Tol2转座子系统在转基因动物中的应用

Tol2是在青鳉鱼基因组中发现的一种具有自主性的转座子元件.它编码转座酶,催化Tol2转座子结构中5’端200 bp和3’端150 bp序列发生转座反应.Tol2的多种特性,如可携带大片段外源DNA、单拷贝整合效率高、转座子活性强等,使得以Tol2特座子系统为载体的转基因技术在多种生物中得到应用.综述了Tol2转座子系统的结构、特性以及近年来在多种动物转基因中的应用.     

利用Tol2转座子构建斑马鱼心脏组织特异表达转基因载体及其表达分析

为了制备用于在斑马鱼心脏中特异表达目的基因的转基因载体,通过分子克隆的方法对能够在斑马鱼心脏中特异表达EGFP报告基因的Tol2载体进行了改造,在原有的CMLC2启动子与EGFP编码区之间插入带有多克隆位点的IRES序列,获得pTol2-CMLC2-IRES-EGFP转基因表达载体,该载体可以实现在同一个启动子CMLC2的驱动下分别同时表达目的基因和EGFP;为了验证该表达载体的有效性,进一步在CMLC2启动子与IRES序列之间插入DsRed-Monome编码区,利用得到的pTol2-CMLC2-RED-IRES-EGFP转基因载体显微注射到斑马鱼单细胞期胚胎中进行表达分析,结果表明外源目的基因DsRed-Monome和报告基因EGFP均能以相同的表达模式在斑马鱼心脏组织中特异表达。pTol2-CMLC2-IRES-EGFP转基因表达载体的成功构建对于建立心脏发育候选基因的斑马鱼转基因实验模型具有重要意义。     

青鳉Tol2转座子研究进展

鳉鱼Tol2转座子作为hAT（hobo/Activayor/Tam3）转座子家族中的一员,是目前所发现的唯一的天然存在且有转座活性的脊椎动物转座子。本文从Tol2转座子的结构,转座机制和应用方面作一个综述。     

金鱼hAT家族转座子Tgf2的克隆及其结构

hAT家族转座子以果蝇hobo、玉米Ac和金鱼草(Ceratophyllum demersum L.)Tam3为代表,以"剪切-粘帖"方式进行DNA转座。1996年,日本学者首次在白化青鳉(Oryzias latipes)中发现具有天然活性的脊椎动物hAT家族转座子,即青鳉Tol2转座子,该转座子已在模式生物斑马鱼转基因、基因和启动子捕获方面进行了广泛应用。文章根据玉米Ac与青鳉Tol2转座子序列保守区设计一对引物,在19种不同鱼类物种或品系中进行PCR筛选,最后发现此类hAT家族转座子在我国不同品系金鱼中存在,命名为金鱼Tgf2转座子。金鱼Tgf2转座子全长4720bp,由4个阅读框组成,与青鳉Tol2转座子的相似度为97%。金鱼Tgf2与青鳉Tol2转座子在末端倒位重复和亚末端重复上存在一定差异,此外,金鱼Tgf2转座子的中间反向重复序列(1453bp到2091bp)可形成一种"十"字结构,明显有别于青鳉Tol2转座子形成的茎环结构,这些区域与转座活性密切相关。文章预示金鱼Tgf2转座子可能具有更高的天然转座活性,构建高效金鱼Tgf2转基因元件可供鱼类转基因和基因捕获研究。     

荧光转基因斑马鱼Tg(ttn.2:EGFP)的构建

为了建立一种用于研究肌肉和心脏发育及其相关疾病的绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)转基因斑马鱼品系,本研究使用斑马鱼ttn.2基因编码区上游启动子序列和绿色荧光蛋白基因编码序列构建了重组表达载体,并将该载体和Tol2转座酶的加帽mRNA显微共注射入斑马鱼1-细胞期胚胎,通过荧光检测、遗传杂交筛选和分子鉴定等方法,成功建立了能稳定遗传的Tg(ttn.2:EGFP)转基因斑马鱼品系。荧光表达分析及原位杂交分析结果表明,绿色荧光信号在斑马鱼肌肉和心脏组织中特异表达模式与ttn.2基因的mRNA表达一致。通过反向PCR鉴定转基因表达载体在F1代斑马鱼品系中的随机整合位点,结果表明:No.33转基因品系的EGFP基因整合在斑马鱼的4号和11号染色体上,No.34转基因品系则整合在1号染色体上。该荧光转基因斑马鱼品系Tg(ttn.2:EGFP)的成功构建为肌肉和心脏发育以及相关疾病研究提供了一个新的理想实验模型。此外,绿色荧光强烈表达的斑马鱼品系还可以作为一种新的观赏鱼。     

Tgf2转座子多克隆位点的克隆与表达

以金鱼pTgf2-EF1α-EGFP转座子为基础,构建含有多克隆位点(Multiple cloning sites,MCS)序列以及外源目的基因肌醇-3-磷酸合成酶(Myo-inositol-3-phosphate synthase,MIPS)的重组表达载体并注射到斑马鱼1-2期受精卵,检测重组表达载体pTgf2-EF1α-MCS-EGFP和pTgf2-EF1α-MCS-MIPS-EGFP在斑马鱼中绿色荧光蛋白基因(EGFP)的表达情况以及外源基因MIPS在斑马鱼体内的整合情况。荧光观察结果显示,两个重组载体均不影响EGFP的表达,只是表达强度存在一定差异,表明对Tgf2转座子的改造是有效的。转基因斑马鱼PCR检测结果显示,靶基因MIPS的编码区能够完整地整合到斑马鱼基因组中,整合效率达31.4%。重组表达载体的成功构建显示金鱼Tgf2转座子可以介导外源基因在斑马鱼中的表达,为以后Tgf2转座子在鱼类基因功能研究方面奠定了基础。     

Tol1转座子研究进展

Tol1和Tol2是在青鳉基因组中发现的具有自主活性的DNA转座子,而Tol1转座子的自主活性是新近才发现的,因此对它的报道较少。较之Tol2,Tol1可以携带更大片段的DNA进行转座,且Tol1的转座不受转座酶"过量表达抑制"的影响。研究已证实,Tol1转座子在秀丽线虫、斑马鱼、爪蟾和人等多种生物中具有转座活性。因此,在动物转基因和基因功能研究等方面有重要的应用前景。从Tol1转座子的结构特征、转座机制和作为基因转移载体的优点,以及应用研究等方面进行了简要的综述。     

昆虫转座子在转基因技术中的应用

转座子是基因组中一段可移动的DNA重复片段。越来越多的研究表明,转座子是真核生物基因组的主要组成成分,是基因组和表型进化的主要动力之一,并且对基因表达调控网络的进化具有重要的贡献。由于转座子在基因组内具有可移动性,使其在生物技术和分子生物学领域备受重视,尤其在转基因技术上得到了广泛应用。本文综述了转座子在昆虫中的分布、类型及功能,重点阐述不同昆虫转座子在转基因技术中的应用,并对转基因安全性和转座子稳定性进行了讨论。     

利用PiggyBac转座子系统构建表达Δ15 Des酶活性的转基因小鼠

必需脂肪酸为人体健康和生命所必需,但机体自身不能合成,研究表明ω-3族脂肪酸对人体的生理功能有更加积极的影响。哺乳动物体内缺乏ω-3去饱和酶的基因,来自线虫Caenorhabditis elegans的Δ15-脂肪酸去饱和酶(Δ15Des)可以将体内ω-6多不饱和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids, PUFAs)转化为ω-3 PUFAs。利用PiggyBac转座子(PB)系统构建表达Δ15 Des酶活性的转基因小鼠可以在较短时间内繁育出稳定遗传的纯合子转基因小鼠,整合率高达35.1%。饲料中添加6%ω-6 PUFAs饲喂小鼠,通过气相色谱(gas chromatography, GC)检测小鼠体内脂肪酸的变化,荧光定量PCR(quantitative PCR,qPCR)和蛋白免疫印迹(Western blotting, WB)来检测Δ15 Des在小鼠体内的表达水平。从qPCR和GC结果分析,阳性小鼠的基因活性率为61.53%,与传统方法相比,Δ15 Des的转入效率及活性都显著提高,且纯合子比杂合子表达更高的活性,进一步验证了PiggyBac转座子系统高效...     

Tol2转座子介导斑马鱼rps26基因附近增强子捕获及注解分析

随着人类等生物大规模基因组测序工作的完成,认识和理解基因组上表达调控元件成为后基因组时代的重要研究任务,增强子捕获技术是一种鉴定基因组上增强子元件及其对基因表达调控机制的有效方法。本研究选择Tol2转座子系统介导制备的稳定增强子捕获品系TK4系(头部和躯干特异性GFP表达),利用Splinkerette PCR(sp-PCR)、原位杂交和比较基因组学等技术手段进行所捕获增强子的解析研究。将TK4系的F1代与野生型斑马鱼杂交,收集受精卵,于6 hpf(Hour post fertilization)、24 hpf、48 hpf、3 dpf(Day post fertilization)、4 dpf、5 dpf六个发育阶段通过荧光显微镜检测绿色荧光蛋白报告基因的表达模式;然后通过sp-PCR方法克隆到Tol2转座子插入位点斑马鱼基因组侧翼序列,经比对分析表明插入位点位于基因组23号染色体27749253位置,在rps26基因的intron1中,且报告基因插入方向与基因方向相反。在插入位点100 kb的基因组范围内有7个基因,分别为arf3a、wnt10b、wnt1、rps26、IKZF4、dnajc22和lmbr1l。通过VISTA程序对不同脊椎动物基因组同源序列比对结果显示,在rps26基因下游有2个潜在保守的非编码序列区CNS1(Conserved non-coding sequence)和CNS2,为可能的增强子元件。胚胎原位杂交表明:rps26基因的两个转录本有母源性表达,rps26-201在合子中的表达早于rps26-001,而TK4系斑马鱼的GFP在早期(6 hpf)不表达,后期rps26与GFP的表达模式既存在相似性,也存在差异性,提示两者可能既接受共同的增强子调控,但也存在不同增强子调控,所获得的2个潜在的增强子(CNS1和CNS2)可能对附近的基因(包括rps26)发挥差异的时空表达调控作用。本研究首次成功获得rps26基因附近2个潜在增强子,为深入研究这两个增强子对基因组附近基因的表达调控机制奠定基础,本研究所采用的结合技术手段也为增强子解析提供参考。     

piggyBac转座子介导的转基因叉尾斗鱼的构建

为探讨piggyBac转座子在鱼类动物中应用的可能性,以包含家蚕(Bombyx mori)肌动蛋白3启动子驱动的增强型绿色荧光蛋白(enhance green fluorescent protein,EGFP)基因的piggyBac质粒为载体,以及一个包含piggyBac转座酶的辅助质粒,采用显微注射的方法将其导入叉尾斗鱼(Macropodusopercularis)受精卵中,利用PCR技术证实了piggyBac转座子能够介导EGFP基因进入叉尾斗鱼基因组,并能够稳定遗传到下一代,符合孟德尔遗传规律。EGFP基因遗传到G1代的阳性鱼占交配鱼比率,即外源基因整合率为12.30%。实验证明,piggyBac质粒有可能成为水产动物转基因实验的新型载体。     

piggyBac转座子及其在转基因昆虫中的应用

piggyBac是一种从粉纹夜蛾Trichoplusiani.中分离到的、具有TTAA插入位点特异性的DNA转座子。piggyBac可在昆虫基因组中准确切离,转化频率较高,并且不受宿主因子的限制,是目前转基因昆虫研究中应用最广的转座子载体。近年来的研究发现,piggyBac类转座子广泛分布于昆虫和其他生物基因组中。文章从piggyBac的结构、转座特性、在转基因昆虫中的应用以及piggyBac类转座子的分布等几个方面综述了piggyBac的研究进展。     

利用Tol2转座子介导的增强子诱捕技术获得血管相关转基因斑马鱼系

心血管系统形成于胚胎发育极早期并为其他器官的发育、维持、修复所必需,血管生长异常可造成多种疾病.然而,由于研究对象所限,胚胎血管的发育机制尚未完全阐明,调控血管发育的基因也所知有限.通过Tol2转座子介导的大规模增强子诱捕筛选到26个血管特异表达绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因的转基因斑马鱼系,其中有一些品系在胚胎的某些特异血管结构中表达绿色荧光.通过linker-mediated PCR克隆到22个鱼系中Tol2插入位点附近的斑马鱼基因组序列,其中有17个鱼系的Tol2插入可定位到现有的斑马鱼基因组中的单一位点.通过整体胚胎原位杂交对插入位点附近的基因进行表达谱分析,得到8个表达谱与转基因鱼系一致的基因,涵盖了9个鱼系,其中dusp5基因对应于2个不同的鱼系.这8个基因中包括hhex、ets1a和dusp5等3个功能已知的基因,但是大部分(5个)基因在斑马鱼中尚无功能研究,分别为zvsg1、micall2a、arl8b(1of2)、zgc:73355以及hecw2(1of2).hhex和ets1a基因对血管与血细胞前体的发育具有重要作用,所获得的EGFP报告基因受hhex或ets1a基因增强子控制的转基因斑马鱼(mp378b和mp430c-2)为国际首例,为深入研究这两个基因在血管与血液发育中的作用机制提供了新的机遇.筛选到的功能未知基因可以用来进一步研究其在血管发育中的功能;同时,利用所获得的转基因鱼系,可以实现实时、动态观察成血管细胞的起源、分化与基因表达调控,并可用于高通量小分子药物筛选等重要研究.     

绵羊高效转基因通用型piggyBac转座子载体构建及功能验证

piggyBac (PB)是一种能在多种动物细胞中进行转座的DNA转座子,作为一种转基因工具已被广泛应用于各种哺乳动物转基因研究中。针对不同物种对PB转座子进行改造,是提升其通用性的必要手段。为构建基于绵羊细胞进行转基因操作的通用型PB转座子载体,本研究对PB转座酶(PBase)基因进行绵羊密码子偏好性优化并将其克隆到pBNW-TP1载体中,成功构建了PB转座子载体pBNW-TP2。将pBNW-TP2转染到绵羊成纤维细胞和乳腺上皮细胞中,利用G418筛选获取稳定转染细胞株;利用Tail-PCR检测稳定转染细胞株的PB转座位点,对细胞阳性克隆进行亚甲蓝染色;利用非配对t检验确认其转座效率。结果表明,pBNW-TP2成功介导了绵羊成纤维细胞和乳腺上皮细胞转基因阳性细胞株的生产;PB转座位点检测表明pBNW-TP2能特异性整合到绵羊基因组TTAA位点,其整合位点倾向于功能基因间;亚甲蓝染色统计分析结果提示pBNW-TP2介导的转基因效率显著提升。本研究成功构建了绵羊通用型PB转座子载体pBNW-TP2,并在绵羊体细胞中对其特性进行验证和分析,为PB转座子在绵羊体细胞中开展转基因相关研究提供了科学依据。     

利用Ac/Ds转座子系统在水稻中获得无选择标记转基因植株的方法

获得无选择标记转基因植株是进行重复转基因及消除转基因植株中标记基因潜在危害性的关键。实验采用了Ac／Ds转座子系统在水稻(Oryza sativa,L．)中进行无hpt选择标记的转基因。将含有目的基因bar的Ds元件和hpt标记基因置于同一个T-DNA中,通过农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHAl05介导将Ac-T-DNA及Ds-T-DNA分别转入到不同的水稻植株,再将单拷贝的Ac-T-DNA植株与单拷贝的Ds-T-DNA植株杂交得到同时含有Ac和Ds元件的F1植株,Fl自交产生F2后代,F2植株中转座后的Ds元件与T-DNA独立分离,在总共100株F2水稻植株中筛选得到2株只含有Ds元件插入而无hpt标记基因的转基因水稻植株。结果表明,利用Ac／Ds转座子系统在水稻中获得无选择标记的转基因植株是可行的。     

心脏特异表达绿色荧光斑马鱼模型的建立与评估

本课题组前期研究中, 利用斑马鱼cmlc2 (Cardiac myosin light chain 2)基因启动子构建了一个用于斑马鱼心脏组织特异表达外源基因的转基因表达载体pTol2-cmlc2-IRES-EGFP。文章利用该载体构建了一个稳定表达EGFP的转基因斑马鱼品系, 并初步分析了EGFP的表达对该转基因斑马鱼品系的心脏发育和功能的影响。结果表明, 在建立的转基因斑马鱼品系早期胚胎发育过程中, 绿色荧光信号在心脏中特异表达, 该表达模式与原位杂交分析的cmlc2的表达模式结果相同; 该转基因斑马鱼品系的心脏形态及发育生长正常; 进一步通过M-Mode分析心脏生理学功能的结果表明：该转基因品系心动周期、心率、收缩与舒张表面积及表面积缩短率等重要生理指标与正常野生型的斑马鱼对照组相比没有显著差别。以上结果表明该转基因品系中绿色荧光蛋白的表达对斑马鱼心脏的发育和功能没有影响。研究结果为进一步利用该载体建立外源目的基因转基因表达模型, 研究心脏表达基因的功能奠定了重要基础。     

利用转座子构建靶向侵袭性抗肿瘤工程菌

转座子是一类在基因组上可以自由跳跃的移动序列,同时也是对微生物进行基因修饰和插入突变的有效工具,但尚未见有利用转座子导入革兰氏阴性菌E.coli Nissle1917菌株的报道.本研究通过构建p R6K转座载体,对肠道益生菌E.coli Nissle1917菌株进行了转座插入诱变,将假结核耶尔森菌的侵袭素基因inv和单核细胞增多性李斯特菌的溶血素基因hly随机整合至E.coli Nissle1917菌株的染色体上,从而使非致病性大肠杆菌E.coli Nissle1917获得侵袭哺乳动物细胞的能力.通过细胞体外侵袭实验发现,本研究所构建的工程菌对B16,HCT-116等肿瘤细胞有较好的侵袭活性,同时与抗肿瘤蛋白Azurin一起作用B16细胞,抗肿瘤效果显著增强,为进一步运用以大肠杆菌E.coli Nissle1917作为DNA疫苗或者基因治疗的载体开辟了新的技术途径.     

利用转座子构建水稻基因破坏系

农林水产省农业生物资源研究所分子育种部广近洋彦等小组利用转座子首次在世界上构建了水稻基因破坏系。用动物、微生物确立了同源重组的基因破坏法。植物的基因定靶法尚无确认系。美国ＰｉｏｎｅｅｒＨｉ—ＢｒｅｄＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ公司去年底利用转座子成功地开发出玉米基因破坏法。用水稻、玉米２种谷物确立了基因破坏法,在此基础上,希望能进行机能分析以加快育种工作。２月２６日在东京召开的科学技术振兴调整费的成果报告会上发表了这项成果。广近等的方法是在传统的组织培养变异法上再使用ＰＣＲ的筛选法。检测在水稻组织…     

"睡美人"转座子系统研究进展

转座子在脊椎动物中的应用远落后于在其他生物系统中的应用。“睡美人”转座子(sleeping beauty transposon)是Tc1/mariner转座因子超家族中的一员,是存在于鲑鱼基因组中的1个已经失活的转座子。1997年,Ivics等将这个转座子进行重建并恢复了它的活性。短短几年内的有关研究表明,“睡美人”转座子是目前在脊椎动物中转座活性最高的转座子。结合该转座子系统逐步显示出的广阔应用前景,本文重点论述了其结构、转座机制及应用,并提出了应用“睡美人”转座子系统须注意的问题。     

红色草金鱼对不同颜色背景的选择偏好

鱼类对环境颜色的偏好受到很多研究者关注, 但鱼类是否能够辨别颜色并对不同颜色有不同反应,一直处于争议之中.本研究通过记录和比较红色草金鱼Carassius auratus对不同彩色(红色、橙色、黄色、绿色、青色、蓝色、紫色)背景和白色背景的时间选择差异, 研究了红色草金鱼对不同颜色背景的选择.结果显示, 红色草金鱼对白色背景和彩色背景的时间选择没有显著差异, 对各单色背景的时间选择也没有显著差异, 这表明红色草金鱼对不同背景颜色没有明显的选择偏好.该结果对了解鱼类对颜色的选择偏好和指导红色草金鱼饲养时水族箱及其布景颜色设计有一定理论和实践意义.