豆等植物的相似度较高,在第80~185氨基酸间含一个LEA-2蛋白保守结构域。荧光定量PCR结果表明,AgNHL基因主要在芹菜茎中表达,根中表达量最低,有明显组织特异性,品种差异也很显著。对2种芹菜分别进行4℃低温、38℃高温、20%PEG处理、0.2 mol/L NaCl处理2 h表达分析显示,低温、盐处理下该基因表达量明显上升。     

eEF1A1基因克隆、原核分泌表达及融合蛋白纯化

eEF1A1作为蛋白合成中的重要翻译延伸因子,可与多种功能性蛋白如F-actin、BPOZ-2结合,并在细胞凋亡、蛋白降解方面起重要作用.以往原核基因工程蛋白表达系统大多为包涵体表达的变性分子,需要复性.为了获得eEF1A1原核分泌性可溶性蛋白分子,克隆了人eEF1A1蛋白编码序列(约1 300 bp),并成功构建pET22b-A原核分泌表达重组质粒,转化到大肠杆菌BL21(DE3)菌株,0.4 mmol/L终浓度IPTG诱导,经不同温度下包涵体与胞浆蛋白组分分析,快速明确蛋白表达情况,即诱导4 h后,37℃表达于包涵体组分,在30℃分泌表达至胞浆组分.通过His-Trap亲和层析纯化柱进行线性洗脱,Bradford法测定蛋白浓度高达620 mg/mL,SDS-PAGE分析纯度约为95%,蛋白大小符合50 kD,Western blotting显示目的蛋白能被eEF1A1抗体识别;质谱分析证实重组蛋白为人eEF1A1蛋白分子.为进一步研究其与重要功能性蛋白的相互作用及在细胞凋亡和蛋白降解中的作用奠定基础.     

意大利蝗存储蛋白Hex2基因的克隆与表达分析(英文)

【目的】昆虫存储蛋白(hexamerin)是在昆虫体内独立发生普遍存在的一种特异性淋巴蛋白,在昆虫的生长发育过程中起重要作用。【方法】克隆意大利蝗Calliptamus italicus的存储蛋白Hex2基因,并利用qRT-PCR方法分析其在不同组织和不同发育阶段的表达模式。【结果】克隆到意大利蝗存储蛋白Hex2基因Cit Hex2,其cDNA全序列长2 610 bp,开放阅读框(ORF)长为2 022 bp,3'非翻译区(UTR)长为124 bp,碱基序列与其他蝗虫的Hex2基因核苷酸一致性为80%~84%。Cit Hex2编码673个氨基酸,预测分子量和等电点分别为78.7 k Da和6.01。氨基酸分析表明,Cit Hex2富含较高的芳香族氨基酸,其中苯丙氨酸和酪氨酸共占15.8%。定量分析结果表明,Cit Hex2在意大利蝗的整个发育阶段都有表达,且在每个龄期的蜕皮前后均有表达量的变化;在检测的所有组织中,雌性个体的表达量较高。【结论】Cit Hex2参与意大利蝗的发育过程,与其生殖有关。     

多鳞白甲鱼X型凝集素(OmITLN)基因克隆及在抗菌免疫中的功能研究

为探究秦巴山溪半洞穴鱼类——多鳞白甲鱼的先天性免疫因子X型凝集素的免疫功能,研究从多鳞白甲鱼(Onychostoma macrolepis)肝脏转录组数据库筛选出一种Intelectin基因片段,通过克隆鉴定获得Intelectin基因cDNA序列全长,命名为OmITLN;采用qRT-PCR分析OmITLN基因在健康多鳞白甲鱼8个组织和嗜水气单胞菌感染后两个免疫组织的表达情况;构建OmITLN基因的原核表达载体并在大肠杆菌BL21中诱导表达,获得Om ITLN重组蛋白,采用ELISA法以及荧光标记法检测Om ITLN对病原菌的凝集效果及糖结合情况。结果显示, OmITLN是一种X型凝集素基因,其cDNA全长960 bp,编码315个氨基酸。Om ITLN蛋白含有1个N端的纤维蛋白原相关结构域(Fibrinogen-Related Domain, FReD)和1个C端Intelectin特异性区域,不具有信号肽和跨膜区。系统进化树分析发现, Om ITLN与鲫、团头鲂、鳙、草鱼等鲤科鱼类的Intelectin聚为一支,亲缘关系最近。OmITLN基因在所检测组织均有表达,且在脾脏和肝脏中的...     

藏山羊KLF8基因克隆及组织表达分析

本试验旨在获得藏山羊KLF8基因序列,并分析其生物学特征,同时阐明该基因在不同组织中的表达情况。利用RT-PCR技术克隆藏山羊KLF8基因序列,利用实时荧光定量PCR (quantitative real-time PCR,qPCR)检测其在藏山羊各个组织中的表达丰度。结果表明,获得藏山羊KLF8基因序列1 069 bp,其中包含CDS区1 008 bp,5'UTR序列28 bp和3'UTR序列33 bp,共编码335个氨基酸,为不稳定亲水碱性蛋白。KLF8基因在藏山羊的肺脏组织中表达水平最高,极显著高于其他组织(p<0.01)。本研究为进一步阐明KLF8基因在藏山羊中的生物学功能提供了依据。     

发菜耐旱相关蛋白NXL-01的基因克隆与表达分析

在发菜耐旱差异蛋白质组学研究中,发现假定蛋白(Hypothetical protein NXL-01)在干旱胁迫条件下表达量逐渐增加。根据已知氨基酸序列设计简并引物克隆NXL-01基因,长度为327bp(GenBank登录号为HM854288)。生物信息学分析表明,该基因具有较高保守性,蛋白质二级结构主要由α螺旋和随机卷曲构成,是亲水性的膜外蛋白,有5个Ser磷酸化位点,1个Thr磷酸化位点。将NXL-01基因在大肠杆菌中表达,获得预期大小的重组蛋白(12.4kD)。RT-PCR分析表明,NXL-01mRNA在干旱胁迫条件下表达量逐渐增加,与NXL-01蛋白的表达趋势一致。     

中华蜜蜂感觉神经元膜蛋白基因克隆、组织表达分析及原核表达

为明确中华蜜蜂Apis cerana cerana嗅觉形成中重要功能因子的信号转导通路, 本研究利用RT-PCR方法, 克隆了中华蜜蜂感觉神经元膜蛋白 (sensory neuron membrane protein, SNMP) 基因编码区, GenBank登录号为KC012595, 命名为AccSNMP1。序列分析表明, 该编码区开放阅读框长1 563 bp, 编码520个氨基酸, 推测的编码蛋白的相对分子量和等电点分别为58.02 kD和5.83。同源性比较发现, 中华蜜蜂AccSNMP1与其他昆虫感觉神经元膜蛋白基因同源性差异很大, 在氨基酸水平上与西方蜜蜂Apis mellifera SNMP基因一致性达99.2%, 与熊蜂Bombus impatiens SNMP基因一致性达90.9%, 而与赤拟谷盗Tribolium castaneum SNMP基因一致性仅为22.7%。系统发育树显示中华蜜蜂与西方蜜蜂遗传距离最近。实时荧光定量PCR结果分析表明, AccSNMP1在触角中表达量最高, 在足中表达量较高, 与胸、 腹、 头（去除触角和喙）、 喙中表达量相比差异显著（P<0.05）。构建原核表达载体pEASY-E1-AccSNMP1, 经IPTG诱导, 中华蜜蜂感觉神经元膜蛋白在大肠杆菌Escherichia coli BL21 （DE3）中高效表达。结果为进一步研究AccSNMP1在中华蜜蜂体内的作用机理奠定了基础。     

小球藻亲环蛋白A(CyPA)基因克隆及表达特性分析

亲环蛋白广泛存在于生物体中,并发挥着重要的作用。本研究从小球藻cDNA文库中筛选获得亲环蛋白A(CyPA Gene);通过提取转化35S::CyPA::GFP融合质粒拟南芥的原生质体研究表明,CyPA定位于叶绿体中;过表达CyPA基因的酵母能够增强InV酵母对NaCl、NaHCO3胁迫的生长能力;通过实时定量PCR研究表明,在非生物胁迫的条件下,CyPA基因的表达量升高,推测CyPA基因与非生物胁迫抗性相关,亲环蛋白A参与生物体的抗逆生存能力。     

桃蛀螟气味结合蛋白CpunOBP3和CpunOBP4的基因克隆、原核表达及配体结合特性分析

[目的]本研究旨在明确气味结合蛋白(odorant binding proteins,OBPs)在桃蛀螟Conogethes punctiferalis化学感受过程中的生理功能,为以OBPs蛋白为防治靶标的桃蛀螟绿色防控提供理论依据.[方法]基于前期桃蛀螟触角转录组测序数据,利用PCR技术从桃蛀螟触角中获得桃蛀螟气味结...     

中华按蚊气味结合蛋白AsinOBP2的基因克隆、表达谱及与人体气味物质的结合特性分析

[目的]克隆中华按蚊Anopheles sinensis气味结合蛋白2(odorant binding protein 2,OBP2)基因AsinOBP2,分析该基因的表达及其重组蛋白与人体气味物质的结合能力.[方法]采用RT-PCR和RACE技术克隆AsinOBP2的全长cDNA序列,通过qPCR分析AsinOBP2...     

人类SR蛋白超家族新成员——SFRS12(SRrp508)的基因克隆和特性分析

采用生物信息学方法克隆出全长3811bp的人类RC508cDNA片段,经核酸和蛋白质分析为人类新基因（Gen-Bank登记号：AF459094）,利用RT－PCR方法从人类胰脏组织中扩增出包含码508个氨基酸残基最大开放读码框架（ORF）的1680bp cDNA片段,经核酸测序证明与电子克隆结果完全一致。该基因具有启动子和TATA-box,ORF前同一相位有多个终子码,后有加尾信号,显示为客观存在基因。该基因含有12个外显子（96－2093bp)和11个内含子（140－5153bp),定位于人类5号染色体5q11.2-q12.1,无任何连锁基因存在。该基因ORF342－1868（1527）横跨10个外显子,所编码508氨基酸蛋白的全长序列与大鼠丝氨酸－精氨酸二肽富含性（SR）剪切调控蛋白86（1527）横跨10外显子,所编码508氨基酸蛋白的全长序列与全长序列与大鼠丝氨酸－精氨酸二肽富含性（SR）剪切调控蛋白86（SRrp86)高度同源,在核酸和蛋白水平的同源性分别为84％和86％,与其他已知蛋白无论在核酸水平是在氨基酸水平几乎均无整体的同源性。结果表明,所克隆的508氨基酸蛋白才是大鼠SRrp86的人类同源物,从而修正了Barnard(2000)所指出的人类同源物为人类精氨酸富含性核蛋白54（p54)这一论断,并提示它是日益增长的SR蛋白超家族的又一个新成员。该基因组织表达谱广泛,有可能具有转录因子活性,暂命名为SR相关剪切调控蛋白508（SRrp508)。国际人类基因命名委员会已将其命名为丝氨酸－精氨酸二肽含性剪切因子12（splicing factor,arginine/serine-rich),缩写为SFRZS12,化名为DKFZp564B176,SRrp86。