抗菌肽在大肠杆菌中的融合表达

抗菌肽作为新一代抗生素的潜在应用价值使其备受关注,大量高纯度的抗菌肽是开展基础及临床实验的关键。天然来源的抗菌肽资源有限、纯化困难,化学合成抗菌肽成本高、活性不稳定,因此通过基因重组表达得到大量抗菌肽是低成本、高效益的方法。目前采用大肠杆菌表达系统获得抗菌肽已成为研究者的首选,通常以形成融合蛋白的方式表达,这不仅可避免抗菌肽对宿主的杀伤作用,也保护了抗菌肽免受蛋白酶降解。文章结合课题组的研究工作,综述了近年来抗菌肽在大肠杆菌中表达的融合载体、融合蛋白的裂解方法及表达条件优化的研究进展。     

肽类抗生素生物合成基因簇在Escherichia coli中的异源表达

微生物能够产生众多结构和生物活性多样的次生代谢产物,而其生物合成基因簇的挖掘和异源表达是药物创新和产量提高的必要前提. 在过去20年里,大量重要天然产物的生物合成基因簇在微生物中被不断的发现. 在这些被挖掘的基因簇中,肽类抗生素的生物合成基因簇占了很大比重.肽类抗生素因具有抗菌、抗肿瘤、抗病毒等多种生物学活性而备受化学家和药物学家的重视. 如能了解它们的生物合成机制,实现其基因簇的异源表达,将使合理化遗传修饰生物合成通路获取结构类似物（药物开发）和提高产量成为可能. 大肠杆菌作为最广泛、最成功的表达体系,常用来表达外源基因,但一般只能表达一个或几个基因,却很少有用它来表达整个生物合成基因簇. 2001年,Khosla和Cane在E.coli中成功异源表达了一个复杂聚酮天然产物（红霉素苷原6dEB）基因簇. 这是首个有关在E.coli中异源表达天然产物生物合成基因簇的研究. 至此之后,大肠杆菌开始作为生物合成基因簇的异源表达宿主,越来越受到相关领域的重视. 紧接着核糖体肽和非核糖体肽生物合成基因簇也相继在大肠杆菌中成功异源表达. 本文对肽类抗生素生物合成基因簇在E.coli中的异源表达进行了综述.     

乳酸菌食品级表达载体的研究与应用

乳酸菌是能够发酵糖类产生大量有机酸的革兰氏阳性菌的通称,在发酵食品中有着悠久的应用历史。乳酸菌通常被认为是安全菌株,这些微生物的基因工程操作在食品、医学等方面具有广阔的应用前景。表达载体是基因工程中常用的工具之一,大多数乳酸菌的表达载体通常以抗生素抗性基因作为选择标记,然而抗性基因具有潜在的转移性,因此需要开发食品级表达载体。食品级表达载体不含有抗生素的抗性基因,仅包含来自同源宿主或通常被认为是安全生物的DNA。本文介绍了乳酸菌食品级表达载体的构成及其常用宿主,同时对乳酸菌食品级表达载体的应用进行了归纳总结。     

重组蛋白质在大肠杆菌体系中的可溶性表达策略

大肠杆菌表达体系因其表达量高、周期短、成本低等诸多优势特征而被广泛用作重组异源蛋白质的表达宿主。据统计超过30%的重组蛋白质药物和50%重组蛋白质的制备是使用大肠杆菌作为表达宿主。蛋白质错误折叠或未折叠以及包涵体形成是大肠杆菌表达体系更广泛应用的主要阻碍。因此,重组蛋白质在大肠杆菌体系中可溶性表达策略探索意义重大。综述了重组蛋白质在大肠杆菌表达系统中不可溶性表达的原因、机制以及影响大肠杆菌表达系统重组蛋白质可溶性的一些关键因素,并基于外源蛋白质在大肠杆菌中表达的各个步骤,总结了目前促进蛋白质在大肠杆菌表达系统中高效、可溶性表达的策略,为进一步拓展大肠杆菌表达体系在重组异源蛋白质可溶性表达中的应用提供参考。     

抗菌肽的基因工程研究进展

近年来细菌耐药性问题日趋严峻,寻找新型抗生素已迫在眉睫。抗菌肽是生物体产生的一种阳离子短肽,具有天然的抗菌活性。由于抗菌肽具有与传统抗生素不同的作用机制,不产生耐药性,因而具有重要的临床应用价值。但实践表明,抗菌肽的开发并非易事。针对近年来抗菌肽开发的基因工程策略和实践,尤其是大肠杆菌表达系统和酵母表达系统,进行了简要综述。     

结核分枝杆菌膜蛋白的异源表达与纯化研究进展

膜蛋白是一类与生物膜相互作用、具有重要功能和独特结构的蛋白质。异源表达纯化一直是了解膜蛋白结构和功能的重要瓶颈。结核分枝杆菌作为典型的胞内致病菌,其膜蛋白的研究具有很好的代表性以及重要意义。目前用于表达膜蛋白的有大肠杆菌、酵母、哺乳动物细胞等表达系统,但结核菌膜蛋白的表达宿主还往往局限于大肠杆菌。异源表达需要综合考虑蛋白的来源、疏水性、跨膜区等特性。低温、加入共表达因子以及改变培养条件有助于结核菌膜蛋白的可溶性表达。另外,包涵体复性也是获得结核菌目的膜蛋白的重要途径。随着新的表达系统,新的促可溶表达策略,新的包涵体复性手段,新的纯化方法的应用,将有更多的膜蛋白异源表达纯化成功,为蛋白质功能研究奠定基础。     

棘胸蛙抗菌肽Spinosan-C的串联表达与活性检测

为克服抗菌肽易被蛋白酶降解及对宿主大肠杆菌的杀伤作用,并进一步提高大肠杆菌系统的表达能力,以棘胸蛙Paa spinosa抗菌肽Spinosan-C为研究对象,按照大肠杆菌密码子利用频率进行密码子优化,设计合成8拷贝的串联8×Spinosan-C基因,将合成的串联基因克隆到大肠杆菌表达载体p ET-28a,利用大肠杆菌感受态细胞Rosetta进行原核表达,获得高效表达的串联8×Spinosan-C重组蛋白,用甲酸专一性切割得到抗菌肽Spinosan-C单体。体外抑菌试验表明,切割后的抗菌肽Spinosan-C单体对测试菌生长具有抑制作用,为蛙类抗菌肽的规模化制备提供了参考。     

大肠杆菌中生物药物的生产现状及展望

大肠杆菌是表达药用异源蛋白的首选微生物,此宿主目前已生产约30%被批准的药用蛋白。大肠杆菌具有生长迅速、产率高、效益大及易扩大培养的优势,促使它成为生物技术行业中蛋白大规模生产常选择的表达宿主。但大肠杆菌中密码子偏好性的存在及糖基化、磷酸化和蛋白水解加工等翻译后修饰的缺乏会限制其生产较复杂的重组生物药物。综述了大肠杆菌表达系统中几项满足生物技术产业需求的相关创新技术,介绍如何利用相关技术进步使大肠杆菌糖基化异源蛋白和表达包括全长糖基化抗体在内的复杂蛋白的过程,并对存在的问题及其研究前景进行展望,旨在为帮助大肠杆菌顺利生产更复杂的药用糖基化蛋白。     

乳酸乳球菌食品级表达载体的研究进展

乳酸乳球菌（L.lactis）是乳球菌属中最重要和最典型的一个种,在食品工业中应用广泛,被公认为安全的（generally regards as safe,GRAS）食品级微生物。以乳酸乳球菌作为宿主菌,构建表达载体用来表达异源蛋白和酶,逐渐成为食品工业、生物制药和疫苗研究的热点。近年来,乳酸乳球菌的分子微生物学研究取得了重大进展,这为表达载体的构建奠定了基础,一些具有不同用途的乳酸乳球菌基因表达载体已经构建,用来表达抗原蛋白、细胞因子和生物酶等。其中,以来源于食品级微生物的DNA片段构建的食品级表达载体引起人们的关注。     

乳酸菌食品级nisin控制的基因表达系统NICE

乳酸菌安全应用于人们的生产和生活已有上千年的历史,是一种食品级的微生物。在过去二十年里,其生理及遗传学特性已被彻底研究。由于其遗传可行且操作简单,乳酸菌除了其传统应用外已被广泛用于表达异源基因,在食品、农业及医药工程领域具有重要的应用前景。人们已开发了一系列乳酸菌食品级基因表达系统。本文主要介绍了乳酸菌,重点是其模式菌Lactococcus lactis最常见的食品级诱导表达系统--nisin控制的基因表达系统NIC E及其食品级诱导物nisin、食品级的宿主及表达载体系统,以及NICE系统在表达异源基因方面的应用。     

大肠杆菌异源合成三萜化合物研究进展和前景分析

三萜化合物具有可观的药用价值和经济价值,但是目前的生产过程复杂、产量低,利用微生物异源合成三萜化合物已成为当前研究趋势,大肠杆菌作为常用萜类合成底盘细胞具有异源合成三萜化合物及其前体的天然优势和研究前景。对三萜化合物微生物异源合成研究进展进行了综述,从三萜化合物合成代谢途径、关键酶的特点及大肠杆菌三萜表达模块和底盘细胞适配三个方面对该途径进行了阐述和分析,针对实现大肠杆菌高效合成三萜类化合物所需要解决的基础问题进行讨论,为扩展大肠杆菌作为三萜化合物合成底盘细胞提供建议和前景分析。     

米曲霉异源蛋白表达系统研究进展及展望

米曲霉作为一种重要的工业微生物,在异源蛋白表达方面已有广泛应用,受限于被表达蛋白的修饰及分泌过程,目前实际生产使用的基因供体主要局限于其他真菌,尤其是丝状真菌。当外源基因来源于植物、昆虫和哺乳动物时,米曲霉所生产的异源蛋白产量及生物活性往往不尽如人意。本文综述了米曲霉作为宿主表达异源蛋白的研究进展,包括其现有的遗传操作手段及异源表达方面的应用及探索,重点介绍了应用过程中面临的挑战和解决策略,另外,对米曲霉表达异源蛋白的应用前景及发展方向进行了展望。     

人细胞色素P450在大肠杆菌中的功能表达

研究人细胞色素P450（P450,CYP）在大肠杆菌中的功能表达对新药研发,临床药物治疗和药物早期ADME/T性质研究均有重要意义。异源表达人P450使用最多的宿主是大肠杆菌E.coli,然而要获得足量的有催化活性的P450仍是一个难题。结合作者近年研究,对异源表达的研究意义,P450在E.coli中功能表达的策略,高效表达的影响因素和共表达等方面做一评述,指出今后的研究应用方向。     

抗菌肽-X基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

用PCR技术获得抗菌肽—X基因、TNFα基因,与温度诱导的表达载体pRC连接成为重组表达载体,导入大肠杆菌TG1,通过温度诱导表达重组蛋白。将重组质粒转入不同的表达菌中进行表达,经SDS—PAGE选出E.coil BL21(DE3)为最佳表达的宿主菌。培养后,离心得菌体,经超声破碎离心得包涵体,溶解后用CNBr切割并透析,最后经CM52纤维素柱分离纯化得到有活性高纯度的抗菌肽—X。     

外源基因在大肠杆菌中表达研究进展

近年来,基因工程技术的迅速发展,大量有价值的蛋白质大肠杆菌中获得了高表达。多种表达系统的完善与发展,及蛋白质分离纯化技术的提高,异源蛋白的产量与纯度已不再是困扰人们的主要问题,人们开始更多地关注异源蛋白的活性,比活性及异源蛋白的正确性,完整性。随着这些问题的解决,重组蛋白的应用才能真正走向成熟。     

提高蛋白质在米曲霉中表达量的策略

米曲霉是一种重要的微生物,在食品、酿造、商业酶和医用蛋白的生产中具有广泛的应用,该菌被美国食品与药品管理局(FDA)认定为GRAS(generally regarded as safe)级。讨论了提高同源和异源蛋白在米曲霉中表达量的几种策略,包括使用强启动子、多拷贝编码基因、优化培养基和超表达血红素结构域(HBD)等。异源蛋白容易被米曲霉蛋白酶降解,表达量往往较低,因此使用蛋白酶缺陷型宿主菌是非常必要的。另外将外源蛋白与米曲霉高分泌蛋白融合表达也是提高异源蛋白产量的有效途径。     

丝状真菌异源蛋白表达系统研究进展

丝状真菌,俗称霉菌,在食品工业中被用于生产多种生物酶和有机酸。近年来,人们发现丝状真菌具有分泌量大、表达的蛋白有天然活性等特点,非常适合作为同源和异源重组蛋白的表达宿主,因此被广泛研究和探讨。简要综述了以黑曲霉为代表的几种常被用作蛋白表达宿主的丝状真菌的特点、应用中的主要问题和基本解决方案,以及近年关于丝状真菌表达系统的最佳培养条件和发酵条件的研究进展。     

抗菌肽及其重组表达系统研究进展

抗菌肽作为一类具有多种生物学功能的小肽,具有分子量小、不含外源成分、不易产生耐药性等特性,成为近年来的研究热点。该文综述了抗菌肽的种类、作用机制及其重组表达系统等方面的研究进展,并对存在的热点问题进行了探讨。     

改善大肠杆菌胞内氨基酰tRNA池提高外源基因表达水平

大肠杆菌是研究和高效表达异源蛋白的常用宿主细胞。由于大肠杆菌和真核生物及大部分古细菌在同义密码子上的使用有很大的差异,来源于真核或古细菌的外源基因在大肠杆菌中表达时,常常由于其带有稀有密码子而带来翻译方面的问题,如产生移码突变和表达量下降等,从而改变异源蛋白的表达质量和表达水平。在研究常见嗜热菌tRNA结构和组成的基础上,以古细菌α淀粉酶基因为例,采用增加有argU、ileY和leuWtRNA基因的大肠杆菌DE3为表达宿主,改善了胞内氨基酰tRNA池的大肠杆菌表达异源蛋白,表达量提高约9倍。     

Red/ET同源重组技术及其在微生物基因组挖掘中的应用进展

Red/ET同源重组技术(Red/ET recombineering)是由来源于大肠杆菌λ噬菌体的蛋白对Redα/Redβ或来源于Rac原噬菌体的蛋白对Rec E/Rec T所介导的基于短同源臂(40–50 bp)的同源重组技术,能对宿主DNA序列进行快速、高效、精确的修饰和操作。本文主要综述了2010年以来Red/ET同源重组技术在大肠杆菌及其他细菌中的研究进展,同时简要介绍了该技术在微生物基因组挖掘,尤其是在微生物基因簇的异源表达领域的应用进展。