水貂肠炎病毒SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法的建立

根据Gen Bank登录的水貂肠炎病毒(MEV)VP2蛋白基因的保守序列设计了1对特异性引物,经PCR扩增出146bp的目的片段,并克隆到pMD 18-T载体上,提取重组质粒经PCR及测序鉴定正确后,以10倍梯度稀释质粒作为阳性标准品,绘制荧光定量标准曲线,以此建立一种基于SYBR Green荧光染料的定量PCR特异性检测水貂肠炎病毒的方法。结果表明:该方法对MEV有很好的特异性,检测灵敏度为34拷贝/μL,且重复性试验变异系数均小于2%。临床检测中,在80份样品中检测到30份阳性样品,高于普通PCR和电镜观察方法的检出率。该方法的建立实现了对MEV临床早期快速诊断和定量分析,为毛皮动物MEV的防控提供了可靠的检测方法。     

结合内标的小鼠诺如病毒荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用

目的建立一种快速、特异、敏感的荧光定量RT-PCR检测方法,用于小鼠诺如病毒(murine norovirus,MNV)的检测。方法根据MNV ORF1-ORF2结合区域中保守序列设计一对特异性引物和Taqman探针,同时设计和制备了内标用于监控假阴性,建立含有内标的荧光定量RT-PCR检测体系,通过优化,得到最佳反应体系和反应条件;构建质粒标准品并以之为模板绘制标准曲线;进行特异性、敏感性和重复性试验,最后用建立的方法检测344份小鼠临床样本,验证在临床应用中的效果。结果该方法特异性强,与小鼠肝炎病毒、小鼠脑脊髓炎病毒、仙台病毒、小鼠肺炎病毒、呼肠孤病毒Ⅲ型、出血热病毒和淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒不发生交叉反应。构建的荧光定量标准曲线Ct值与模板浓度呈良好的线性关系相关系数r2=0.9986,可以检测到10 copies/μL的质粒标准品,对MNV活病毒检测可检测到1.78×10-2TCID50/m L的病毒,检测灵敏度比常规RT-PCR高10倍,比病毒分离高100倍。对5份样品进行5次批内和批间重复检测,检测结果变异系数均小于2%。通过对344份临床样品检测,检测到阳性样品103份,阳性率29.94%。有5份样本结果为假阴性。结论建立的MNV荧光定量RTPCR检测方法特异性强、敏感性高、重复性好,由于加入了内标,能有效地监控假阴性的出现,适合用于MNV日常监测、临床诊断和流行病学调查。     

猪圆环病毒2型TaqMan实时PCR检测方法的建立

设计合成了一套引物和TaqMan探针,特异性扩增猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2基因,在国内首次建立了快速定量检测PCV2的实时PCR方法,且该方法具有较好的特异性和重复性,对PCV2DNA检测下限为1copy/μL,敏感性比常规PCR高106倍;分别用该法和普通PCR方法对PMWS人工发病猪的10份组织及30份血清样品检测,结果表明该方法具有更快速、灵敏、准确、低污染等优点,并可以对PMWS的早期检测、预防起到指示作用.     

猪圆环病毒2型TaqMan实时PCR检测方法的建立

设计合成了一套引物和TaqMan探针,特异性扩增猪圆环病毒2型（PCV2）ORF2基因,在国内首次建立了快速定量检测PCV2的实时PCR方法,且该方法具有较好的特异性和重复性,对PCV2DNA检测下限为1copy／μL,敏感性比常规PCR高10^6倍;分别用该法和普通PCR方法对PMWS人工发病猪的10份组织及30份血清样品检测,结果表明该方法具有更快速、灵敏、准确、低污染等优点,并可以对PMWS的早期检测、预防起到指示作用。     

烟草环斑病毒的定量检测技术研究

目的:建立特异、灵敏、快速的TaqMam实时荧光定量PCR方法,用于烟草环斑病毒(TRSV)的定量检测。方法:用纳米磁珠法提取病毒RNA,构建包含烟草环斑病毒全CP序列的质粒标准品。根据CP保守序列设计特异性的引物和TaqMam荧光探针,构建标准曲线,建立TRSV的实时荧光绝对定量PCR方法,并对该方法的特异性、灵敏度和重复性进行评估。结果:建立的方法特异性好,与南芥菜花叶病毒、马铃薯X病毒和马铃薯Y病毒均无交叉反应;至少能检测到767个病毒拷贝,灵敏度比普通PCR高100倍;同一样品试验内及试验间重复性实验的变异系数均小于3%,重复性好;检测结果准确可靠,构建的标准曲线有较好的线性关系(R2=0.997)。结论:建立的TRSV TaqMan实时荧光定量PCR检测方法可满足口岸高通量、快速、准确的检验检疫要求。     

甘蔗杆状病毒荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用

为建立一种能够快速、灵敏、特异的检测甘蔗杆状病毒(sugarcane bacilliform virus, SCBV)的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法,针对SCBV的基因序列,设计了特异性扩增引物,利用构建的标准品建立和优化针对SCBV的荧光定量PCR检测方法,并对该方法进行了特异性、稳定性、灵敏性等的测试,随后用于田间样品的检测。结果表明:将含有SCBV基因组序列的重组质粒进行梯度稀释制成标准品,利用标准品进行荧光定量PCR,获得标准曲线y=-3.482 1x+37.264,相关系数r~2=0.999 9,说明CT值与反应起始模板数量呈线性关系,可进行准确定量;组内和组间变异系数在0.19%～1.68%之间,表明检测方法重复性良好;建立的荧光定量PCR方法最低可检测到10个拷贝重组质粒/μL,是常规PCR检测灵敏度的100倍。使用建立的荧光定量PCR方法和常规PCR方法对采集的90份甘蔗叶片样品进行检测,常规PCR检出53份阳性样品,荧光定量PCR检出56份阳性样品,表明所建立的荧光定量PCR方法较常规PCR敏感性高,且准确性高。本研究建立的SCBV荧光定量PCR检测方法重复性好,灵敏度高,为构建甘蔗健康种苗体系提供了一种高效检测方法。     

实时荧光定量PCR技术在SPF鸡四种垂直传播疾病监测中的应用

目的探讨荧光定量PCR检测技术对SPF鸡四种垂直传播病毒的检测应用。方法采集60份SPF鸡及70份普通鸡群蛋清、泄殖腔试子样品,提取样品核酸,分别进行ARV、REV、CAV、ALV四种病毒实时荧光定量PCR检测,根据标准曲线及溶解曲线分析判读样品病毒拷贝数。结果 SPF鸡ALV 2份阳性,检出率3.3%,其余病毒检测均为阴性;普通鸡样品REV检测2份阳性,检出率2.9%,ALV 10份阳性,检出率14.3%。结论荧光定量PCR检测方法最低可检测到100个拷贝核酸,检测灵敏度较高,有望应用于SPF鸡临床样品的病原检测。     

一种实时荧光定量PCR检测Ⅱ型单纯疱疹病毒检测方法的研究

建立SYBR Green实时荧光定量PCR方法,用于快速、准确检测Ⅱ型单纯疱疹病毒(HSV-2)。设计特异性引物,PCR扩增糖蛋白G(g G)片段,构建p EASY-T1-g G2重组质粒作为标准品,绘制标准曲线,同时考察该方法的稳定性、灵敏性和特异性,并利用此方法检测HSV-2血清学确诊的生殖器疱疹临床样本。本实验获得的标准曲线R~2=0.997,相关性良好,灵敏度是普通PCR的1 000倍。用本方法检测HSV-2血清学确诊的生殖器疱疹临床样本均为阳性,符合率为100%,且每份样品检测结果的变异系数均小于2%。本研究建立的SYBR Green实时荧光定量PCR方法可用于临床HSV-2感染的检测。     

猴免疫缺陷病毒（SIV）实时荧光定量PCR检测方法的建立

目的建立快速、敏感、特异的猴免疫缺陷病毒（SIV）TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法,对SIV病毒核酸进行定量检测。方法RT—PCR扩增SIVmac251保守gag基因序列796bp片段,进行TA克隆,构建标准品质粒pMD—SIVgag。通过对SIV定量外标准品的定量分析,优化反应体系,检测TaqMan探针实时荧光定量PCR方法的灵敏度、特异性和重复性。结果所建立的SIVQPCR检测方法,质粒DNA模板在10’～10。拷贝之间表现较好线性和相关性,标准曲线所得斜率为-3．26,相关系数为0．999。检测灵敏度达到200拷贝,方法重复性测试,检测25份临床样品CV％均小于1％。结论建立的SIVQPCR检测方法特异性、敏感性高,稳定性好,可用于定量测定猴免疫缺陷病毒（SIV）核酸拷贝量。     

埃博拉病毒莱斯顿亚型实时荧光定量PCR检测方法的建立

本研究的目的为建立一种灵敏、快速、定量检测埃博拉病毒莱斯顿亚型核酸的实时荧光定量PCR检测方法及试剂盒。首先选择埃博拉病毒莱斯顿亚型的保守基因NP基因作为检测靶目标,筛选出保守序列并设计合成一对特异性引物。然后将连有NP全长基因的重组质粒作为定量标准品,将10倍系列稀释的重组质粒进行荧光定量PCR扩增,绘制标准曲线,并进行重复性、灵敏度及特异性检测。结果显示建立的埃博拉病毒莱斯顿亚型荧光定量PCR检测方法,其灵敏度可达102拷贝/μL,不同梯度标准品间线性关系(R2)达0.997,斜率为-0.3101,扩增效率为110.145%,所有标准品均在79.94℃出现尖且窄的特异性熔解峰。利用该检测系统可以快速定量检测埃博拉病毒莱斯顿亚型核酸,灵敏度高、重复性好,可用于基础及临床实验室对埃博拉病毒莱斯顿亚型感染的快速诊断和临床效果的监测,具有实际的应用价值。     

双重荧光定量PCR检测志贺毒素stx1和stx2基因

目的建立一种双重荧光定量PCR检测志贺毒素stx1和stx2基因的方法。方法根据不同细菌来源的stx1和stx2序列,设计PCR引物和TaqMan探针,建立双重实时荧光定量PCR检测体系,进行灵敏度、特异性和重复性评价,并对腹泻患者粪便样本进行检测分析。结果双重实时荧光定量PCR检测含志贺毒素基因重组质粒的最低检测下限为102 copies/mL;该法对12种常见肠道病原菌均无特异性扩增,对不同浓度的标准质粒检测重复性高,Ct值变异系数均小于10%;对急性腹泻粪便标本的检测阳性率高于细菌分离培养。结论建立的双重实时荧光定量PCR可作为不同细菌来源的志贺毒素基因的快速鉴定方法,亦可用于人感染性腹泻标本的快速筛查。     

家蚕质型多角体病毒荧光定量PCR检测方法的建立

根据GenBank报道的家蚕质型多角体蛋白基因的保守序列设计特异性引物扩增118bp核苷酸片段,使用含有目的基因片段的重组质粒标准品绘制标准曲线,建立家蚕质型多角体病毒的实时荧光定量PCR检测方法。结果表明,标准曲线中模板拷贝数(X)与Ct值(Y)关系为Y=-3.582lgX+38.748,相关系数R2=0.999,构建的实时荧光定量PCR检测方法具有良好的敏感性、特异性和重复性,可用于家蚕质型多角体病毒病的快速检验及该病的流行性调查研究。     

SYBR Green实时荧光定量PCR快速检测口腔幽门螺杆菌

目的建立一种快速、灵敏、特异的鉴定幽门螺杆菌实时荧光定量PCR方法。方法利用SYBR Green实时荧光定量PCR反应体系对口腔幽门螺杆菌进行检测。鉴定结果与临床常规鉴定方法相比较,评价其敏感度、特异度及重复性。结果通过48例样品的检测,结果显示实时荧光定量PCR法检测标本的鉴定结果与常规PCR鉴定方法的结果对比,特异度为100%,敏感度为100%;最小能检测到102个拷贝数的重组质粒;批内重复试验和批间重复试验结果均与常规鉴定方法结果相符。结论实时荧光定量PCR法鉴定口腔幽门螺杆菌,特异度和敏感度高,重复性好,且快速、简便。该方法有望成为检测口腔幽门螺杆菌感染的一种快速有效的方法。     

PRRSV NADC30-like SYBR Green Ⅰ qPCR检测方法的建立与应用

为建立高效快速的PRRSV NADC30-Like毒株荧光定量PCR(SYBR Green real-time PCR)检测方法,根据NADC30毒株Nsp2基因保守序列设计特异性引物,通过优化确定最佳反应条件,并进行灵敏度、特异性、重复性实验以及临床样品的检测。结果显示,标准品在10~7 copies/μL到10~2 copies/μL浓度范围内具有良好的线性关系,最低检测浓度为2.25×10~1 copies/μL;该方法与HP-PRRSV、PCV、PEDV、TGEV、PRV、CSFV、PoRV无交叉反应,批内和批间的变异系数(CV)小于1.9%,在临床样品的检测中较普通PCR有更高的检出率。建立了PRRSV NADC30-Like毒株荧光定量PCR检测方法,具有敏感性高、特异性强、稳定性好、准确度高和检测快速等优点,可用于PRRSV NADC30-Like感染的早期诊断、样品的快速检测与定量分析。     

PRRSV NADC30-like SYBR Green Ⅰ qPCR检测方法的建立与应用

为建立高效快速的PRRSV NADC30-Like毒株荧光定量PCR(SYBR Green real-time PCR)检测方法,根据NADC30毒株Nsp2基因保守序列设计特异性引物,通过优化确定最佳反应条件,并进行灵敏度、特异性、重复性实验以及临床样品的检测。结果显示,标准品在10~7 copies/μL到10~2 copies/μL浓度范围内具有良好的线性关系,最低检测浓度为2.25×10~1 copies/μL;该方法与HP-PRRSV、PCV、PEDV、TGEV、PRV、CSFV、PoRV无交叉反应,批内和批间的变异系数(CV)小于1.9%,在临床样品的检测中较普通PCR有更高的检出率。建立了PRRSV NADC30-Like毒株荧光定量PCR检测方法,具有敏感性高、特异性强、稳定性好、准确度高和检测快速等优点,可用于PRRSV NADC30-Like感染的早期诊断、样品的快速检测与定量分析。     

鉴别检测非洲猪瘟野毒株和基因缺失疫苗株的三重荧光PCR的建立

非洲猪瘟是由非洲猪瘟病毒(African swine fever,ASFV)引起的猪的一种急性、高度接触性传染病.本研究根据ASFV B646L、MGF360-14L和CD2v基因设计了 3套引物和探针,建立了可同时鉴别检测ASFV野毒株和基因缺失疫苗株的三重荧光PCR方法.结果表明,该法特异性强,可同时检测ASFV B646L、MGF360-14L和CD2v基因,与猪圆环病毒2型、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、口蹄疫病毒、猪A型塞内卡病毒等无交叉反应;两份ASFV MGF360-505R与CD2v基因联合缺失疫苗株DNA三重荧光PCR法检测结果都仅出现一条B646L扩增曲线,与预期一致;灵敏度高,该法对重组质粒pUC-B646L、pUC-360-14L和pUC-CD2v的检出限分别为1.572×103拷贝/mL、1.934×103拷贝/mL 和 1.929×103拷贝/mL,灵敏度比世界动物卫生组织(World organization for animal health,OIE)推荐的荧光PCR高10倍;重复性好,对三种重组质粒检测的Ct值批内和批间变异系数均小于2％;应用该法及OIE推荐的荧光PCR对1 215份样品进行平行检测,结果显示23份样品为阳性,1 192份样品为阴性,两种方法检测结果一致.本研究建立的方法能鉴别检测ASFV野毒株和基因缺失疫苗株(缺失MGF360-505R和/或CD2v基因),对将来基因缺失疫苗的推广应用及ASF疫情防控具有重要的意义.     

枣疯病植原体实时荧光定量PCR检测方法的研究

目的:建立枣疯病植原体拷贝数检测实时荧光定量PCR方法,为枣疯病植原体定量检测提供技术支持。方法:构建质粒标准品,设计实时荧光PCR探针引物,优化体系,建立标准曲线,并进行重复性验证。结果:制备了枣疯病植原体标准质粒,建立了稳定的质粒标准品检测体系(R2=0.998,检测限10拷贝,定量限100拷贝)。结论:实时荧光定量PCR检测方法重复性好,可用于枣疯病植原体的拷贝数检测,为枣疯病植原体检验检测和病害防治提供了技术支持。     

呼吸道合胞病毒TaqMan探针实时定量RT-PCR检测方法的建立及应用

目的:建立呼吸道合胞病毒(RSV)核酸特异、快速、敏感的TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法,并对临床样本进行检测。方法:比对编码RSV非编码蛋白的基因序列,选取其保守片段设计引物和探针,建立实时荧光定量RT-PCR检测方法,并与传统RT-PCR方法进行比较,分别对两者的灵敏性、特异性、重复性及临床样本检验的适用性进行评价。结果:所建立的实时荧光定量RT-PCR检测方法可用于RSV的特异性检测。相对于传统RT-PCR方法100拷贝/反应的检测灵敏度,实时荧光定量RT-PCR的检测灵敏度达到10拷贝/反应,检测范围为1010~101拷贝/反应,且具有良好的特异性和重复性。从169份临床呼吸道标本中检出RSV阳性40例,高于普通PCR方法(31/169)。结论:建立了RSV的TaqMan探针实时定量PCR检测方法,并可用于临床鼻咽拭子样本的检测,在临床上具有较好的应用前景。     

拟除虫菊酯降解酶基因APs实时荧光定量PCR检测方法的建立

本研究建立了一种能够快速、灵敏地检测来源于铜绿假单胞菌GF31中拟除虫菊酯降解酶基因APs的SYBR GreenⅠ相对实时荧光定量PCR方法。通过克隆构建APs目的基因及16S rRNA内参基因重组质粒,分别制备了质粒标准品SgI-pET30a、PA-pET30a、Pep-pET30a以及16S r RNA-p ET30a;绘制标准曲线,建立了实时荧光定量PCR体系。结果显示,在质粒标准品浓度为0.001~10 ng范围内,实时定量PCR标准曲线的线性关系良好,APs和16S r RNA的标准曲线R~20.99,扩增效率=95%~105%;熔解曲线呈单峰,特异性良好;扩增曲线呈S型,CT值在各梯度间均匀变化、重复性好;将建立的相对实时荧光定量PCR方法应用于检测工程菌及野生菌APs基因的m RNA表达水平,2~(-△△Ct)法计算得工程菌SgI、PA及Pep的表达量分别为野生菌的1 898、1 314和956倍。     

鸭冠状病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

为建立一种鸭冠状病毒（Duck coronaviruses,DuCoV）的临床快速诊断方法，根据鸭冠状病毒1b基因保守区域设计特异性引物，成功建立了用于检测鸭冠状病毒的特异性SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法。该方法特异性强、敏感性高、重复性好，对鸭冠状病毒有特异性扩增，最低检测限为8.04×100拷贝/μL，比普通PCR方法敏感10倍，批内变异系数与批间变异系数分别为0.28%～0.34%、0.25%～0.36%，均小于1%。对临床可疑鸭泄殖腔拭子进行检测，本方法与常规PCR方法的检测结果阳性符合率为100%，阴性符合率为96.43%，样本总符合率为97.62%。本研究建立的鸭冠状病毒SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法，可用于鸭冠状病毒的临床快速诊断及流行病学监测。